Summary
Метод пилинга-пятнистости представляет собой метод крио-ЭМ-подготовки сетки, который позволяет разделять многослойные и концентрированные биологические образцы на отдельные слои для уменьшения толщины, увеличения концентрации образца и облегчения обработки изображений.
Abstract
Метод подготовки крио-ЭМ-сетки с пилингом представляет собой значительно модифицированный метод обратной инъекции с целью достижения уменьшения слоев многослойных образцов. Это удаление слоев перед погружением замораживания может помочь уменьшить толщину образца до уровня, подходящего для сбора крио-ЭМ данных, улучшить плоскостность образца и облегчить обработку изображений. Метод пилинга-блоттинга позволяет разделить многоламеллярные мембраны на отдельные слои, слоистые 2D-кристаллы на отдельные кристаллы и уложенные листообразные структуры растворимых белков также быть разделенными на отдельные слои. Высокая толщина образцов этих типов образцов часто создает непреодолимые проблемы для сбора крио-ЭМ данных и крио-ЭМ обработки изображений, особенно когда ступень микроскопа должна быть наклонена для сбора данных. Кроме того, сетки с высокими концентрациями любого из этих образцов могут быть подготовлены для эффективного сбора данных, поскольку концентрация образца до подготовки сетки может быть увеличена, а метод шелушения-пятна скорректирован таким образом, чтобы привести к плотному распределению однослойного образца.
Introduction
Метод пилинга-блоттинга был разработан для того, чтобы разделить сложенные двумерные кристаллы мембранных белков на отдельные слои для получения достаточно тонких образцов для сбора крио-ЭМ 2D и 3D данных и облегчения обработки изображений1. Протокол также подходит для других типов многоламерных образцов, а также для достижения высоких концентраций образцов любого типа образца на сетке без увеличения толщины в Z.
Уменьшение слоев образца до одного слоя достигается путем применения комбинации капиллярного давления и сил сдвига в протоколе, который существенно расширяет и модифицирует метод обратной инъекции2. Первая стадия промокшивания приводит к плотному сэндвичингу и сцеплению с углеродной пленкой и сетчатой полосой по обе стороны многослойного образца во время промокания на субмикроне, а не к размеру пор фильтровальной бумаги 20-25 мкм в методе обратного впрыска. Разделение или отслаивание отдельного слоя происходит при принудительном разделении зажатых слоев после того, как сетка прижимается вертикально к трегалозной капле, выталкивая углеродную пленку от стержня сетки (рисунок 1). Перемещение углеродной пленки в сторону от исходной точки контакта с стержнем сетки происходит на следующем этапе, когда сетка снова смачивается на субмикронной фильтровальной бумаге. Количество итераций этих шагов может быть оптимизировано для конкретных образцов. Кроме того, протокол может быть использован для увеличения концентраций образцов, избегая при этом агрегации в Z. Из-за зависимости от сцепления с сетчатого стержня и углеродной пленки, а также принудительного разделения, этот подход может не подходить для очень хрупких молекул, таких как определенные деликатные и/или нестабильные белки и белковые комплексы.
Техника пилинга не требует ни специализированного оборудования, ни дорогостоящих расходных материалов. Однако применимость к конкретным образцам потребует тщательного рассмотрения биологических параметров. Решение проще для 2D-кристаллов, поскольку для обеспечения плоскостности требуется углеродная пленка, но манипуляции с помощью метода пилинга могут повлиять на биологическую целостность образца или кристаллический порядок. Пригодность метода пилинга-блоттинга к одиночным частицам ограничена и может быть проверена на те, которые требуют углеродной пленки и устойчивы к манипуляциям. Образцы с критическими биологическими взаимодействиями между слоями могут не подходить для характеристики с помощью метода пилинга-блоттинга из-за нарушения таких взаимодействий.
Метод пилинга-блоттинга («пилинг-блотт») наиболее быстро оптимизируется путем тестирования и скрининга с отрицательным пятном или неокрашенными образцами ТЭМ при комнатной температуре. После того, как оптимальное количество итераций шелушения-пятна было определено, можно определить время для контроля толщины до витрификации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Этапы подготовки к технике пилинг-блоттинг
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка требует размещения следующих предметов рядом друг с другом.
- Сложите два куска фильтровальной бумаги размером 20-25 мкм (см. Таблицу материалов).
- Поместите парафиновую пленку длиной ~8 см х 10 см рядом с фильтровальной бумагой вверх.
- Поместите кусочек субмикронной фильтровальной бумаги поверх двух дополнительных кусочков фильтровальной бумаги No4 (рисунок 1-1).
- Расположите антикапиллярные щипцы с согнутой ногой вверх и прямой ногой вниз. Затем выберите сетку из 600 сеток гладкой/блестящей стороной вверх. Поместите щипцы на чашку Петри или другую приподнятую поверхность, чтобы избежать контакта чистой сетки с другими предметами.
- Снимите бумагу с парафиновой пленки и потяните бока (~5 мм), чтобы создать небольшой ободок. Пипетки две 150 мкл капли 4% раствора трегалозы ~1-2 см с одной короткой стороны парафиновой пленки и ~1 см друг от друга на парафиновой пленке.
- На отдельной скамейке или на полу насыпьте жидкий азот в небольшой контейнер для пенополистирола (см. Таблицу материалов).
ВНИМАНИЕ: Пройдите обучение правильному обращению с использованием перчаток и лицевого щитка, чтобы избежать обморожения. - Поместите небольшой контейнер с крио-ЭМ сеткой в жидкий азот и накройте контейнер из пенополистирола безворсовыми салфетками.
2. Размещение углеродной пленки на сетке
- Используйте щипцы Дюмона No 5 (см. Таблицу материалов), чтобы всплыть из углеродной пленки из слюды, коснувшись одной стороны слюды под небольшим углом вниз (~ 20 °-40°) на одной из капель раствора трегалозы и медленно позвольте натяжению воды снять углеродную пленку, переместив слюду вниз. Выпустите слюду, как только углеродная пленка всплывет на поверхности капли.
- Визуально осмотрите углеродную пленку, чтобы избежать использования углерода с повреждениями в виде трещин.
- Вставьте сетку, удерживаемую антикапиллярными щипцами под углом (~20°-30°), в трегалозную каплю в положении, прилегающем к углеродной пленке, а затем центрируйте под ней. Подберите углеродную пленку (рисунок 1-2).
- Держите сетку в той же ориентации и медленно опустите ее на поверхность второй капли трегалозы, не нарушая поверхностного натяжения капли, чтобы удалить ненужную углеродную пленку, которая, возможно, обернулась вокруг края сетки в шероховатую сторону.
3. Разделение многослойных 2D кристаллов на однослойные
- Поверните антикапиллярные щипцы (см. Таблицу материалов) и поместите их на чашку Петри углеродной стороной сетки лицом вниз (рисунок 1-3).
- Пипетка 1,3 мкл образца в легкий трегалозный мениск поверх сетки. Пипетку раствором ~8-10 раз перемешать и распределить трегалозу и образец по обеим сторонам сетки.
- При инкубации раствора в течение 1 мин пипетку одной или более капель 1,7 мкл раствора трегалозы на парафиновую пленку.
- Поверните сетку обратно в исходное положение, повернув углеродную пленку вверх.
- Используйте антикапиллярные щипцы, чтобы надавить сеткой на субмикронную фильтровальную бумагу (рисунок 1-4). После того, как раствор был поглощен фильтровальной бумагой и углеродная пленка лежит ровно, подождите 3 секунды, прежде чем поднимать сетку и перемещать ее вертикально на каплю раствора трегалозы объемом 1,7 мкл (рисунок 1-5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите этот шаг несколько раз для образцов с высокой степенью штабелирования, или сетка будет подготовлена для витрификации на следующих этапах. - Промокните сетку на двух листах фильтровальной бумаги, а затем снимите сетку с фильтровальной бумаги (рисунок 1-6). Примерно через 13 с, в зависимости от влажности и буфера образца, погрузите сетку в жидкий азот в небольшой контейнер из пенополистирола и поместите сетку в контейнер для крио-ЭМ-сетки или передайте ее непосредственно для крио-ЭМ скрининга или сбора данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы быстро оптимизировать протокол, отрицательно окрашивайте пятнистую сетку на этом этапе, а не погружайте ее в жидкий азот. Отрицательно окрашивают образец, нанося на сетку 3 мкл 1% уранилацетата, инкубируют сетку в течение 30 с и промокают ее оторванным куском фильтровальной бумаги размером 20-25 мкм. Сетки из 2D-кристаллов, остеклованных в трегалозе, танине или глюкозе, обычно погружаются вручную для витрификации, поскольку трегалоза, танин и глюкоза предотвращают образование кристаллического льда со скоростью, используемой для ручного погружения2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешный эксперимент с шелушением приведет к созданию отдельных слоев образцов в часто высоких концентрациях. Следует ожидать, что некоторые области в большинстве квадратов сетки по-прежнему будут содержать несколько слоев, особенно при меньшем количестве итераций шагов отслаивания. Большинство квадратов сетки, однако, будут содержать обширные области одиночных слоев, как это наблюдается для 2D-кристаллов человеческой лейкотриен-С4-синтазы (рисунок 2) и липосом (добавленных на этапе 3.2, рисунок 3). Дополнительные этапы отслаивания, возможно, потребуется протестировать для образцов, которые не показывают желаемого уменьшения слоев.
Наиболее важным показателем успешного эксперимента с пилингом будет качество данных и биологическая целостность, наблюдаемые после сбора крио-ЭМ данных высокого разрешения и обработки изображений. Интерпретация данных должна включать тщательное рассмотрение потенциального повреждения или искажения в областях контакта между слоями.
Области ЭМ-сетки, в которых произошло промокание кожуры, обычно показывают более высокую концентрацию образца, чем области, в которых оно не происходило. Этот кажущийся концентрирующий эффект вызван прилипанием многоламеллярного образца как к углеродной пленке, так и к поверхностям стержня сетки, за которым следует дополнительное прилипание к обеим поверхностям во время подготовки к отслаиванию, поскольку они многократно разделяются, слегка перемещаются и снова вступают в контакт. В результате различные слои исходного многоламеллярного образца распределяются по большей боковой площади (рисунок 3 и рисунок 4). Эти области могут даже содержать более крупные 2D-кристаллы или мембраны. Оба явления легко наблюдаются и сравниваются в областях, где «зона пилинга» примыкает к области, не затронутой стадией шелушения(рисунок 3). Изображения на рисунках 2-4 собирали в условиях низкой дозы при ускоряющем напряжении 120 кВ с помощью просвечивающего электронного микроскопа (см. Таблицу материалов).
Рисунок 1: Схематическое изображение техники пилинга-блоттинга. Первые две стадии (1-2 и 1-3) и последняя стадия (1-6) техники пилинга-блоттинга основаны на методе обратной инъекции2, а промежуточные этапы следуют протоколу пилинга-блоттинга (модифицированному из Johnson et al.1). На этапе 1 (А) укладывают два куска фильтровальной бумаги размером 20-25 мкм, (В) примыкают к куску парафиновой пленки двумя каплями раствора трегалозы и (В) куском субмикронной фильтровальной бумаги на двух дополнительных листах фильтровальной бумаги. На стадии 2 (А) углеродную пленку снимают на первой капле трегалозы и (В) подхватывают антикапиллярными щипцами, после чего прикосняют к поверхности второй капли (не показаны) без нарушения поверхностного натяжения для удаления избыточной углеродной пленки с периферии. На этапе 3 (А) щипцы, удерживающие сетку, поворачиваются на 180° (сторона решетки из углеродной пленки теперь обращена вниз) и (В) образец пипетируется в мениск трегалозы. На этапе 4 сетка была повернута обратно к исходной ориентации с углеродной пленкой, обращенной вверх, и образец медленно опускается на субмикронную фильтровальную бумагу. Сетку поднимают вверх и на шаге 5 опускают вертикально на каплю раствора трегалозы объемом 1,7 мкл. Шаги 4 и 5 называются «шелушением-блоттингом» и могут быть итерированы три или более раз, в зависимости от объема укладки. Количество итераций может потребоваться оптимизировать для различных образцов. На этапе 6 (А) образец смачивают на двух слоях фильтровальной бумаги размером пор 20-25 мкм, прежде чем (В) его вручную погружают в жидкий азот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Образец кристалла 2 D, подвергнутый методу пилинга-блоттинга. Область слева от стрелки была в значительной степени уменьшена до однослойных 2D-кристаллов в области контакта между углеродной пленкой и полосой сетки, которая была отслаивалась, а затем смещалась, в то время как область справа от стрелки не находилась в области, затронутой отслаивающимся пятном. Очищенные от кожуры области могут быть легко выбраны и наблюдаются на большей части сетки. Показанные 2D-кристаллы представляют собой сложенные и однослойные 2D-кристаллы лейкотриен-С4-синтазы человека. Шкала соответствует 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Липосомы, подвергшиеся пилингу-пятну. Шелушение-пятно может быть успешно применено, чтобы прервать края свернутых липосом и везикул, чтобы получить области с большими, в основном однослойными фосфолипидными бислоями, как это наблюдается в нижней половине изображения. Верхняя половина не находилась в зоне контакта между стержнем сетки и углеродной пленкой и, таким образом, содержит полные липосомы с двумя фосфолипидными бислоями. Шкала соответствует 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: След отслаивания. Квадрат сетки сетки из 400 ячеек показывает след (помеченный буквой «B») панели сетки и результирующие области с отслаиванием, а также области (помеченные «C»), которые не контактировали с панелью сетки или подвергались меньшему количеству итераций шелушения. Шкала соответствует 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Промокание ЭМ-сетки, приготовленной путем обратного впрыска на субмикронную фильтровальную бумагу, с использованием слишком тонкой углеродной пленки. Изображения представляют собой одиночные кадры из видео (см. Видео 1), снятые при (A) первоначальном контакте с мембраной, (B) 1000 мс после контакта и (C) 2000 мс после контакта. Стрелка указывает квадраты сетки, в которых капиллярное давление разорвало углеродную пленку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Сетка помещается на субмикронную фильтровальную бумагу для стадии отслаивания-пятнистости. Углеродная пленка медленно и плотно всасывается на сетку в направлении от левого нижнего к верхнему правому краю, что плотно сэндвичирует образец между стержнем сетки и углеродной пленкой. Углеродная пленка и, следовательно, отдельные слои образца смещаются на каждом последующем этапе отслаивания,что позволяет оптимизировать с дополнительными итерациями для более многослойных образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Пил-блоттинг является мощным методом преодоления укладки и толщины многослойных 2D-кристаллов и аналогичных образцов для сбора крио-ЭМ данных и обработки изображений. Решение об использовании пилинга будет основываться на биологических параметрах образца, а также потребует оценки после того, как будет доступна 3D-крио-ЭМ-модель. Биологическая важность контактов и потенциальная гибкость регионов контактов будут особенно важны в этой оценке.
Количество отслаивающихся пятен первоначально будет установлено путем наблюдения после стандартной подготовки отрицательной пятнистой сетки, где чрезмерные слои или толщина потребуют альтернативных стратегий стандартной крио-ЭМ-сетки. Тонкие многослойные кристаллы, которые укладываются в регистр, могут быть непосредственно использованы для microED3 или FIB-фрезерованных в случае более толстых кристаллов4. Шелушение обычно не требуется для двухслойных 2D-кристаллов, так как слои могут быть обработаны по отдельности или вместе, когда слои находятся в регистре5. Это потенциально может быть полезно для воздействия на обе стороны мембранных белковых 2D-кристаллов лигандов или ингибиторов, хотя один раз в растворе перед шелушением-блоттингом и один раз после заключительного этапа пилинга-блоттинга. Кроме того, восстановление больших, хорошо упорядоченных двухслойных 2D-кристаллов может обеспечить дифракцию электронов 6,7. Многослойные, как индуцированные, так и биологически встречающиеся, 2D-кристаллов мембраны и растворимых белков будут наиболее вероятными мишенями для пилинга,хотя протокол может быть применен к ряду образцов и служить для концентрирования различных образцов для крио-ЭМ (рисунок 4).
Первоначальное тестирование с отрицательным пятном значительно сократит время и затраты на оптимизацию образцов, так как замораживание, подготовка держателей образцов крио-ЭМ, перевод на крио-ЭМ и использование крио-ЭМ не требуются. Только время высыхания перед этапом замораживания должно быть оптимизировано отдельно. Время высыхания будет идентичным или очень похожим на время, используемое для сушки стандартной сетки обратного впрыска того же образца1.
В то время как 600-сетчатые сетки обычно приводят к хорошему сохранению углеродной пленки, увеличение количества итераций отслаивания и более тонких слоев углеродной пленки может привести к увеличению разрушения углеродной пленки (рисунок 5). Сложенные 2D-кристаллы, липосомы и слоистые образцы больших массивов растворимых белков могут быть успешно разделены (рисунки 2-4).
Образец тщательно оценивается крио-ЭМ, чтобы избежать неблагоприятного воздействия на качество образца. Это может быть достигнуто путем обработки изображений для сравнения изображений сложенных и несклеенных кристаллов. Как для целей оценки, так и для достижения цели 3D-модели обработка изображений проводится с помощью программ 2dx, доступных в Focus 8,9, которые также реализуют подходы с одной частицей для устранения несовершенств решетки и гетерогенности белка с возможностью резкого увеличения качества, присущего оригинальным 2D-кристаллам10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.
Acknowledgments
Часть этой работы была поддержана грантом NIH HL090630 (ISK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
