Summary
Peel-blot-tekniken är en kryo-EM-gallerberedningsmetod som möjliggör separation av flerskiktiga och koncentrerade biologiska prover i enstaka lager för att minska tjockleken, öka provkoncentrationen och underlätta bildbehandling.
Abstract
Peel-blot cryo-EM-gallerberedningstekniken är en signifikant modifierad back-injektionsmetod med målet att uppnå en minskning av lager av flerskiktiga prover. Detta avlägsnande av lager före doppfrysning kan hjälpa till att minska provtjockleken till en nivå som är lämplig för kryo-EM-datainsamling, förbättra provets planhet och underlätta bildbehandling. Peel-blot-tekniken gör det möjligt att separera multilamellära membran i enstaka lager, av skiktade 2D-kristaller i enskilda kristaller och av staplade, arkliknande strukturer av lösliga proteiner som också ska separeras i enstaka lager. Den höga provtjockleken hos dessa typer av prover utgör ofta oöverstigliga problem för kryo-EM-datainsamling och kryo-EM-bildbehandling, särskilt när mikroskopsteget måste lutas för datainsamling. Dessutom kan rutnät med höga koncentrationer av något av dessa prover förberedas för effektiv datainsamling eftersom provkoncentrationen före beredning av rutnät kan ökas och peel-blot-tekniken justeras för att resultera i en tät fördelning av enskiktsprov.
Introduction
Peel-blot-tekniken utvecklades för att separera staplade tvådimensionella kristaller av membranproteiner i enkla lager för att erhålla lämpligt tunna prover för kryo-EM 2D- och 3D-datainsamling och underlätta bildbehandling1. Protokollet är på liknande sätt lämpligt för andra typer av multilamellära prover samt för att uppnå höga provkoncentrationer av endera provtypen på gallret utan att öka tjockleken i Z.
Reduktion av provskikt till ett lager uppnås genom att applicera en kombination av kapillärtryck och skjuvkrafter i ett protokoll som väsentligt sträcker sig på och modifierar backinjektionsmetoden2. Ett första blottningssteg resulterar i tät inklämning och fastsättning på kolfilmen och en gallerstång på vardera sidan av det flerskiktade provet under blottning på submikron snarare än 20-25 μm filterpappersporstorlek i backinjektionsmetoden. Separationen, eller skalningen, av ett enskilt skikt sker när man tvingar separationen av de inklämda skikten när gallret pressas vertikalt på en trehalosdroppe, vilket tvingar kolfilmen bort från gallerstången (figur 1). Omplacering av kolfilmen bort från den ursprungliga kontaktpunkten med gallerstången sker i nästa steg, när gallret återigen blottas på submikronfilterpapper. Antalet iterationer av dessa steg kan optimeras för specifika exempel. Dessutom kan protokollet användas för att öka provkoncentrationerna samtidigt som aggregering i Z. På grund av beroendet av vidhäftning till gallerstången och kolfilmen samt kraftfull separation kanske detta tillvägagångssätt inte är lämpligt för mycket ömtåliga molekyler såsom vissa känsliga och / eller instabila proteiner och proteinkomplex.
Peel-blot-tekniken kräver varken specialutrustning eller dyra förnödenheter. Tillämplighet på specifika prover kommer dock att kräva noggranna överväganden av biologiska parametrar. Beslutet är lättare för 2D-kristaller eftersom kolfilm krävs för att säkerställa planhet, men manipulation via peel-blot-tekniken kan påverka provets biologiska integritet eller kristallin ordning. Peel-blot-teknikens lämplighet för enstaka partiklar är begränsad till och kan testas för de som kräver kolfilm och är stabila för manipulation. Prover med kritiska biologiska interaktioner mellan lager kanske inte är lämpliga för karakterisering med hjälp av peel-blot-tekniken på grund av störningen av sådana interaktioner.
Peel-blot-tekniken ("peel-blot") optimeras snabbast genom testning och screening med negativ fläck eller ostoppade prover av TEM vid rumstemperatur. När det optimala antalet peel-blot-iterationer har identifierats kan tiden för att kontrollera tjockleken före förglasning bestämmas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelsesteg för peel-blot-tekniken
OBS: Förberedelse kräver att följande föremål placeras intill varandra.
- Stapla två bitar av filterpapper i porstorlek 20-25 μm (se Materialförteckning).
- Placera en ~ 8 cm x 10 cm lång paraffinfilm intill filterpapperet med papperet uppåt.
- Lägg en bit submikronfilterpapper ovanpå ytterligare två bitar av filterpapper #4 (figur 1-1).
- Placera de antikapillära tångarna med det böjda benet uppåt och det raka benet nedåt. Välj sedan ett rutnät med 600 mesh med den släta / glänsande sidan uppåt. Placera tången på en petriskål eller annan upphöjd yta för att undvika kontakt med det rena gallret med andra föremål.
- Ta bort papperet från paraffinfilmen och dra i sidorna (~ 5 mm) för att skapa en liten kant. Pipettera två 150 μL droppar 4% trehaloslösning ~ 1-2 cm från ena kortsidan av paraffinfilmen och ~ 1 cm från varandra på paraffinfilmen.
- Häll flytande kväve i en liten polystyrenskumbehållare på en separat bänk eller på golvet (se Materialförteckning).
VARNING: Få utbildning för korrekt hantering med handskar och ansiktsskydd för att undvika frostbett. - Placera en liten kryo-EM-gallerbehållare i det flytande kvävet och täck polystyrenskumbehållaren med luddfria våtservetter.
2. Placera kolfilmen på gallret
- Använd Dumont #5 pincett (se materialtabell) för att flyta av kolfilmen från glimmer genom att röra vid ena sidan av glimmern i en liten vinkel nedåt (~ 20 ° -40 °) på en av dropparna trehaloslösning och låt långsamt vattenspänningen lyfta av kolfilmen genom att flytta glimmer nedåt. Släpp glimmer när kolfilmen flyter på droppens yta.
- Inspektera kolfilmen visuellt för att undvika att använda kol med skador i form av frakturer.
- Sätt in gallret som hålls av de antikapillära tångarna i en vinkel (~ 20 ° -30 °) i en trehalosdroppe i en position intill och sedan centrerad under kolfilmen. Plocka upp kolfilmen (figur 1-2).
- Håll gallret i samma riktning och sänk det långsamt på ytan av den andra droppen trehalos utan att bryta droppens ytspänning för att ta bort onödig kolfilm som kan ha lindats runt gallrets kant till den grova sidan.
3. Separering av flerskiktiga 2D-kristaller i enkla lager
- Rotera de antikapillära tångarna (se materialtabell) och placera dem på en petriskål med kolsidan av gallret nedåt (figur 1-3).
- Pipettera 1,3 μL av provet i den lilla trehalosmenisken ovanpå gallret. Pipettera lösningen ~ 8-10 gånger för att blanda och fördela trehalos och prov på båda sidor av gallret.
- Medan du inkuberar lösningen i 1 min, pipettera en eller flera 1,7 μL droppar trehaloslösning på paraffinfilmen.
- Vrid tillbaka gallret till sitt ursprungliga läge med kolfilmen uppåt.
- Använd antikapillärtångarna för att trycka på gallret på submikronfilterpapperet (figur 1-4). När lösningen har absorberats av filterpapperet och kolfilmen ligger platt, vänta i 3 sekunder innan du lyfter gallret och flyttar det vertikalt till 1,7 μl droppe trehaloslösning (figur 1-5).
OBS: Upprepa detta steg flera gånger för mycket staplade prover, eller så förbereds rutnätet för förglasning i nästa steg. - Torka av rutnätet på de två bitarna av filterpapper och lyft sedan gallret från filterpapperet (figur 1-6). Efter cirka 13 s, beroende på fuktighet och provbuffert, kasta gallret i det flytande kvävet i den lilla frigolitbehållaren och placera gallret i kryo-EM-gallerbehållaren eller överför det direkt för kryo-EM-screening eller datainsamling.
OBS: För att snabbt optimera protokollet, färga det skalblottade gallret negativt i detta steg snarare än att kasta det i flytande kväve. Färga provet negativt genom att applicera 3 μl 1% uranylacetat på gallret, inkubera gallret i 30 s och tappa det med en sönderriven bit filterpapper med storleken 20-25 μm porstorlek. Galler av 2D-kristaller förglasade i trehalos, tannin eller glukos kastas rutinmässigt för hand för förglasning eftersom trehalos, tannin och glukos förhindrar bildandet av kristallin is vid hastigheter som används för handkastning2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett framgångsrikt peel-blot-experiment kommer att resultera i enstaka lager av prover i ofta höga koncentrationer. Det kan förväntas att vissa regioner i de flesta rutnätsrutor fortfarande kommer att innehålla flera lager, särskilt vid färre antal iterationer av peel-blot-stegen. Majoriteten av rutnätsrutorna kommer dock att innehålla omfattande regioner med enstaka lager som observerats för 2D-kristaller av humant leukotrien C4-syntas (figur 2) och liposomer (läggs till i steg 3.2, figur 3). Ytterligare peel-blot-steg kan behöva testas för prover som inte visar önskad minskning av lager.
Den viktigaste indikationen på ett framgångsrikt peel-blot-experiment kommer att vara datakvaliteten och den biologiska integriteten som observerats efter högupplöst kryo-EM-datainsamling och bildbehandling. Datatolkning måste inkludera noggrant övervägande av potentiell skada eller snedvridning av kontaktregioner mellan lager.
Regioner i EM-nätet där peel blotting har inträffat uppvisar vanligtvis en högre koncentration av provet än regioner där det inte har inträffat. Denna uppenbara koncentrationseffekt orsakas av att det multilamellära provet fäster vid både kolfilmen och gallerstångens ytor, följt av ytterligare vidhäftning på båda ytorna under peel-blot-beredningen när de upprepade gånger separerar, omplaceras något och återigen får kontakt. Resultatet är att de olika skikten i det ursprungliga multilamellära provet sprids isär över ett större sidoområde (figur 3 och figur 4). Dessa regioner kan till och med innehålla större 2D-kristaller eller membran. Båda fenomenen observeras och jämförs lätt i områden där en "skalzon" ligger intill ett område som inte påverkas av peel-blot-steget (figur 3). Bilderna i figurerna 2-4 samlades in under lågdosförhållanden vid en accelererande spänning på 120 kV med ett transmissionselektronmikroskop (se materialförteckning).
Figur 1: Schematisk representation av peel-blot-tekniken. De två första stegen (1-2 och 1-3) och det sista steget (1-6) i peel-blot-tekniken är baserade på back-injection-metoden 2 och de mellanliggande stegen följer peel-blot-protokollet (modifierat från Johnson et al.1). I steg 1 staplas (A) två bitar av filterpapper med storleken 20–25 μm porer, (B) intill en bit paraffinfilm med två droppar trehaloslösning och (C) en bit submikronfilterpapper på ytterligare två bitar filterpapper. I steg 2 (A) kolfilmen flyter av på den första trehalosdroppen och (B) plockas upp med antikapillärtång, varefter den berörs till ytan av den andra droppen (visas inte) utan att bryta ytspänningen för att avlägsna överskott av kolfilm från periferin. I steg 3 roteras (A) tångarna som håller gallret med 180° (kolfilmssidan av gallret är nu vänd nedåt) och (B) provet pipetteras in i trehalosens menisk. I steg 4 har rutnätet roterats tillbaka till den ursprungliga orienteringen med kolfilmen uppåt och provet sänks långsamt ner på submikronfilterpapperet. Gallret lyfts upp och sänks i steg 5 vertikalt på en 1,7 μL droppe trehaloslösning. Steg 4 och 5 kallas "peel-blotting" och kan itereras tre eller flera gånger, beroende på mängden stapling. Antalet iterationer kan behöva optimeras för olika exempel. I steg 6, (A) avskalas provet på två lager filterpapper med storleken 20-25 μm porstorlek, innan (B) det kastas för hand i flytande kväve. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ett 2D-kristallprov som genomgått peel-blot-metoden. Regionen till vänster om pilen reducerades till stor del till enskiktade 2D-kristaller i ett kontaktområde mellan kolfilmen och gallerstången som skalblottades och sedan förskjutits, medan regionen till höger om pilen inte var i en region som påverkades av skalfläcken. De skalblottade regionerna kan enkelt väljas för och observeras på de flesta av rutnätet. De 2D-kristaller som visas är staplade och enskiktiga 2D-kristaller av humant leukotrien C4-syntas. Skalstrecket motsvarar 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Liposomer som utsätts för skalfläcken. Peel-blotet kan framgångsrikt appliceras för att avbryta kanterna på kollapsade liposomer och vesiklar för att resultera i regioner med stora, mestadels enskiktade fosfolipid-dubbelskikt som observerats i den nedre halvan av bilden. Den övre halvan befann sig inte i en kontaktzon mellan gallerstången och kolfilmen och innehåller således kompletta liposomer med två fosfolipid-dubbelskikt. Skalstrecket motsvarar 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Peel-blot-fotavtrycket. Rutnätskvadraten i ett rutnät med 400 maskor visar fotavtrycket (märkt "B") för rutnätsstången och de resulterande skalblottade regionerna samt de regioner (märkta "C") som inte var i kontakt med en rutnätsstång eller utsattes för färre iterationer av skalfläckar. Skalstrecket motsvarar 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Blottning av ett EM-rutnät som beretts genom bakåtinjektion på ett submikronfilterpapper med kolfilm som är för tunn. Bilder är enstaka bildrutor från en video (se video 1) tagna vid (A) initial kontakt med membranet, (B) 1000 ms efter kontakt och (C) 2000 ms efter kontakt. Pilen indikerar rutnätsrutor där kapillärtrycket har brutit kolfilmen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Rutnätet placeras på submikronfilterpapperet för peel-blot-steget. Kolfilmen sugs långsamt och tätt på gallret i riktning från nedre vänstra till övre högra, vilket tätt klämmer provet mellan gallerstången och kolfilmen. Kolfilmen och därmed enskilda provskikt förskjuts i varje efterföljande peel-blot-steg, vilket möjliggör optimering med ytterligare iterationer för mer skiktade prover. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Peel-blot är en kraftfull metod för att övervinna stapling och tjocklek på flerskiktiga 2D-kristaller och liknande prover för kryo-EM-datainsamling och bildbehandling. Ett beslut om användningen av peel-blotet kommer att baseras på biologiska parametrar i provet och kommer också att kräva bedömning när en 3D-kryo-EM-modell är tillgänglig. Kontakternas biologiska betydelse och kontaktregionernas potentiella flexibilitet kommer att vara särskilt viktiga i denna bedömning.
Antalet skalblottar kommer initialt att fastställas via observation efter standardberedning av negativa fläcknät, där överdrivna lager eller tjocklek kommer att kräva alternativa strategier till standard kryo-EM-nätberedning. Tunna flerskiktskristaller som staplas i register kan användas direkt för microED3 eller FIB-frästa när det gäller tjockare kristaller4. Peel-blotet är vanligtvis inte nödvändigt för dubbelskiktade 2D-kristaller eftersom lager kan bearbetas individuellt eller tillsammans, när skikten är i register5. Det kan potentiellt vara fördelaktigt att exponera båda sidor av membranprotein 2D-kristaller för ligander eller hämmare, en gång i lösning före peel-blotting och en gång efter det sista peel-blotting-steget. Dessutom kan reducering av stora, välordnade dubbelskiktade 2D-kristaller möjliggöra elektrondiffraktion 6,7. Flerskikt, antingen inducerade eller biologiskt förekommande, av 2D-kristaller av membran och lösliga proteiner kommer att vara de mest troliga målen för peel-blot, även om protokollet kan appliceras på en rad prover och tjäna till att koncentrera olika prover för kryo-EM (Figur 4).
Inledande testning med negativ fläck kommer dramatiskt att minska tiden och kostnaden för att optimera proverna som frysning, beredning av kryo-EM-provhållare, överföring till en kryo-EM och användning av en kryo-EM krävs inte. Endast torktiden före frysningssteget behöver optimeras separat. Torktiden kommer att vara identisk med eller mycket lik den tid som används för att torka ett standardnät för återinjektion av samma prov1.
Medan 600-maskiga galler i allmänhet resulterar i god bevarande av kolfilmen, kan ökat antal peel-blot-iterationer och tunnare kolfilmskikt leda till ökad kolfilmbrott (figur 5). Staplade 2D-kristaller, liposomer och skiktade prover av stora matriser av lösliga proteiner kan framgångsrikt separeras (figur 2-4).
Provet utvärderas noggrant av kryo-EM för att säkerställa att negativa effekter på provkvaliteten undviks. Detta kan uppnås genom bildbehandling för att jämföra bilder av staplade och ostaplade kristaller. Både för bedömningsändamål och för att uppnå målet med en 3D-modell utförs bildbehandling via de 2dx-program som finns i Focus8,9, som också implementerar enpartikelmetoder för att ta itu med gitterfel och proteinheterogenitet med möjlighet att dramatiskt öka på den inneboende kvaliteten hos de ursprungliga 2D-kristallerna10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inte konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
En del av detta arbete stöddes av NIH-bidraget HL090630 (ISK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
