Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ערעור היציבות של המניסקוס המדיאלי ושריטה הסחוס מודל מורין של דלקת מפרקים ניוונית מואצת

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64159
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Institute of Biomedical and Environmental Health Research, University of the West of Scotland, 2Institute of Infection, Immunity and Inflammation, University of Glasgow

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שריטות המיקרובלייד המבוקרות על פני השטח של הסחוס המפרקי לאחר ערעור היציבות של ברך העכבר על ידי חיתוך הרצועה המיניסקוטיבית המדיאלית. מודל חייתי זה מציג צורה מואצת של דלקת מפרקים ניוונית (OA) המתאימה לחקר היווצרות אוסטאופיטים, אוסטאוסקלרוזיס וכאבים בשלב מוקדם.

Abstract

דלקת מפרקים ניוונית היא מחלת השלד-שריר השכיחה ביותר בקרב אנשים מעל גיל 45, מה שמוביל לעלות כלכלית וחברתית הולכת וגדלה. מודלים של בעלי חיים משמשים לחיקויים היבטים רבים של המחלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את מודל שריטת היציבות והסחוס (DCS) של דלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית. בהתבסס על התערערות היציבות הנפוצה של מודל המניסקוס המדיאלי (DMM), DCS מציג שלוש שריטות על משטח הסחוס. המאמר הנוכחי מדגיש את השלבים לערעור היציבות של הברך על ידי מעבר הרצועה המניסקוטיביאלית המדיאלית ואחריה שלוש שריטות שטחיות מכוונות על הסחוס המפרקי. שיטות הניתוח האפשריות על ידי נשיאת משקל דינמית, טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת והיסטולוגיה מודגמות גם הן. בעוד שמודל DCS אינו מומלץ למחקרים המתמקדים בהשפעת דלקת מפרקים ניוונית על הסחוס, הוא מאפשר לחקור את התפתחות דלקת מפרקים ניוונית בחלון זמן קצר יותר, עם דגש מיוחד על (1) היווצרות אוסטאופיטים, (2) כאבים אוסטאוארתריטיים ופציעות, ו-(3) השפעת פגיעה בסחוס בכל המפרק.

Introduction

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא המחלה השכיחה ביותר של שלד-שריר בקרב אנשים מעל גיל 45, עם יותר מ-8.75 מיליון פונים לטיפול בבריטניה1. השכיחות הגוברת של המחלה הובילה לעלייה במחיר הכלכלי והחברתי, תורמת רבות למוגבלות ומפחיתה את איכות החיים של החולים1. ללא טיפולים זמינים, יש צורך דחוף להאיץ את המחקר כדי להבין את התפתחות המחלה והתקדמותה. המחלה מורכבת וגם רב גורמית באופיה. המדדים הקליניים העיקריים של המחלה הם כאב ותנועתיות מפרקים2, ו- OA משפיע על כל הרקמות במפרק, לא רק על הסחוס3. אחד האתגרים העיקריים בהבנת OA הוא שזה יכול לקחת שנים, לפעמים עשרות שנים, מהצגה ראשונית / פציעה ועד התקדמות מחלה סימפטומטית עם כאב וחוסר תנועה.

מידול אוסטאוארתריטיס במכרסמים שיפר את הידע שלנו על פתופיזיולוגיה של OA בכך שאיפשר לנו להבין את הייזום וההתקדמות במסגרת זמן קצרה בהרבה ועם בדיקה מפורטת של הרקמות המעורבות. ישנם מודלים רבים של מורין של דלקת מפרקים ניוונית, מבעלי חיים מהונדסים גנטית ועד מודלים של התערבות כירורגית. מודל המורין הנפוץ ביותר של OA פוסט טראומטי הוא ערעור היציבות של המניסקוס המדיאלי (DMM)4,5. אזהרה של המודל היא השונות בין אופרטורים שונים. מנתחים מנוסים יכולים לבצע את ההליך עם נזק מינימלי למפרק, בעוד מפעילים לא מנוסים חושפים את קפסולת המפרק לפרקי זמן ארוכים יותר וגורמים נזק לסחוס. שונות זו בתהליך משפיעה על חומרת המודל, כאשר נזק ראשוני רב יותר מוביל לעלייה בציוני הנזק לסחוס ולהיווצרות אוסטאופיטים. מתוך כוונה לצמצם את השונות בין המפעילים ולחקות נזקי סחוס כתוצאה מהתערבות קלינית, מפותחת גרסה שונה של מודל זה, שבמסגרתה נגרם נזק נוסף מבוקר על פני הסחוס בצורה של שלוש שריטות שטחיות6. זה גם מאפשר למדל את התקדמות OA הנובעת מנזק לסחוס שנגרם על ידי כמה התערבויות קליניות. בהשוואה למודל DMM הסטנדרטי, הפגיעה הישירה בסחוס גורמת להיווצרות אוסטאופיטים בולטים המואצת באופן עקבי, לפגיעה מוגברת בסחוס ולדלקת, ולכאבים פונדקאיים הניתנים למדידה בעכברים זכרים.

מודל זה מתאים במיוחד לחקר OA פוסט-טראומטי בשלב מוקדם, תוך התמקדות בהיווצרות אוסטאופיטים, הצגת כאב (בעכברים זכרים), סינוביטיס ושינויים מוקדמים בפרמטרים של העצם. העקביות של היווצרות אוסטאופיטים במודל זה הופכת את זה לרלוונטי לחקר תיקון עצם ואוסיפיקציה אנדוכונדרלית מכיוון שהיווצרות אוסטאופיטים היא תהליך של תיקון באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית7. המודל גם מחקה נזק הנגרם ישירות לסחוס במהלך התערבויות קליניות, כגון ניתוחים ארתרוסקופיים, ולכן הוא מתאים גם לחקר ההשפעה של פגיעה בסחוס על המפרק כולו.

Protocol

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי פאנל הביקורת האתית של אוניברסיטת גלזגו ואוניברסיטת מערב סקוטלנד, ובוצעו בהתאם להנחיות חוק בעלי החיים (נהלים מדעיים) 1986 (בריטניה). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברים זכרים בני 10 שבועות מדגם C57Bl6/J, במשקל של כ-25 גרם. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת בעלי חיים

הערה: שקול את מין העכבר ביחס למטרת המחקר, שכן מודלים פוסט-טראומטיים של OA מציגים הבדלים חשובים בהתאם למגדר 8,9,10.

  1. ודא כי מגיב ההרדמה (2% isoflurane) מוכן.
    הערה: הרדמה בהזרקה יכולה לשמש גם11. בהתחשב במשך הזמן המהיר של הניתוח, מומלץ להשתמש בהרדמה נדיפה.
  2. השתמש בקבוצה נפרדת המותאמת לגיל המופעלת על-ידי sham כבקרה כירורגית.
    הערה: אין להשתמש בברך הקונטרלטרלית כבקרה כירורגית (ניתוח בושה ברגל הנגדית). זה עשוי להיות בעיות במונחים של רווחת בעלי חיים, וזה צפוי להשפיע על מדידות הליכה והליכה. הברך הנגדית מנרמלת פרמטרים פנימיים של העצם12 ופועלת כהשוואה זוגית במבחני כאב מעוררים13.
  3. השתמש בעכברים בוגרים שלד.
    הערה: רוב הספרות משרה OA בגיל 8-12 שבועות. במחקר הנוכחי, העכברים הם בני 10 שבועות.

2. טיפול טרום ניתוחי (המתבצע על ידי עוזר כירורגי)

  1. אם העכברים מועברים ממתקן אחר, יש לאפשר לעכברים לפחות שבוע אחד לפני ההתערבות הכירורגית להסתגל לסביבתם החדשה.
  2. בצע ניתוח בחדר סטרילי המיועד כראוי, כדי לוודא שכל המשטחים סטריליים (למשל, השתמש בווילונות סטריליים כדי לכסות אזורי ניתוח).
    הערה: הניתוח הוא אספטי.
  3. סדרו והניחו מכשירים סטריליים על וילונות סטריליים.
  4. שקלו את העכבר.
  5. השרה הרדמה על ידי החדרת העכבר לכלוב הרדמה ולאחר מכן החדרת 2% איזופלואורן למשך עד 15 דקות באמצעות מתקן הרדמה סטנדרטי (ראה טבלת חומרים).
    הערה: אסור שלכלוב תהיה הרדמה "שיורית" לפני הצגת העכבר.
  6. לאחר ההרדמה, הוציאו את העכבר מתא ההרדמה וחתכו את הפרווה מעל הברך, הצד הקדמי והצד הצדדי מאמצע השוק ועד אמצע הירך עם קוצצי שיער קטנים.
    הערה: בחירת הברך האחורית תלויה בהעדפת המפעיל באיזה צד יהיה לו קל יותר לבצע את הניתוח. פרוטוקול זה פעל ברגל שמאל.
  7. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין (אינו מגיב לצביטת כף הרגל).
  8. יש לחטא את העור על ידי מריחת תכשיר ניקוי אנטי-בקטריאלי (לדוגמה, המכיל כלורהקסידין או יודופור, ראו טבלת חומרים) על עור חשוף מגולח.
  9. עבור משכך כאבים, לנהל 0.05 מ"ג / ק"ג של buprenorphine תת עורית.
  10. הניחו את העכבר על הצד הגבי, השאירו את הברך לניתוח כלפי מעלה, והניחו את אף העכבר בזרבובית המחוברת למתקן ההרדמה.
  11. כסו את העכבר בווילון סטרילי עם פתח חור מנעול קטן.
  12. מקמו את הרגל לניתוח כאשר הברך מכופפת בטמפרטורה של פחות מ-90 מעלות, כאשר הרצועה הפטלרית פונה כלפי מעלה וכף הרגל משותקת באמצעות סרט ניתוחי.

3. ערעור היציבות של הליך המניסקוס המדיאלי ולאחריו שריטה בסחוס

  1. התאימו את המיקרוסקופ כך שיתמקד ברצועת הפטלר.
  2. צובטים את עור הברך בצד הצדדי עם מלקחיים משוננים (ראו טבלת חומרים), מבצעים חתך קטן במקביל לגיד הפטלרי הדיסטלי באמצעות מספריים כירורגיים, מציגים את המספריים ומרחיבים את החתך לכ-1 ס"מ. הזיזו את העור לצד המדיאלי, תוך חשיפת הרצועה הפטלרית והרמה הטיביאלית הפרוקסימלית (איור 1).
  3. עם להב מספר 11, בצעו חתך לאורך הצד המדיאלי של הרצועה הפטלרית, מהחלק העליון לתחתית הרצועה (איור 1A). כאשר מגיעים לתחתית הרצועה הפטלרית, סובבו את הלהב בזווית של 90° והרחיבו את החתך מהרצועה הפטלרית לכיוון הצד המדיאלי כדי לקבל גישה לקפסולת המפרק.
    הערה: דימום עלול להתרחש בשלב זה או בשלבים הבאים. אם מתרחש דימום השתמש בצמר גפן סטרילי והפעל לחץ מספר שניות (5 עד 30 שניות).
  4. כווץ את הרצועה הפטלרית עם מלקחיים קהים ומסובב את פרק כף היד כדי להזיז את הרצועה הפטלרית לצד הצדדי, מספיק כדי לחשוף את כרית השומן התת-תאית (IFP).
    הערה: כדי למזער את הנזק לרצועה הפטאלית, אין להחזיק את הפינצטה חזק מדי, רק מספיק כדי לשמור על הרצועה בצד.
  5. כשאתם עדיין מחזיקים קלות את הרצועה הפטאלית, צבטו את ה-IFP בפינצטה זעירה (ראו טבלת חומרים) כדי להרים אותה ולהזיז אותה מעט כלפי מעלה. זה מאפשר לדמיין את רצועת המניסקוס המדיאלית.
  6. זהה את הרצועה המניסקוטיביאלית המדיאלית (MMTL) של המניסקוס המדיאלי, המעגנת את קרן הגולגולת של המניסקוס המדיאלי לרמה הטיביאלית הקדמית (איור 1B).
  7. יש להימנע מנזק ומחשיפה ממושכת לסחוס ברמה הטיביאלית או בקונדיל הירך.
  8. יש לנתק בזהירות את ה-MMTL עם מספריים קפיציים קטנים בקוטר 2 מ"מ של Vannas, ולהשאיר את המניסקוס המדיאלי ורצועות אחרות ללא פגע. בשלב זה, ההליך הכירורגי עבור מודל DMM הושלם (איור 1C).
  9. בעזרת סכין מיקרו-כירורגית בקוטר 3 מ"מ, מסמנים שלוש כניסות במרווחים שווים על הסחוס המפרקי הטיביאלי בכיוון מהחלק האחורי לחלק הקדמי.
    הערה: הציונים הם באורך של כ-1 מ"מ ופוגעים רק בפני השטח של הסחוס (איור 2D).
    1. אין להשתמש בכוח מופרז עם הלהב על הסחוס (כלומר, לוודא שהשריטות שטחיות). שלב נוסף זה גורם לפגיעה בסחוס, וגורם למודל DCS.
  10. סגור את העור עם שניים או שלושה תפרים קטנים לסגירת פצעים בקוטר 7 מ"מ או תפרים כירורגיים תת-עוריים נספגים 6-0 (ראו טבלת חומרים).
    הערה: תפרים כירורגיים תת-עוריים טובים יותר מכיוון שהם נמנעים מהתערבות נוספת, אך הם מאריכים את משך הניתוח. תפרים חיצוניים מגבירים את הסיכון לפתיחת פצע על ידי כרסום העכברים.
  11. זהה את הרצועה המניסקוטיביאלית המניסקוביאלית המדיאלית של המניסקוס המדיאלי לניתוח בושה, אך אל תנתק.
  12. עבור עכברים המקבלים רק שריטות סחוס, בצע את שלוש השריטות השטחיות מבלי לקטוע את הרצועות.
    הערה: בין כל עכבר, החליפו כפפות ועקרו מכשירים באמצעות אוטוקלב. זכרו לבדוק שהמכשירים התקררו לפני שימוש חוזר.

4. טיפול לאחר הניתוח

  1. אם התרחש דימום (>50 uL), להזריק 500 μL של מלח סטרילי חם תת עורית (על גב העכבר).
    הערה: מניסיוננו, למרות שלעכברים יש דימומים קלים, זה אף פעם לא יותר מטיפה קטנה, ולכן אין צורך לחדש נוזלים.
  2. לאחר הניתוח, הניחו את העכבר בכלוב התאוששות על רקמת נייר נקייה ואפשרו התאוששות מהרדמה (5-10 דקות).
  3. העבירו את העכברים בהכרה מלאה לכלוב נקי עם מצעים טריים לאחר הניתוח.
  4. ב 72 שעות לאחר התערבות כירורגית, לפקח על כל סימנים של כאב או מצוקה. שימו לב ל:
    1. שינויים במשקל הגוף. למרות שמשקל הגוף עשוי לרדת ביום הראשון והשני, זה בדרך כלל לא יותר מ 5% ממשקל הגוף לפני הניתוח.
    2. חוסר טיפוח כללי או טיפוח יתר סביב החתך.
    3. סימנים של הידרדרות בבריאות הכללית, כגון יציבה מחובקת, כאבי פנים ו/או נשימה לא תקינה.
    4. זיהום פצע כפי שצוין על ידי כל נפיחות, פריקה, או פתיחה של הפצע.
      הערה: זיהום עלול להתרחש אם הפצע הניתוחי נפתח. מכיוון שתיקון פצע כירורגי (למשל, החלפת מהדקי מתכת חסרים או תפירה מחדש) הוא הליך מוסדר, ודא שהתקבל אישור רלוונטי לפני ביצוע התיקונים.
  5. יש להסיר מהדקי מתכת בין 5-7 ימים לאחר הניתוח.
  6. שמור על עכברים בדרך כלל 2-52 שבועות לאחר הניתוח, בהתאם לתכנון המחקר.
  7. העריכו כאב/הליכה בכל שלב במהלך המחקר.
    הערה: המחקר הנוכחי משתמש בנשיאת משקל דינמית כמתואר בשלב 5.1.
  8. להרדים את בעל החיים בשיטה מאושרת, על פי הסכמי הרישוי הארציים, ההנחיות המקומיות ואישור הניסוי.
    הערה: במחקר הנוכחי, בעלי החיים הומתו באמצעות exsanguination (ניקור לב) תחת הרדמה סופנית ואחריו נקע צוואר הרחם14.

5. הערכה של מחלה אוסטאוארתריטית

  1. מדוד נשיאת משקל דינמית כמדידה פונדקאית של כאב בעקבות השלבים הבאים.
    הערה: מכיוון שעכברים הם חיות טרף, הם נוטים להסתיר התנהגויות כאב. זה מקשה על מדידת הכאב. ישנן דרכים רבות למדוד כאב מעורר, כגון פון פריי15 וניתוח הליכה16. המחקר הנוכחי מדד את העומס הדיפרנציאלי בין הרגל האוסטאו-ארתריטית המופעלת לבין רגל הבקרה הלא מופעלת על מזרן לחץ בזמן שהעכבר היה בכלוב (ראו טבלת חומרים, איור 2A).
    1. שקלו את העכבר. יש לטהר ולכייל את משטח הלחץ בהתאם להוראות הספציפיות של היצרן (ראו ציוד דינמי לנשיאת משקל בטבלת החומרים). הציגו את העכבר בכלוב.
    2. הקלט תנועה ולחץ כפות של העכבר בכלוב במשך 5 דקות. נתח נתונים שנרכשו כדי לאמת דקה אחת, בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: הניתוח האוטומטי של היצרן בתוכנת DWB (ראה ציוד דינמי לנשיאת משקל בטבלת החומרים) מספק מדידות על כל כפה ביחס למשקל הגוף הכולל, משך הזמן המאומת שבו כל כפה נשארה על המחצלת, והערכה של שטח המחצלת שנכבש על ידי כל כפה. זה מאפשר לחשב את העומס הדיפרנציאלי בין שתי הכפות האחוריות, את העומס הדיפרנציאלי בין הכפות הקדמיות והאחוריות, עלייה בעומס הכפות הקדמיות (אם אותו עכבר נמדד לאורך זמן), את הזמן המושקע בהרמת רגל OA בהשוואה לרגל הנגדית ולמשטח הכפות.
  2. כימות רקמה עם סידן באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT).
    הערה: למרות שניתן למדוד אוסטאוסקלרוזיס של עצם תת-כונדרלית והיווצרות אוסטאופיטים במקטעים היסטולוגיים, μCT מציע את ההזדמנות לכמת תלת-ממדית. הרזולוציה של לכידת תמונה ב- μCT ב 5 מיקרומטר מספיקה, שכן זה מאפשר הדמיה של מבנים קטנים יותר כגון osteophytes, אם כי ככל שהרזולוציה גבוהה יותר, כך טוב יותר.
    1. תקן את מפרקי הברך בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות, ולאחר מכן העבר ל-70% EtOH.
    2. סרוק את מפרקי הברך בסורק μCT.
      הערה: במחקר הנוכחי, הדגימות נסרקו על סורק μCT (ראה טבלת חומרים) עם מסנן אלומיניום 0.5 שנקבע על 50 kV ו- 200 μA. הדגימות נבדקו בגודל ווקסל של 4.5 מיקרומטר; 2 מיקרומטר, זווית סיבוב של 0.2° להדמיה, וזווית סיבוב של 0.5° לכימות.
    3. בנה מחדש סריקות כדי לאפשר הדמיה תלת-ממדית. הסריקות המוצגות כאן שוחזרו באמצעות תוכנה תואמת (ראו טבלת חומרים).
    4. נתחו טרשת עצם תת-כונדרלית (איור 2B) בהתאם לשלבים הבאים.
      1. בחר נפח עניין (VOI) של 0.5 מ"מ × 0.9 מ"מ × 0.9 מ"מ במרכז העומס של הרמה הטיביאלית המדיאלית17.
      2. לנרמל נגד פנוטיפ העצם הפנימי של העכבר על ידי ניתוח הרגל הלא מופעלת.
      3. קבע את צפיפות העצם התת-כונדרלית ואת ארכיטקטורת המיקרו על ידי בחירת אזור עניין (ROI) המתאר את המבנה הטרבקולרי בתוך האפיפיזה הטיביאלית, הלוח התת-כונדרלי או העצם התת-כונדרלית הכוללת בתצוגה הקורונלית הדו-ממדית של המחסנית באמצעות תוכנת CTan (ראה טבלת חומרים).
        הערה: ככל שהמחלה מתקדמת, קשה יותר להבחין בין הלוחית התת-כונדרלית לאזור הטרבקולרי התת-כונדרלי. לאחר מכן מומלץ לנתח את אזור העצם התת-כונדרלית שנבחר מחלל המפרק לצלחת הצמיחה.
    5. כימות אוסטאופיטים (איור 2C) בהתאם לשלבים הבאים.
      1. זהה אוסטאופיטים בערימות התמונה התלת-ממדיות המשוחזרות באמצעות תוכנת CTvol (ראה טבלת חומרים).
        הערה: אוסטאופיטים שעברו מינרליזציה הם בליטות הדומות לעצם ארוגה הנראית בצד המדיאלי של העצם התת-כונדרלית18. דוגמה לכך מסומנת באמצעות חיצים צהובים באיור 2C.
      2. ספירה ידנית של מספר האוסטאופיטים המזוהים בצד המדיאלי של מפרק הברך.
      3. מדוד את נפח האוסטאופיטים בניתוח תמונה רציפה דו-ממדית (באמצעות מנתח ה-CT) על-ידי סימון קצה האוסטאופיטים באופן ידני, תוך הבלטה מהלוח התת-כונדרלי כאזור העניין (ROI) לניתוח.
      4. חשב את צפיפות העצם של אוסטאופיט כיחס בין נפח העצם לנפח האוסטאופיטים באמצעות תוכנת ניתוח ה-CT (ראו טבלת חומרים).
  3. הערך את הנזק לסחוס ואת הסינוביטיס (איור 2D) לפי ציון19 של נזקי הסחוס של OARSI וציון20 של סינוביטיס בסעיפים של 6 מיקרומטר המשובצים בפרפין.
    1. לאחר הסריקה, יש לטהר את מפרקי הברך ב-10% EDTA ב-4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים לפחות, ולהחליף תמיסה פעמיים בשבוע.
    2. הטמעת דגימות בפרפין. לטיפולים ולתקופות הדגירה, ראו קובץ משלים 1.
    3. חותכים 5 מיקרומטר מקטעים קורונליים של דגימות משובצות פרפין על מיקרוטום סיבובי (ראו טבלת חומרים).
    4. בחרו מקטעים באזור שבו נפגשים הקונדילים הטיביאליים והירכיים (איור 2D). בחר שני חלקים בשלושה אזורים מרוחקים שווה של המפרק.
      הערה: הסעיפים שקיבלו ציון במחקר הנוכחי נבחרו באזורים המרוחקים 80-100 מיקרומטר זה מזה.
    5. מקטעי כתמים עם ספרנין-O וירוק מהיר (ראה טבלת חומרים) בעקבות השלבים הבאים.
      1. דפראפין חלקים על ידי טבילתם (ברצף שהוזכר) בקסילן למשך 5 דקות (2x), 100% אתנול למשך 2 דקות, 95% אתנול למשך 2 דקות, 80% אתנול למשך 2 דקות ו-70% אתנול למשך 2 דקות.
      2. כתם עם המטוקסילין מסונן (ראה טבלת חומרים) במשך 30 שניות. לאחר מכן יש לשטוף במי ברז למשך 5 דקות (שלוש פעמים).
      3. יש לשטוף עם החיץ של סקוט (2 גרם נתרן ביקרבונט ו-10 גרם מגנזיום גופרתי בליטר אחד של מים מזוקקים) במשך 2 דקות. יש לשטוף ב'מי ברז' במשך 5 דקות (שלוש פעמים).
      4. כתם למשך 4 דקות עם 0.2% ירוק מהיר. יש לטבול ב-1% חומצה אצטית קרחונית, חמש פעמים (טרייה בכל מפגש). יש לשטוף במהירות במי ברז.
      5. כתם במשך 5 דקות עם 0.5% Safranin-O. יש לשטוף ב-95% אתנול. יש לייבש חלקים ב-100% אתנול למשך 3 דקות ולאחר מכן 3 דקות בקסילן.
    6. סעיפי הניקוד כאמור ב- Glasson et al. עבור סחוס19 ו- Jackson et al. עבור סינוביטיס20.
      הערה: קיימות שיטות אחרות לכימות, כגון כימות מבוסס מחשב על ידי Pinamont et al.21.
    7. לאמת את שיטת הניקוד עם שני מבקיעים שונים, עיוורים לניסוי.

Representative Results

אחוז העומס לכל משקל גוף כולל של הרגל האחורית/OA הושווה לרגל הקונטרלטרלית/קונטרולרית. למרות שפרמטרים אחרים עשויים גם הם לתת הבדלים משמעותיים, כמו העלייה בעומס הכפות הקדמיות לאחר התערבות כירורגית, שינוי עקבי בעומס הכפות האחוריות מצביע על העדפה להשתמש ברגל אחת על פני השנייה והוא אינדיקטור ישיר יותר לאי נוחות משמעותית עבור העכבר עקב התפתחות OA. לא היו שינויים משמעותיים בעומס הרגליים האחוריות בדגם DMM תוך 8 שבועות לאחר האינדוקציה, בעוד שעכברי DCS מעדיפים את הרגל הקונטרלטרלית/בקרה באופן משמעותי שבועיים לאחר ההתערבות (איור 3A).

עצם תת-כונדרלית נותחה על ידי התמקדות בנפח שמתחת לאזור הטעון המדיאלי של הקונדיל הטיביאלי. כאן הערכנו את צפיפות העצם של אזור זה על ידי קביעת אחוז העצם המינרלית באזור העניין וחישבנו את היחס בין הרגל הקונטרלטרלית לרגל האיפסילטרלית. היחס מצביע על כך שלשני המודלים יש צפיפות עצם מוגברת בגפה הפגועה (יחס מעל 1) 4 שבועות לאחר האינדוקציה (איור 3B). הופעתם של אוסטאופיטים בולטת יותר במודל DCS, שבו יש עלייה משמעותית במספר ובנפח בהשוואה למודל DMM שבועיים לאחר התערבות (איור 3C,D). DCS מציג נזק סחוס מוגבר בתאי הטיביאליות והירך המדיאלית ובסינוביטיס (איור 3E,F) 4 שבועות לאחר האינדוקציה.

Figure 1
איור 1: התערבות כירורגית להשראת OA פוסט טראומטי בעכבר. תמונות עוקבות מייצגות את השלבים השונים של ההליך. (A) חשיפה של קפסולת מפרק החותכת את הממברנה השטחית סביב הברך על ידי החדרת להב אזמל מספר 11 בצד המדיאלי של הרצועה הפטלרית והרחק מהרצועה. זה יחשוף את כרית השומן האינפרא-פטלרית. (B) זיהוי והעברה של הרצועה המניסקוטיביאלית המדיאלית. כדי לזהות את הרצועה, הזיזו את הרצועה הפטלרית לכיוון הצד הצדדי ואז דחפו את כרית השומן כלפי מעלה. זה מאפשר הדמיה של הרצועה כקו לבן אופקי קטן ממש מעל הקונדיל הטיביאלי (מסומן כאן עם חץ שחור). כדי לחתוך את הרצועה, הלהב התחתון של מספריים קפיץ ממוקם מתחת לרצועה, נזהר לא לפגוע בסחוס. הזיזו את המניסקוס לכיוון הצד המדיאלי כדי לדמיין את הקונדיל הטיביאלי. (C) גירוד פני השטח של הסחוס החשוף וסגירת הפצע. כדי לגרד את הסחוס, המיקרובלייד מוכנס לכיוון הצד האחורי, שם הוא יוצר קשר עם הסחוס ואז נע קדימה לכיוון החלק הקדמי של המפרק. לאחר סיום השריטות, משכו את העור מעל הברך וסגרו את הפצע על ידי תפירה תת-עורית או באמצעות קליפסים לפצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הערכה של דלקת מפרקים ניוונית בעכבר . (A) נשיאת משקל דינמית מורכבת מהתאמת העומס על מחצלת לחץ לכפה המתאימה. לאחר מכן העומס מבוטא כאחוז מהמשקל הכולל. (B) עצם תת-כונדרלית נמדדת על ידי בחירת נפח עניין באזור ההעמסה של הקונדיל הטיביאלי המדיאלי ובחירת הלוח התת-כונדרלי או העצם הטרבקולרית. תמונות אלה הן ברזולוציה של 4.5 מיקרומטר. (C) אוסטאופיטים מזוהים ומכמתים בתצוגה תלת-ממדית של תמונות μCT שנרכשו. נפח האוסטאופיטים נמדד על ידי בחירת ROI התוחם את קצה האוסטיאופיט. צפיפות העצם מחושבת כנפח העצם לכל נפח אוסטאופיט. התמונות המוצגות כאן צולמו ברזולוציה של 2 מיקרומטר, אך הכימות נעשה בדרך כלל ברזולוציה של 4.5 מיקרומטר. (D) ציוני הסחוס והסינוביטיס נלקחים מקטעים של 6 מיקרומטר המוכתמים בספרנין-O ובירוק מהיר. קטע קורונלי של ברך העכבר שבו כל הרבעים, המסומנים בקופסה שחורה, נראים לניקוד ומוצגת הגדלה של הצד המדיאלי. גם הסינוביטיס המקיפה את הצד המדיאלי של מפרק הברך נראית לעין, במיוחד מעל ומתחת למניסקוס העקור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הערכה מייצגת של OA במודלים של DMM ו-DCS. (A) DWB נמדד עד 8 שבועות לאחר האינדוקציה בניסויים שבוצעו על ידי אותו מפעיל מומחה. העומס מבוטא כיחס בין העומס המופעל/OA לעומת העומס הקונטרלטרלי/בקרה. מבחני t זוגיים של שתי הרגליים מוצגים גם בדגמי Sham (אפור), DMM (כחול) ו- DCS (ורוד). ניתוח μCT 4 שבועות לאחר התערבות כירורגית. (B) עצם תת-כונדרלית נותחה 4 שבועות לאחר התערבות כירורגית והתבטאה כיחס בין האיפסילטרל לבין % BV/TV הקונטרלטרלי. (C) מספר האוסטאופיטים ונפח האוסטאופיטים (D) נותחו שבועיים לאחר האינדוקציה. הערכה היסטולוגית 4 שבועות לאחר אינדוקציה של (E) נזק לסחוס של הסחוס הטיביאלי המדיאלי והמפרקי הירך ו-(F) סינוביטיס קיבלו ציון בשיטות סטנדרטיות19,20. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן, n ≥ 5. הנתונים הושוו על-ידי ANOVA במדדים חוזרים עם תיקון מבחן Šídák (A), מבחן t זוגי (A) או מבחן t רגיל של תלמיד (B-F). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns = לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: טיפול ומצב דגירה להטמעת פרפין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

כדי לבצע אינדוקציה כירורגית של דלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית (PTOA), מומלץ מאוד לתמוך בעוזר (למשל, להכין את העכברים בזמן שהמפעיל מתמקד בניתוח). זה מקל על ניתוח אספטי, ובכך להפחית את הסיכונים של זיהומים ולהפוך את ההתערבות יעילה יותר בניסויים גדולים. קל לאבד את מישור המיקוד במהלך הניתוח, ולכן מיקרוסקופ הכולל דוושות למיקוד הוא תכונה חשובה בשמירה על סטריליות לאורך כל הניתוח. מיקום העכבר והברך הוא קריטי. הברך חייבת להיות פונה כלפי מעלה וכפופה מספיק כדי למקסם את הפתח של שטח מפרק הברך, מה שמקל על הגישה לרצועה להחדרת המיקרובלייד כדי לגרד את משטח הקונדיל. זיהוי ה- MMTL יכול להיות מאתגר, במיוחד כאשר כרית השומן גדולה מהרגיל או שיש דימום קטן. כדי למנוע דימום, יש לדחוף את כרית השומן כלפי מעלה כדי למנוע קרעים ודימום לאחר מכן. אם כרית השומן גדולה, זה עשוי לקחת קצת יותר זמן, אבל בסבלנות להמשיך לדחוף אותו כלפי מעלה.

ה- MMTL קרוב למדי לקונדיל הטיביאלי, ולכן יש להיזהר שלא לפגוע בסחוס בעת מיקום הלהב התחתון של מספריים הקפיצים המעוקלים מתחת ל- MMTL. הלהבים המעוקלים צריכים להצביע לכיוון הצד המדיאלי ומעט כלפי מעלה, במקביל לקונדיל. לחיתוך הטוב ביותר של ה-MMTL, ודא שהמספריים חדים. בדקו כי המניסקוס יכול לנוע באופן מדיאלי לאחר חיתוך הרצועה, שכן לעיתים נשאר חיבור קטן הדורש חיתוך נוסף. כאשר מציגים את המיקרובלייד כדי לגרד את הקונדיל, הוא חייב להיות בניצב לקונדיל. מקרבים את השריטה הראשונה לאמצע המפרק אך נזהרים שלא לפגוע ברצועה הצולבת הקדמית. לאחר מכן לנוע לכיוון הצד המדיאלי ואז מאחורי המניסקוס. השריטות עשויות להיראות כקווים לבנים קלושים על הסחוס. מכיוון שאנו משתמשים בדרך כלל בקליפים, החתך הראשוני מבוצע בצד הצדדי, כך שהתפסים ממוקמים בצד הרגל לאחר סגירת הפצע. פעולה זו מונעת מהקליפסים לשפשף את הברך כשהעכבר חוזר לתנועה. בעת שימוש בתפרים, מומלץ מאוד להשתמש בתפרים תת-עוריים. אם משתמשים בתפרים חיצוניים, העכברים צפויים לכרסם בתפרים ולפתוח את הפצע שלהם, מה שיגדיל את הסיכויים לזיהום. כאשר ניתוח זה נעשה נכון, אסור שייקח יותר מ-5-10 דקות, מהחתך ועד לסגירת הפצע, ובכך למזער את החשיפה של הסחוס וכל נזק בלתי מבוקר נוסף שעלול להתרחש. לאחר הניתוח, העכברים מתאוששים מהר מאוד וכמעט מיד יכולים לטפס לתוך הכלוב ולנוע כרגיל. אם העכברים אינם פעילים, יש להתייעץ עם המומחה המתאים ביחידה.

לצורך הערכה התנהגותית של כאב, הוערך נושא משקל דינמי. עם זאת, שיטה זו עשויה להיחשב פחות רגישה ממבחני כאב מעוררים אחרים, כגון בדיקת פון פריי15. מומלץ להשתמש ביותר משיטה אחת כדי לפקח ולהעריך כאב. השינויים שנצפו שבועיים לאחר התערבות ב- DCS, למרות שהם חולפים, מצביעים על ירידה כללית בהעמסה של רגל OA בהשוואה לרגל הבריאה. לכן, ניתן להשתמש בשבועיים לאחר התערבות DCS כדי להעריך כאבים אוסטאו-ארתריטיים מוקדמים או כאבים בפציעות במודלים של עכברים. הדמיה של אוסטאופיטים שעברו מינרליזציה על ידי μCT מאפשרת כימות תלת מימדי, אשר ניתן להתאים גם לסעיפים ההיסטולוגיים12, ומוסיפה ממד נוסף לחקר הופעת אוסטאופיטים ואבולוציה. בקבוצה שלנו, נוכחות אוסטאופיטים הייתה משתנה במודל DMM בין ובתוך אופרטורים (2.3 ± 1 לעומת 1.2 ± 1, n > 7, P = 0.0183), בעוד שאינדוקציה של DCS הובילה בחוזקה ליצירת אוסטאופיטים בכל המקרים ללא קשר לאופרטור (2.6 ± 0.7 לעומת 2.4 ± 0.5, n > 7, P = 0.711). כמו כן, ישנם באופן משמעותי יותר ויותר אוסטאופיטים במודל DCS בהשוואה ל- DMM. לפיכך, DCS הוא מודל אידיאלי לחקר היווצרות אוסטאופיטים. כימות של אוסטאוסקלרוזיס המוגבל לאזור ההעמסה של העצם התת-כונדרלית הוא גם שיפור באיתור שינויים קטנים. השוואת התא המדיאלי של הרגל המופעלת לרגל הנגדית מציעה גם דרך לנרמל כנגד פנוטיפ העצם הפנימי של אותו עכבר מסוים12. הוספת שריטות הסחוס במודל DCS היא אמצעי מבוקר לגרימת נזק סחוס ממוקד במהלך הניתוח המאיץ רבים מההיבטים של המחלה. אחת ההשלכות של ההליך הניסיוני הכולל פגיעה מכוונת בסחוס עצמו היא שיש לשלול או להתאים את הנזק הארטפכלי הזה במערכת דירוג הסחוס. בגלל מגבלה זו, איננו ממליצים על מודל זה אם מטרתו העיקרית של המחקר היא להבין את ההשפעה של דלקת מפרקים ניוונית על הסחוס עצמו. לבסוף, מומלץ מאוד גם שלפחות שני ציונים עיוורים ידרגו את נזקי הסחוס ואת ציוני הסינוביטיס. זה מאמת ומשפר את הסטנדרטיזציה של מערכות הניקוד.

מגבלה של מחקר זה היא שמידת השונות בכל הפרמטרים המשווים בין מודלי DCS ו- DMM לא הוערכה במלואה. נושא זה יטופל בעתיד במחקרים מקיפים יותר, שיוכלו לכלול גם הערכה של השונות בין מפעילים ממוסדות שונים.

לסיכום, הפתוגנזה המואצת של OA במודל DCS הנוכחי מאפשרת ייצוג של OA פוסט טראומטי ומספקת כלי מחקר רב עוצמה וחזק לחקור ולהבהיר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים של OA המניעים את מחלת המפרקים הכרונית המתישה הזו. בנוסף, הוא מאפשר לחקור את OA בחלון זמן קצר יותר, תוך התמקדות באוסטיאופיטוגנזה, כאבי OA והשפעת פגיעה בסחוס על המפרק כולו.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות על עבודתם של ג'מה צ'רלסוורת' ומנדי פריור מאוניברסיטת ליברפול, שרכשו את תמונות ה- μCT המשמשות בפרסום זה. העבודה מומנה על ידי Versus Arthritis (מענקים 20199 ו-22483). לינט דאנינג מומנה על ידי Versus Arthritis (מענק 20199). קנדל מק'קולוך מומן על ידי מלגת דוקטורט של UWS. כרמן הוזה מומנה על ידי Versus Arthritis (מענקים 20199 ו-22483).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 scalpel blade (and scalpel handle). World precision instruments 500240 access the joint capsule
15° Cutting Angle microsurgical stab knife MSP REF7503 scratch the cartilage
6-0 vicryl rapide Any medical supplies provider - alternative method to close wound
Anaesthetic rig Generic (many different suppliers) -
Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) Amazon - To sterilise surgical skin area
Applicator for 7 mm clips World precision instruments 500343 close the wound
Balance Generic (many different suppliers) - To weigh mouse
Blunt curved forceps Fine science tools 500232 move the patellar ligament to the side
Buprenorphine (Vetergesic) Supplied by unit as it is a prescription drug - Analgesia
CT analyser Bruker 3D.SUITE software Software
Ctvol Bruker 3D.SUITE software Software
Data viewer Bruker 3D.SUITE software Software
Dynamic weight bearing equipment Bioseb BIO-DWB-DUAL Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis
EDTA Merck E9884 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4
Ethanol Generic (many different suppliers) - for embedding decalcified bones
Fast Green FCF Merck F7252 For staining sections
Glacial acetic acid Merck 1005706 For stianing sections
Haematoxylin solution Merck GHS132 Nuclear staining in paraffin sections.
Hoskins #21 micro-tweezers. Cameron surgical limited PHF1085 move the fat pad
Isofluorane Supplied by unit as it is a prescription drug -
Mice Charles river - C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit)
Microcomputed tomography scanner Bruker SKYSCAN 1272 CMOS µCT
Micropore surgical paper tape FisherScientific 12787597 hold leg in position
Paraffin wax Generic (many different suppliers) - for embedding decalcified bones
Reflex 7 mm stainless steel wound clips or Fine science tools 12032-07 close the wound
Remover for 7 mm clips World precision instruments 500347 remove wound clips
Rotary Microtome Generic (many different suppliers) - To cut section of Paraffin embedded tissue.
Safranin-O Merck S2255 For staining sections
Serrated curved forceps Fine science tools 15915 hold the skin
Sterile Drape Generic (many different suppliers) - To ensure sterility of surgical area
Sterile Drape with key hole Generic (many different suppliers) - To cover mouse and expose leg
Sterile saline Generic (many different suppliers)
Sterile surgical drape Generic (many different suppliers) - maintain sterile environment for surgical tools
Sterile surgical drape with key hole Generic (many different suppliers) - cover the mouse and keep leg through key hole
Straight Scissors World precision instruments 14393 open the wound
Surgical microscope. Generic (many different suppliers) - Adjustable focus.
Vannas spring scissors with 2 mm blades. Fine science tools 15000-04 cut the MMTL
Xylene Generic (many different suppliers) - for embedding decalcified bones

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arthritis Research UK. The State of Musculoskeletal Health 2018. Arthritis Research UK. , (2018).
  2. Mahir, L., et al. Impact of knee osteoarthritis on the quality of life. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159 (2016).
  3. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2016).
  4. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  5. Sophocleous, A., Huesa, C. Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus. Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).
  6. McCulloch, K., et al. Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).
  7. Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654 (2021).
  8. Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).
  9. Loga, I. S., et al. Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).
  10. Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  11. Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
  12. Huesa, C., et al. Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).
  13. Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).
  14. Stewart, K., Schroeder, V. A. Lab animal research. blood withdrawal I. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2018).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  17. Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).
  18. vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. Osteophytes: relevance and biology. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (3), 237-244 (2007).
  19. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, SUPPL 3 17-23 (2010).
  20. Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
  21. Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991 (2020).

Tags

רפואה גיליון 185
ערעור היציבות של המניסקוס המדיאלי ושריטה הסחוס מודל מורין של דלקת מפרקים ניוונית מואצת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunning, L., McCulloch, K.,… More

Dunning, L., McCulloch, K., Lockhart, J. C., Goodyear, C. S., Huesa, C. Destabilization of the Medial Meniscus and Cartilage Scratch Murine Model of Accelerated Osteoarthritis. J. Vis. Exp. (185), e64159, doi:10.3791/64159 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter