Summary
Настоящий протокол описывает контролируемые царапины микролезвий на поверхности суставного хряща после дестабилизации колена мыши путем разрезания медиальной минискотибиальной связки. Эта животная модель представляет ускоренную форму остеоартрита (ОА), подходящую для изучения образования остеофита, остеосклероза и боли на ранней стадии.
Abstract
Остеоартрит является наиболее распространенным заболеванием опорно-двигательного аппарата у людей старше 45 лет, что приводит к увеличению экономических и социальных издержек. Животные модели используются для имитации многих аспектов заболевания. Настоящий протокол описывает дестабилизацию и модель царапин хряща (DCS) посттравматического остеоартрита. Основываясь на широко используемой модели дестабилизации медиального мениска (DMM), DCS вводит три царапины на поверхности хряща. В настоящей статье освещаются шаги по дестабилизации колена путем перерезания медиальной менискотибиальной связки с последующими тремя преднамеренными поверхностными царапинами на суставном хряще. Также демонстрируются возможные методы анализа методом динамической несущей способности, микрокомпьютерной томографии и гистологии. Хотя модель DCS не рекомендуется для исследований, которые сосредоточены на влиянии остеоартрита на хрящ, она позволяет изучать развитие остеоартрита в более короткое временное окно, уделяя особое внимание (1) образованию остеофита, (2) остеоартритной и травматической боли и (3) эффекту повреждения хряща во всем суставе.
Introduction
Остеоартрит (ОА) является наиболее распространенным заболеванием опорно-двигательного аппарата у людей старше 45 лет, причем более 8,75 миллиона человек обращаются за лечением в Великобритании1. Растущая распространенность заболевания привела к увеличению экономических и социальных издержек, является одним из основных факторов инвалидности и снижает качество жизни пациентов1. Без доступных методов лечения существует острая необходимость в ускорении исследований, чтобы понять развитие и прогрессирование заболевания. Заболевание является комплексным, а также многофакторным по своей природе. Основными клиническими измерениями заболевания являются боль и подвижность суставов2, а ОА влияет на все ткани в суставе, а не только на хрящ3. Одна из основных проблем в понимании ОА заключается в том, что это может занять годы, иногда десятилетия, от первоначального представления / травмы до прогрессирования симптоматического заболевания с болью и неподвижностью.
Моделирование остеоартрита у грызунов расширило наши знания о патофизиологии ОА, позволив нам понять начало и прогрессирование в гораздо более короткие сроки и с подробным изучением вовлеченных тканей. Существует множество мышиных моделей остеоартрита, от генетически модифицированных животных до моделей хирургического вмешательства. Наиболее широко используемой мышиной моделью посттравматического ОА является дестабилизация медиального мениска (ДММ)4,5. Предостережением модели является изменчивость между различными операторами. Опытные хирурги могут выполнить процедуру с минимальным повреждением суставов, в то время как неопытные операторы обнажают суставную капсулу в течение более длительных периодов времени и наносят ущерб хрящу. Эта изменчивость процесса влияет на тяжесть модели, при этом большее первоначальное повреждение приводит к увеличению показателей повреждения хряща и образованию остеофита. Намереваясь уменьшить вариабельность между операторами и имитировать повреждение хряща от клинического вмешательства, разработана модифицированная версия этой модели, в соответствии с которой наносится контролируемое дополнительное повреждение поверхностной поверхности хряща в виде трех поверхностных царапин6. Это также позволяет моделировать прогрессирование ОА в результате повреждения хряща, вызванного некоторыми клиническими вмешательствами. По сравнению со стандартной моделью DMM, непосредственно индуцированное повреждение хряща приводит к последовательно ускоренному образованию выступающих остеофитов, увеличению повреждения хряща и воспаления, а также измеримой суррогатной боли у самцов мышей.
Эта модель особенно подходит для изучения ранней стадии посттравматического ОА, уделяя особое внимание образованию остеофита, представлению боли (у самцов мышей), синовиту и ранним изменениям параметров кости. Консистенция образования остеофита в этой модели делает целесообразным изучение репарации костей и эндохондрального окостенения, поскольку образование остеофита представляет собой процесс восстановления через эндохондральное окостенение7. Модель также имитирует повреждения, вносимые непосредственно в хрящ во время клинических вмешательств, таких как артроскопические хирургические процедуры, и, таким образом, она также подходит для изучения влияния повреждения хряща на весь сустав.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были одобрены Группой по этическому обзору Университета Глазго и Университета Западной Шотландии и выполнены в соответствии с руководящими принципами Закона о животных (научные процедуры) 1986 года (Великобритания). Для настоящего исследования использовались 10-недельные самцы мышей C57Bl6/J весом около 25 г. Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).
1. Подготовка животных
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим пол мыши в отношении цели исследования, поскольку посттравматические модели ОА демонстрируют важные различия в зависимости от пола 8,9,10.
- Убедитесь, что анестетик реагент (2% изофлурана) готов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекционная анестезия также может бытьиспользована 11. Учитывая быструю продолжительность операции, рекомендуется использование ингаляционной анестезии. - Используйте отдельную фиктивную группу, соответствующую возрасту, в качестве хирургического контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контралатеральное колено не должно использоваться в качестве хирургического контроля (фиктивная операция на контралатеральной ноге). Это может иметь проблемы с точки зрения благополучия животных, и это, вероятно, повлияет на измерения походки и походки. Контралатеральное колено нормализует внутренние параметры кости12 и действует как парное сравнение на вызванных болевых тестах13. - Используйте скелетно зрелых мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большая часть литературы вызывает ОА в возрасте 8-12 недель. В настоящем исследовании мышам 10 недель.
2. Предоперационный уход (осуществляется ассистентом хирурга)
- При транспортировке из другого учреждения подождите, по крайней мере, за 1 неделю до хирургического вмешательства, чтобы мыши могли приспособиться к новой среде.
- Проводите операцию в надлежащим образом назначенной стерильной комнате, гарантируя, что все поверхности стерильны (например, используйте стерильные шторы для покрытия областей хирургии).
ПРИМЕЧАНИЕ: Операция является асептической. - Расположите и поместите стерильные инструменты на стерильные шторы.
- Взвесьте мышь.
- Индуцировать анестезию, вводя мышь в клетку для анестезии, а затем вводя 2% изофторана в течение 15 мин с использованием стандартной анестезирующей установки (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетка не должна иметь «остаточной» анестезии до введения мыши. - После обезболивания выведите мышь из анестезиологической камеры и обрежьте мех на колене, передней и боковой сторонах от середины голени до середины бедра с помощью небольших машинок для резания волос.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор заднего коленного сустава зависит от предпочтений оператора, с какой стороны ему легче проводить операцию. Этот протокол действовал на левой ноге. - Убедитесь, что мышь полностью обезболена (не реагирует на защемление стопы).
- Дезинфицируйте кожу, нанося антибактериальное очищающее средство для кожи (например, содержащее хлоргексидин или йодофор, см. Таблицу материалов) на бритую открытую кожу.
- Для обезболивания вводят 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно.
- Поместите мышь на спинную сторону, оставив колено для работы вверх, и поместите нос мыши в сопло, соединенное с анестезирующей установкой.
- Накройте мышь стерильной драпировкой с небольшим отверстием замочной скважины.
- Позиционируйте ногу, подлежащую операции, с коленом, согнутым менее чем на 90°, с коленной связкой, обращенной вверх, и стопой, обездвиженной хирургической лентой.
3. Процедура дестабилизации медиального мениска с последующим расчесыванием хряща
- Отрегулируйте микроскоп, чтобы сфокусироваться на связке надколенника.
- Зажмите кожу колена с боковой стороны зубчатыми щипцами (см. Таблицу материалов), сделайте небольшой разрез параллельно дистальному сухожилию надколенника хирургическими ножницами, введите ножницы и расширите разрез примерно до 1 см. Переместите кожу на медиальную сторону, обнажив надколенниковую связку и проксимальное плато большеберцовой кости (рисунок 1).
- С помощью лезвия No 11 сделайте разрез вдоль медиальной стороны надколенниковой связки, сверху вниз связки (рисунок 1А). Достигнув нижней части надколенниковой связки, поверните лезвие на 90° и вытяните разрез от надколенниковой связки в сторону медиальной стороны, чтобы получить доступ к суставной капсуле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кровотечение может произойти на этом или последующих этапах. При возникновении кровотечения используйте стерильную ватную палочку и надавите на несколько секунд (от 5 до 30 с). - Защемите надколенниковую связку тупыми щипцами и поверните запястье, чтобы переместить надколенниковую связку в боковую сторону, ровно столько, чтобы обнажить инфрапателлярную жировую подушку (IFP).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму повреждение связки надколенника, не держите пинцет слишком плотно, достаточно только держать связку в стороне. - Все еще слегка удерживая связку надколенника, зажмите IFP микро-пинцетом (см. Таблицу материалов), чтобы поднять его и слегка переместить вверх. Это позволяет визуализировать медиальную связку мениска.
- Определите медиальную менискотибиальную связку (MMTL) медиального мениска, которая закрепляет черепной рог медиального мениска к переднему плато большеберцовой кости (рисунок 1B).
- Избегайте повреждения и длительного воздействия хряща на плато большеберцовой кости или мыщелке бедренной кости.
- Аккуратно разрежьте MMTL небольшими 2 мм лезвием пружинных ножниц Vannas, оставив медиальный мениск и другие связки нетронутыми. На этом этапе хирургическая процедура для модели DMM завершена (рисунок 1C).
- Микрохирургическим ножом толщиной 3 мм отметьте три равномерно расположенных углубления на суставном хряще большеберцовой кости в направлении от задней к передней части.
ПРИМЕЧАНИЕ: Баллы имеют длину около 1 мм и повреждают только поверхность хряща (рисунок 2D).- Не применяйте чрезмерную силу с лезвием на хрящ (т. Е. Убедитесь, что царапины поверхностны). Этот дополнительный шаг наносит повреждение хряща, вызывая модель DCS.
- Закройте кожу двумя или тремя небольшими металлическими зажимами для замыкания раны толщиной 7 мм или рассасывающимися 6-0 подкожными хирургическими швами (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подкожные хирургические швы лучше, так как они избегают дальнейшего вмешательства, но они продлевают продолжительность операции. Наружные швы увеличивают риск вскрытия раны при грызании мышей. - Выявляют медиальную менискотибиальную связку медиального мениска для фиктивной операции, но не разрывают.
- Для мышей, получающих только царапины хряща, сделайте три поверхностные царапины, не разрывая связку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Между каждой мышью смените перчатки и стерилизуйте инструменты с помощью автоклава. Не забудьте проверить, охлаждены ли инструменты перед повторным использованием.
4. Послеоперационный уход
- Если произошло кровотечение (>50 мкл), вводят 500 мкл теплого стерильного физиологического раствора подкожно (на спину мыши).
ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, хотя у мышей есть незначительные кровотечения, это никогда не больше, чем маленькая капля, и, следовательно, жидкости не нуждаются в пополнении. - После операции поместите мышь в восстановительную клетку на чистую бумажную салфетку и обеспечьте восстановление после анестезии (5-10 мин).
- Переведите полностью сознательных мышей в чистую клетку со свежим постельным бельем после операции.
- Через 72 ч после хирургического вмешательства следите за любыми признаками боли или дистресса. Обратите внимание на:
- Изменения массы тела. Хотя масса тела может снижаться в первый и второй день, обычно это не более 5% от предоперационной массы тела.
- Общее отсутствие груминга или чрезмерный уход вокруг разреза.
- Признаки общего ухудшения здоровья, такие как сгорбленная осанка, гримасничание лица и / или аномальное дыхание.
- Раневая инфекция, о чем свидетельствует любой отек, выделения или вскрытие раны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекция может возникнуть, если хирургическая рана открывается. Поскольку хирургическое восстановление раны (например, замена отсутствующих металлических зажимов или повторное наложение швов) является регулируемой процедурой, убедитесь, что соответствующее одобрение получено до выполнения ремонта.
- Удалите металлические зажимы через 5-7 дней после операции.
- Поддерживайте мышей обычно через 2-52 недели после операции в зависимости от дизайна исследования.
- Оцените боль / походку в любой момент во время исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании используется динамическое удержание веса, как описано на этапе 5.1. - Усыпление животного утвержденным методом, в соответствии с национальными лицензионными соглашениями, местными руководящими принципами и экспериментальным одобрением.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании животные были усыплены путем экссангинации (пункции сердца) под терминальной анестезией с последующим вывихом шейки матки14.
5. Оценка остеоартритной болезни
- Измерьте динамическое ношение веса в качестве суррогатного измерения боли, следуя приведенным ниже шагам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мыши являются хищными животными, они, как правило, скрывают болевое поведение. Это затрудняет измерение боли. Есть много способов измерить вызванную боль, таких как фон Фрей15 и анализ походки16. В настоящем исследовании измерялась дифференциальная нагрузка между оперируемой остеоартритной ногой и неоперированной контрольной ногой на коврике под давлением, когда мышь находилась в клетке (см. Таблицу материалов, рисунок 2А).- Взвесьте мышь. Нанесите тару и откалибруйте напорный мат в соответствии со специальными инструкциями производителя (см. Динамическое несущее оборудование в Таблице материалов). Введите мышь в клетку.
- Записывайте движение и давление лап мыши в клетке в течение 5 мин. Анализ полученных данных для проверки 1 мин, следуя инструкциям производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированный анализ производителя на программном обеспечении DWB (см. Динамическое несущее оборудование в Таблице материалов) обеспечивает измерения на каждой лапе пропорционально общей массе тела, количеству проверенного времени, в течение которого каждая лапа оставалась на коврике, и оценке площади мата, занимаемой каждой лапой. Это позволяет рассчитать дифференциальную нагрузку между двумя задними лапами, дифференциальную нагрузку между передней и задней лапами, увеличение нагрузки на передние лапы (если одна и та же мышь была измерена в течение определенного периода времени), время, затраченное на подъем ноги ОА по сравнению с контралатеральной ногой и поверхностью лапы.
- Количественная оценка кальцинированной ткани с помощью микрокомпьютерной томографии (мкКТ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя субхондральный остеосклероз кости и образование остеофита могут быть измерены в гистологических срезах, μCT дает возможность количественной оценки трехмерно. Разрешение захвата изображения в μCT при 5 мкм является достаточным, так как это позволяет визуализировать более мелкие структуры, такие как остеофиты, хотя чем выше разрешение, тем лучше.- Зафиксируйте коленные суставы в 4% растворе параформальдегида в течение 24 ч, затем переведите на 70% EtOH.
- Сканирование коленных суставов в сканере μCT.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании образцы сканировались на сканере μCT (см. Таблицу материалов) с алюминиевым фильтром 0,5, установленным на 50 кВ и 200 мкА. Образцы были исследованы при размере вокселя 4,5 мкм; 2 мкм, угол поворота 0,2° для визуализации и угол поворота 0,5° для количественной оценки. - Реконструируйте сканы, чтобы обеспечить 3D-визуализацию. Сканы, представленные здесь, были реконструированы с использованием совместимого программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
- Проанализируйте субхондральный склероз костей (рисунок 2B), выполнив следующие шаги.
- Выберите интересующий объем (VOI) 0,5 мм × 0,9 мм × 0,9 мм в центре нагрузки медиального плато большеберцовой кости17.
- Нормализуйте по отношению к внутреннему костному фенотипу мыши, анализируя неоперированную ногу.
- Определите плотность субхондральной кости и микроархитектуру, выбрав интересующую область (ROI), очерчивающую трабекулярную структуру в эпифизе большеберцовой кости, субхондральную пластинку или общую субхондральную кость в двумерном корональном виде стека с использованием программного обеспечения CTan (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: По мере прогрессирования заболевания разделение между субхондральной пластинкой и субхондральной трабекулярной областью становится все труднее различить. Затем рекомендуется проанализировать область субхондральной кости, выбранную из суставного пространства в пластину роста.
- Количественно оцените остеофиты (рисунок 2C), выполнив следующие шаги.
- Идентификация остеофитов в реконструированных трехмерных стеках изображений с помощью программного обеспечения CTvol (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Минерализованные остеофиты представляют собой протрузии, похожие на тканую кость, видимую на медиальной стороне субхондральной кости18. Пример этого показан желтыми стрелками на рисунке 2C. - Вручную подсчитывают количество выявленных остеофитов в медиальной стороне коленного сустава.
- Измерьте объем остеофита в 2D-последовательном анализе изображений (с помощью КТ-анализатора), очертив край остеофитов вручную, выступая из субхондральной пластины в качестве области интереса (ROI) для анализа.
- Рассчитайте плотность костной ткани остеофита как отношение объема кости к объему остеофита с помощью программного обеспечения КТ-анализатора (см. Таблицу материалов).
- Идентификация остеофитов в реконструированных трехмерных стеках изображений с помощью программного обеспечения CTvol (см. Таблицу материалов).
- Оцените повреждение хряща и синовит (рисунок 2D) в соответствии с оценкой повреждения хряща OARSI19 и оценкой синовита20 на парафиновых участках 6 мкм.
- После сканирования декальцинируйте коленные суставы в 10% ЭДТА при 4 °C в течение минимум 2 недель, меняя раствор два раза в неделю.
- Встраивание образцов в парафин. Для лечения и инкубационных периодов см. Дополнительный файл 1.
- Вырежьте 5 мкм корональные срезы образцов, встроенных в парафин, на ротационном микротоме (см. Таблицу материалов).
- Выберите участки в области, где встречаются большеберцовые и бедренные мыщелки (рисунок 2D). Выберите две секции в трех одинаково удаленных областях соединения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Участки, оцененные в настоящем исследовании, были отобраны в районах на расстоянии 80-100 мкм друг от друга. - Окрашивание секций с safranin-O и Fast зеленым цветом (см. Таблицу материалов), следуя приведенным ниже шагам.
- Депарафинизируют срезы, погружая их (в указанной последовательности) в ксилол на 5 мин (2x), 100% этанол на 2 мин, 95% этанол на 2 мин, 80% этанол на 2 мин и 70% этанол на 2 мин.
- Окрашивание фильтрованным гематоксилином (см. Таблицу материалов) в течение 30 с. Затем промыть в водопроводной воде на 5 мин (трижды).
- Промыть буфером Скотта (2 г бикарбоната натрия и 10 г сульфата магния в 1 л дистиллированной воды) в течение 2 мин. Смойте в «водопроводной воде» в течение 5 минут (три раза).
- Окрашивание в течение 4 мин с 0,2% быстрого зеленого цвета. Окуните в 1% ледниковой уксусной кислоты, пять раз (свежеприготовленные каждый сеанс). Быстро промойте в водопроводной воде.
- Окрашивание в течение 5 мин с 0,5% Сафранин-О. Промыть в 95% этаноле. Обезвоживать срезы в 100% этаноле в течение 3 мин с последующим 3 мин в ксилоле.
- Оценочные разделы, как указано в Glasson et al. для хряща19 и Jackson et al. для синовита20.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют и другие методы количественной оценки, такие как компьютерная количественная оценка Pinamont et al.21. - Проверьте систему подсчета очков с двумя разными бомбардирами, слепыми к эксперименту.
Representative Results
Процентная нагрузка на общую массу тела задней оперируемой ноги/ОА сравнивалась с контралатеральной/контрольной ногой. Хотя другие параметры также могут давать существенные отличия, такие как увеличение нагрузки на переднюю лапу после хирургического вмешательства, последовательное изменение нагрузки на заднюю лапу указывает на предпочтение использования одной ноги над другой и является более прямым показателем значительного дискомфорта для мыши из-за развития ОА. Не было никаких существенных изменений в нагрузке на задние ноги в модели DMM в течение 8 недель после индукции, в то время как мыши DCS предпочитали контралатеральную / контрольную ногу значительно через 2 недели после вмешательства (рисунок 3A).
Субхондральная кость была проанализирована путем фокусировки на объеме под медиальной нагруженной областью мыщелка большеберцовой кости. Здесь мы оценили плотность костной ткани этой области, определив процент минерализованной кости в интересующей области и рассчитав соотношение между контралатеральной и ипсилатеральной ножкой. Соотношение указывает на то, что обе модели имеют повышенную плотность костной ткани в пораженной конечности (соотношение выше 1) через 4 недели после индукции (рисунок 3B). Появление остеофитов более заметно в модели DCS, где наблюдается значительное увеличение количества и объема по сравнению с моделью DMM через 2 недели после вмешательства (рисунок 3C,D). DCS представляет повышенное повреждение хряща в медиальном большеберцовом и бедренном отсеках и синовит (рисунок 3E, F) через 4 недели после индукции.
Рисунок 1: Хирургическое вмешательство для индуцирования посттравматического ОА у мыши. Последовательные изображения представляют различные этапы процедуры. (A) Воздействие суставной капсулы, разрезающей поверхностную мембрану вокруг колена путем введения лезвия скальпеля No 11 на медиальную сторону надколенниковой связки и вдали от связки. Это обнажит инфрапателларную жировую подушку. (B) Идентификация и трансекция медиальной менискотибиальной связки. Чтобы идентифицировать связку, переместите связку надколенника к боковой стороне, а затем подтолкните жировую подушку вверх. Это позволяет визуализировать связку в виде небольшой горизонтальной белой линии чуть выше мыщелка большеберцовой кости (обозначена здесь черной стрелкой). Чтобы разрезать связку, нижнюю лопатку пружинных ножниц помещают под связку, следя за тем, чтобы не повредить хрящ. Переместите мениск в сторону медиальной стороны, чтобы визуализировать мыщелок большеберцовой кости. (C) Расчесывание поверхности открытого хряща и закрытие раны. Чтобы поцарапать хрящ, микролезочка вставляют к задней стороне, где она контактирует с хрящом, а затем перемещается вперед к передней части сустава. Как только царапины будут сделаны, потяните кожу на колено и закройте рану либо подкожным швом, либо раневыми зажимами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оценка остеоартрита у мыши. (А) Динамическое удержание веса состоит из сопоставления нагрузки на нажимном коврике с соответствующей лапой. Затем нагрузка выражается в процентах от общего веса. (B) Субхондральная кость измеряется путем выбора интересующего объема в области нагрузки медиального мыщелка большеберцовой кости и выбора субхондральной пластинки или трабекулярной кости. Эти изображения имеют разрешение 4,5 мкм. (C) Остеофиты идентифицируются и количественно оцениваются в трехмерном виде полученных изображений μCT. Объем остеофитов измеряется путем выбора ROI, очерчивающего край остеофита. Плотность костной ткани рассчитывается как объем кости на объем остеофита. Изображения, представленные здесь, были сделаны с разрешением 2 мкм, но количественная оценка обычно выполняется с разрешением 4,5 мкм. (D) Оценки хряща и синовита берутся из 6 мкм срезов, окрашенных сафранином-О и быстрым зеленым цветом. Корональный участок колена мыши, где все квадранты, отмеченные черным прямоугольником, видны для подсчета очков и показано увеличение медиальной стороны. Синовит, окружающий медиальную сторону коленного сустава, также виден, особенно выше и ниже смещенного мениска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативная оценка ОА в моделях DMM и DCS. (A) DWB измеряется до 8 недель после индукции в экспериментах, проведенных одним и тем же экспертом-оператором. Нагрузка выражается в виде соотношения между рабочей нагрузкой/нагрузкой ОА и контралатеральной/контрольной нагрузкой. Парные t-тесты обеих ног также показаны в моделях Sham (серый), DMM (синий) и DCS (розовый). анализ μCT через 4 недели после хирургического вмешательства. (B) Субхондральная кость анализировалась через 4 недели после хирургического вмешательства и выражалась как соотношение ипсилатеральной к контралатеральной %BV/TV. (C) Остеофитное число и (D) объем остеофита анализировали через 2 недели после индукции. Гистологическая оценка через 4 недели после индукции (Е) повреждения хряща медиальной большеберцовой и бедренной суставных хрящей и (F) синовита оценивалась стандартизированными методами19,20. Данные выражаются в виде среднего ± стандартного отклонения, n ≥ 5. Данные сравнивались с помощью повторных измерений ANOVA с коррекцией теста Шидака (A), парным t-тестом (A) или стандартным t-тестом Стьюдента (B-F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns = незначимо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Условия обработки и инкубации для встраивания парафина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Для выполнения хирургической индукции посттравматического остеоартрита (ПТОА) настоятельно рекомендуется поддержка со стороны помощника (например, для подготовки мышей, пока оператор фокусируется на операции). Это облегчает асептическую хирургию, тем самым снижая риск инфекций и делая вмешательство более эффективным в больших экспериментах. Легко потерять плоскость фокусировки во время операции, поэтому микроскоп, который включает педали для фокусировки, является ценной особенностью, помогающей поддерживать стерильность на протяжении всей операции. Положение мыши и колена имеет решающее значение. Колено должно быть обращено вверх и достаточно согнуто, чтобы максимизировать открытие пространства коленного сустава, облегчая доступ к связке для введения микробелла, чтобы поцарапать поверхность мыщелка. Идентификация MMTL может быть сложной задачей, особенно когда жировая подушка больше, чем обычно, или есть небольшое кровотечение. Чтобы избежать кровотечений, подтолкните жировую подушку вверх, чтобы предотвратить разрывы и последующее кровотечение. Если жировая подушка большая, это может занять немного больше времени, но терпеливо продолжайте подталкивать ее вверх.
MMTL находится довольно близко к мыщелку большеберцовой кости, поэтому необходимо позаботиться о том, чтобы не травмировать хрящ при расположении нижнего лезвия изогнутых пружинных ножниц под MMTL. Изогнутые лопасти должны быть направлены в сторону медиальной стороны и немного вверх, параллельно мыщелку. Для лучшего секционирования MMTL убедитесь, что ножницы острые. Убедитесь, что мениск может двигаться медиально после перерезания связки, так как иногда остается небольшое крепление, которое нуждается в дальнейшем разрезании. При введении микроблока, чтобы поцарапать мыщелок, он должен быть перпендикулярен мыщелку. Сделайте первую царапину ближе к середине сустава, но позаботьтесь о том, чтобы не повредить переднюю крестообразную связку. Затем двигайтесь в сторону медиальной стороны, а затем позади мениска. Царапины могут быть видны в виде слабых белых линий на хряще. Поскольку мы обычно используем клипсы, начальный разрез выполняется на боковой стороне, поэтому клипсы располагаются на стороне ноги после закрытия раны. Это позволяет избежать зажимов, потирающих колено, когда мышь восстанавливает движение. При использовании швов настоятельно рекомендуется применение подкожных швов. При использовании наружных швов мыши, скорее всего, будут грызть швы и открывать свою рану, что увеличит шансы заражения. Если все сделано правильно, эта операция не должна занимать более 5-10 минут, от разреза до закрытия раны, тем самым сводя к минимуму воздействие хряща и любые дополнительные неконтролируемые повреждения, которые могут возникнуть. После операции мыши очень быстро выздоравливают и почти сразу могут залезть в клетку и нормально передвигаться. Если мыши не активны, следует проконсультироваться с соответствующим специалистом в подразделении.
Для поведенческой оценки боли оценивали динамическую нагрузку. Однако этот метод можно считать менее чувствительным, чем другие вызванные болевые тесты, такие как тест фон Фрея15. Рекомендуется использовать более одного метода для мониторинга и оценки боли. Изменения, наблюдаемые через 2 недели после вмешательства в DCS, хотя и преходящие, указывают на общее снижение нагрузки на ногу ОА по сравнению со здоровой ногой. Таким образом, 2 недели после вмешательства DCS могут быть использованы для оценки ранней остеоартритной или травмированной боли на мышиных моделях. Визуализация минерализованных остеофитов с помощью μCT позволяет проводить трехмерную количественную оценку, которая также может быть сопоставлена с гистологическими разделами12, добавляя еще одно измерение к изучению возникновения и эволюции остеофита. В нашей группе присутствие остеофита было переменным в модели DMM между операторами и внутри них (2,3 ± 1 против 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), тогда как индукция DCS надежно приводила к генерации остеофита во всех случаях независимо от оператора (2,6 ± 0,7 против 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Кроме того, в модели DCS значительно больше и больше остеофитов по сравнению с DMM. Таким образом, DCS является идеальной моделью для изучения образования остеофита. Количественная оценка остеосклероза, ограниченного областью нагрузки субхондральной кости, также является улучшением в обнаружении небольших изменений. Сравнение медиального отсека оперированной ноги с контралатеральной ногой также предлагает способ нормализации по отношению к внутреннему костному фенотипу этой конкретной мыши12. Добавление царапин хряща в модель DCS является контролируемым средством индуцирования сфокусированного повреждения хряща во время операции, что ускоряет многие аспекты заболевания. Одним из последствий экспериментальной процедуры, связанной с преднамеренным повреждением самого хряща, является то, что это артефактное повреждение должно быть исключено или скорректировано в системе классификации хряща. Из-за этого ограничения мы не рекомендуем эту модель, если основной целью исследования является понимание влияния остеоартрита на сам хрящ. Наконец, также настоятельно рекомендуется, чтобы по крайней мере два слепых оценщика оценивали повреждение хряща и синовита. Это подтверждает и усиливает стандартизацию систем подсчета баллов.
Ограничением данного исследования является то, что степень изменчивости всех параметров, сравнивающих модели DCS и DMM, не была полностью оценена. Этот вопрос будет решаться в будущем с помощью более обширных исследований, которые могли бы также включать оценку изменчивости между операторами из разных учреждений.
В заключение, ускоренный патогенез ОА в текущей модели DCS позволяет представлять посттравматическую ОА и обеспечивает мощный и надежный исследовательский инструмент для исследования и выяснения основных патофизиологических механизмов ОА, приводящих к этому хроническому изнурительному заболеванию суставов. Кроме того, это позволяет исследовать ОА в более короткое временное окно, фокусируясь на остеофитогенезе, боли ОА и влиянии повреждения хряща на весь сустав.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить работу Джеммы Чарльзворт и Мэнди Прайор из Ливерпульского университета, которые приобрели изображения μCT, используемые в этой публикации. Работа финансировалась Versus Arthritis (гранты 20199 и 22483). Линетт Даннинг финансировалась Versus Arthritis (грант 20199 года). Кендал Маккалох финансировался стипендией UWS PhD. Кармен Уэса финансировалась Versus Arthritis (гранты 20199 и 22483).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
| 15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
| 6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | - | alternative method to close wound |
| Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | - | |
| Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | - | To sterilise surgical skin area |
| Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
| Balance | Generic (many different suppliers) | - | To weigh mouse |
| Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | Analgesia |
| CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
| EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
| Ethanol | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
| Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
| Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
| Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
| Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | |
| Mice | Charles river | - | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
| Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
| Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
| Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
| Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
| Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | - | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
| Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
| Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
| Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | - | To ensure sterility of surgical area |
| Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | To cover mouse and expose leg |
| Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
| Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | - | maintain sterile environment for surgical tools |
| Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | cover the mouse and keep leg through key hole |
| Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
| Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | - | Adjustable focus. |
| Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
| Xylene | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
References
- Arthritis Research UK. The State of Musculoskeletal Health 2018. Arthritis Research UK. , (2018).
- Mahir, L., et al. Impact of knee osteoarthritis on the quality of life. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159 (2016).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Sophocleous, A., Huesa, C. Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus. Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).
- McCulloch, K., et al. Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).
- Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654 (2021).
- Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).
- Loga, I. S., et al. Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).
- Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Huesa, C., et al. Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).
- Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Lab animal research. blood withdrawal I. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2018).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).
- vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. Osteophytes: relevance and biology. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (3), 237-244 (2007).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, SUPPL 3 17-23 (2010).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
- Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991 (2020).
