Summary
본 프로토콜은 마우스에서 심방 세동 감수성을 평가하기 위해 경식도 심방 페이싱을 사용할 때 실험 파라미터의 최적화를 설명합니다.
Abstract
심방 세동 (AF)에 대한 유전 적 및 후천적 위험 인자의 마우스 모델은 AF의 분자 결정 요인을 조사하는 데 가치있는 것으로 입증되었습니다. 프로그램된 전기 자극은 생존 절차로 경식도 심방 페이싱을 사용하여 수행할 수 있으므로 동일한 동물에서 연속 테스트가 가능합니다. 그러나 수많은 페이싱 프로토콜이 존재하여 재현성이 복잡합니다. 본 프로토콜은 연구 간의 재현성을 향상시키기 위해 모델 별 실험 매개 변수를 개발하기위한 표준화 된 전략을 제공하는 것을 목표로합니다. 예비 연구는 연구 당시의 연령, 성별 및 페이싱 프로토콜의 매개변수(예: 페이싱 모드 및 AF 감수성의 정의)를 포함하여 조사 중인 특정 모델에 대한 실험 방법을 최적화하기 위해 수행됩니다. 중요한 것은 높은 자극 에너지를 피하기 위해주의를 기울여야하는데, 이는 부주의 한 부교감 신경 활성화로 신경절 신경총의 자극을 유발할 수 있으며, 이는 페이싱 중 과장된 방실 (AV) 차단에 의해 나타나고 종종 인공물 AF 유도와 관련이 있습니다. 이 합병증을 나타내는 동물은 분석에서 제외해야합니다.
Introduction
심방 세동 (AF)은 여러 후천적 및 유전 적 위험 요소에 대한 최종 공통 경로를 나타냅니다. AF 기질의 병태생리학적 메커니즘을 조사하는 연구의 경우, 마우스 모델은 유전자 조작의 용이성과 일반적으로 상이한 임상 표현형 1,2,3에 대해 인간에서 관찰된 AF 감수성을 재현한다는 사실을 고려할 때 유리하다. 그러나 마우스는 자발적인 AF4를 거의 개발하지 않으므로 도발적인 심방 페이싱 연구를 사용해야합니다.
프로그램 된 전기 자극 (PES)은 심장 내5 또는 경식도6 페이싱을 사용하여 쥐 심방 전기 생리학 및 AF 감수성을 평가하기 위해 수행 될 수 있습니다. 경식도 접근법은 생존 절차로서 특히 유리하지만, 그 사용은 수많은 발표 된 실험 프로토콜 7,8 및 재현성을 방해 할 수있는 가변성 원인9에 의해 복잡합니다. 또한 보고된 프로토콜 비교가 제한적으로 인해 적절한 페이싱 프로토콜을 선택하는 것이 어렵습니다.
현재 프로토콜은 재현성을 높이기 위해 쥐 AF 감수성을 평가하기 위한 모델별 경식도 PES 방법을 개발하기 위한 체계적인 전략을 활용하는 것을 목표로 합니다. 중요하게도, 초기 파일럿 연구는 연령, 성별 및 페이싱 모드 변동성을 고려하여 페이싱 프로토콜을 최적화하기 위해 수행되며, 페이싱은 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 부주의한 부교감 신경 자극을 최소화하도록 설계되었습니다9.
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Protocol
이 절차는 Vanderbilt 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드와 일치합니다. 상기 프로토콜은 AF 감수성의 유전자9 및 획득된10 (예를 들어, 고혈압) 마우스 모델 둘 다를 사용하여 개발되었다. 작업자는 연구중인 마우스의 표현형에 대해 눈이 멀었다.
1. 동물 선택
- 유전 모델의 경우, 마우스를 격주(즉, 격주로) 하기 설명된 바와 같이 심방 페이싱(단계 6 참조)하여 AF 감수성의 최적 기간을 결정한다.
- 생후 8주부터 격주로 페이싱을 시작합니다. 야생형 쓰레기를 대조군으로 사용하여 변동성을 줄입니다. AF 표현형이 발달하지 않을 수 있으므로 남녀 모두를 연구하십시오9.
- 획득한 모델의 경우, 마우스가 신체적 성숙(~12주령)에 도달한 후 페이싱을 수행합니다10. 위에서 언급했듯이 남녀 모두를 연구하십시오.
- 이러한 예비 연구 중에 버스트 페이싱8 (고정 페이싱 사이클 길이[CL] 사용)과 감소 페이싱7 (점진적으로 더 짧은 페이싱 CL 사용)을 모두 수행하여 최적의 페이싱 모드를 결정합니다. 각 절차를 최소 24 시간 간격으로 분리하십시오.
참고: 점점 더 많은 수의 마우스가 연구됨에 따라 축적된 데이터를 검토하여 AF에 민감한 마우스에서 AF를 촉진하지만 대조군은 아닌 최적의 연령, 성별 및 페이싱 모드를 결정합니다.- 일부 모델은 모든 정의가 아닌 하나에 대해 AF 표현형을 표시할 수 있으므로 AF 감수성의여러 정의(예: AF 에피소드 수8, 총 AF 지속 시간9, AF 발생률4 및 지속 AF발생률, 일반적으로 10초 11 또는 15초 12, 심지어 최대 5분13,14)를 사용하여 데이터를 분석합니다.
참고: AF 에피소드와 AF 감수성의 정의는 발표된 연구 4,7마다 다릅니다. AF 에피소드8은 일반적으로 최소 1초 동안 불규칙하게 불규칙한 심실 반응이 발생하는 빠른 심방 활동으로 정의됩니다(그림 1). AF 외에도 심방 페이싱은 규칙적이거나 불규칙한 심실 반응으로 심방 조동을 유발할 수 있습니다.
- 일부 모델은 모든 정의가 아닌 하나에 대해 AF 표현형을 표시할 수 있으므로 AF 감수성의여러 정의(예: AF 에피소드 수8, 총 AF 지속 시간9, AF 발생률4 및 지속 AF발생률, 일반적으로 10초 11 또는 15초 12, 심지어 최대 5분13,14)를 사용하여 데이터를 분석합니다.
- 추가 마우스에 대한 후속 연구를 위해 최적화된 모델별 파라미터와 AF 감수성 정의를 사용합니다.
2. 동물 준비
- 100% 산소의 1L/min에 3% 이소플루란( 재료 표 참조)을 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취합니다.
알림: 이소플루란은 유해합니다. 피부나 눈을 자극할 수 있으며 다른 중추신경계 독성 중에서도 현기증, 피로, 두통을 유발할 수 있습니다. 적절한 청소 방법(예: 활성탄 캐니스터)을 사용하여 환기가 잘 되는 곳에서 사용하십시오. - 페달 반사가 사라진 후 뒷다리를 패드 표면에 테이프로 붙인 상태에서 체온을 약 37°C로 유지하도록 설계된 가열 패드의 앙와위 위치에 마우스를 놓습니다.
- 건조를 방지하기 위해 눈에 윤활 눈 연고를 바르십시오.
- 마취 마스크를 마우스의 코 위에 단단히 놓습니다. 100% 산소 1L/min에 1% 이소플루란을 사용하여 마취 유지를 시작합니다. 쥐가 의무적 인 코 호흡자이므로 콧 구멍이 막히지 않도록하십시오.
- 생체 증폭기 및 데이터 수집 하드웨어에 연결된 27 G ECG 바늘 전극( 재료 표 참조)을 앞다리 내로 피하 배치하여 표면 심전도(ECG, 리드 I)를 얻습니다. 바늘 전극을 왼쪽 뒷다리에 배치하여 신호를 접지하십시오.
3. 카테터 배치
- 마우스에서 이소 플루 란 마스크를 간단히 제거하십시오.
- 자극기와 자극 아이솔레이터( 재료 표 참조)에 연결된 2F 팔극 전극 카테터(전극 폭 및 간격 = 0.5mm)를 식도에 삽입합니다(그림 2).
- 입에서 (목을 확장 한 상태에서) xiphoid 연골 바로 위까지의 거리와 비슷한 깊이로 삽입하십시오.
- 이소플루란 마스크를 마우스의 콧구멍 위로 재배치합니다.
- 분석 소프트웨어를 사용하여 ECG 리드 I의 지속적인 기록으로 데이터 수집을 시작합니다( 재료 표 참조).
- 자극 아이솔레이터 모드를 양극성으로 조정합니다. 자극하는 동안 가장 말단 전극 쌍을 사용하십시오.
- 포획이 가능하도록 식도 내에 카테터를 적절하게 배치합니다. 이렇게 하려면 부비동 CL보다 약간 짧은 CL에서 펄스 폭이 2ms인 1.5mA 자극을 적용합니다(예: 부비동 CL이 120ms인 경우 100ms의 CL 사용). 일관된 심방 포획이 얻어 질 때까지 카테터를 조심스럽게 배치하십시오.
4. 임계 값 결정
- 심방 이완기 포획 임계 값 (TH)을 결정하려면 심방 포획에 사용되는 CL에서 펄스 폭이 2ms인 1.5mA에서 페이싱을 시작합니다. 심방 포획이 손실 될 때까지 자극 진폭을 0.05mA 씩 줄이고 포획 될 때까지 증가시킵니다.
참고: 일관된 심방 포획이 얻어지는 가장 낮은 진폭은 심방 TH입니다. 인공물 AF 유도9로 페이싱하는 동안 과도한 AV 블록에 의해 반사되는 높은 자극 진폭에서의 부교감 신경 자극에 대한 우려로 인해 최대 허용 TH는 0.75mA입니다. 필요한 경우 TH ≤0.75 mA를 달성하기 위해 카테터를 재배치하십시오. - 자극 진폭을 두 배 TH로 조정합니다.
5. 전기 생리 학적 특성의 결정
- AF 유도15를 위한 빠른 심방 페이싱 전에 부비동 결절 회복 시간(SNRT), 웬케바흐 주기 길이(WCL) 및 방실 유효 불응 기간(AVERP)을 포함한 전기생리학적 매개변수를 측정합니다.
6. 심방 부정맥 감수성
- 다른 CL에서의 버스트 페이싱 또는 초기 연구에서 결정된 감소 페이싱을 사용하여 2ms의 펄스 폭으로 두 번 TH에서 페이싱을 수행합니다 (단계 1.1.-1.4).
- 버스트 페이싱의 경우 15초 동안 50ms의 초기 CL에서 페이스를 유지하고 후속 열차는 40ms, 30ms, 25ms, 20ms 및 15ms 8,10의 CL에서 발생합니다. 진행하기 전에 회복할 수 있도록 각 페이싱 열차 후 30초 동안 페이싱을 일시 중지합니다. 페이싱 트레인 후에 AF가 발생하면 종료 후 30초 동안 기다렸다가 후속 페이싱을 진행하십시오.
- 감소 페이싱의 경우 40ms의 CL에서 페이스를 유지하고 20ms에서 종료될 때까지 2초마다 CL을2ms씩 줄입니다7. 트리플리케이트16 또는 퀸투플리케이트17에서 페이싱 트레인을 수행하고 각 트레인 후 회복을 위해 30초 동안 일시 중지합니다. 위와 같이 AF가 발생하면 종료 후 30초 동안 기다렸다가 계속 진행하십시오.
참고: 예비 실험(즉, 1.1.-1.5단계) 중에 프로토콜 매개변수를 최적화할 때 5개의 트레인으로 감소 페이싱을 수행합니다. 사후 분석을 수행하여 3개 또는 5개의 열차가 가장 큰 감도를 제공하는지 확인합니다. - 마지막 페이싱 열차 이후 30초의 부비동 리듬 또는 AF의 10분 에피소드 후 중 먼저 도래하는 시점에 절차를 종료합니다.
7. 사후 절차
- 데이터 수집을 중지합니다.
- 카테터와 ECG 전극을 부드럽게 제거하십시오.
- 마취를 중단하십시오.
- 마취된 마우스를 케이지에 넣고 회복을 위해 10분 동안 관찰합니다.
- 데이터 파일을 저장합니다. 연속 테스트의 경우 페이싱 절차를 반복하기 전에 최소 24시간 동안 기다리십시오.
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Representative Results
경식도 심방 페이싱 연구는 SNRT 및 AVERP와 AF 감수성6 을 결정하여 SA 및 AV 노드의 전기생리학적 특성을 평가합니다(그림 1). ECG 기록을 통해 P 파 지속 시간, PR 간격, QRS 지속 시간 및 QT / QTc 간격을 측정 할 수 있습니다. 빠른 심방 페이싱 동안 ECG를 지속적으로 기록하면 연구 중에 유도 된 에피소드 수, 에피소드의 누적 및 평균 지속 시간, 지속 된 AF 에피소드 수와 같은 AF 취약성 측정을 제공 할 수 있습니다. 페이싱 중 과도한 AV 차단의 에피소드는 페이싱으로 인한 부교감 신경 자극 기간을 나타낼 수 있으며(그림 3), 이는 연관된 AF가모델 자체의 병태생리학이 아니라 이 현상의 인공물임을 나타냅니다9.
그림 1: 심방 페이싱의 대표적인 결과. 빠른 심방 페이싱 후 (A) 부비동 리듬 및 (B) 심방 세동을 묘사하는 표면 ECG 기록. 페이싱 속도가 Wenckebach CL을 초과하여 페이싱 중에 1:1 AV 노드 전도가 손실됩니다. 기준 아티팩트는 마우스 호흡과 관련이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 경식도 카테터의 시각적 표현과 신경절 신경총에 대한 근접성. (A) 2-F 팔극 카테터를 묘사한 사진. (B) 카테터가 후방 좌심방 신경절 신경총에 근접한 것을 묘사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 빠른 심방 페이싱 중 과도한 AV 차단의 대표적인 결과. 심방 페이싱 중, 특히 더 높은 자극 강도와 짧은 CL로 페이싱하는 동안 발생할 수 있는 과도한 AV 블록이 있거나(B) 없는 (B) 심방 진행 리듬을 보여주는 표면 ECG 기록. 빨간색 화살표는 QRS 복합체를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
경식도 심방 페이싱은 동일한 동물에 대한 연속 연구를 허용할 뿐만 아니라 일반적으로 지속 시간이 심장 내 연구(~20분)보다 짧기 때문에 마취 사용과 전기 생리학적 매개변수에 미치는 영향을 최소화합니다.
처음에는 각 개별 마우스 모델에 대해 방법을 최적화하는 것이 중요합니다. 노화는 정상 마우스(18, 19)에서 AF 유도성을 증가시키고, 개별 유전 모델은 제한된 기간에 걸쳐 AF 유도성을 입증할 수 있다. 격주로 파일럿 연구를 수행하면 AF 표현형 마우스는 유도 가능하지만 대조군 마우스는 유도되지 않는 연령 창을 결정할 수 있습니다. 한쪽 또는 양쪽 남녀가 유도성 AF9를 나타낼 수 있기 때문에 성별이 결정 요인이 될 수 있습니다. 또한, 특정 마우스는 한 가지 유형의 페이싱 모드에만 반응하여 AF 민감성을 나타낼 수 있는 반면, 다른 마우스는 다른 모드 또는 다중 모드에 대한 AF 민감성을 나타낸다9.
빠른 심방 페이싱 동안, 마우스는 종종 AF 유도와 일치하는 과도한 AV 차단을 경험할 수 있습니다. 이 현상은 후방 좌심방에 위치한 신경절 신경총의 부주의 한 자극으로 인해 부교감 신경 활성화9가 발생합니다. 상당한 AV 차단은 단일 페이싱 트레인의 ≥10% 지속되는 심실 서맥으로 정의되며 높은 자극 강도 및 짧은 페이싱 CL로 페이싱할 때 가장 자주 발생합니다. 이러한 유형의 부정맥 유도는 대조군 마우스에서 AF의 발생률을 증가시키고 실험 그룹 내에서 더 큰 부정맥 변동성을 유발합니다. 이러한 오염 특징을 감안할 때 이러한 조건에서 AF를 경험하는 동물은 분석에서 제외되어야 합니다.
TH ≤0.75 mA에도 불구하고 페이싱 중에 심오한 AV 블록이 발생하면 페이싱 진폭을 1.5x TH7로 줄이는 것이 합리적입니다. 또한, 예비 실험 중에 AF 표현형이 관찰되지 않는 경우, 최저 페이싱 CL16으로서 10ms를 사용하여 재시도하는 것을 생각할 수 있다. 획득 된 모델에 대해 12 주령에 AF 표현형이 관찰되지 않으면 표현형 성숙도 증가 효과를 조사하기 위해 격주 예비 연구를 고려하십시오20.
이 접근법의 한계는 이소 플루 란 마취의 사용이다. 이소플루란은 자율 기능21을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 이 효과는 비교적 짧은 노출에도 불구하고 배제할 수 없습니다. 이 프로토콜은 마우스에서 경식도 PES 방법을 개발하기위한 최적화 된 전략의 첫 번째 세부 보고서를 나타냅니다. 이 연구는 AF 감수성에 초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜의 향후 적용은 심실 부정맥22,23을 평가하는 데 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
그림 2 는 BioRender.com 로 작성되었습니다. 이 작업은 국립 보건원 (HL096844 및 HL133127)의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소의 보조금으로 지원되었습니다. 미국 심장 협회 (2160035, 18SFRN34230125 및 903918 [MBM]); 및 국립 보건원 (UL1 TR000445)의 번역 과학 발전을위한 국립 센터.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
References
- Sumitomo, N., et al. Association of atrial arrhythmia and sinus node dysfunction in patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation Journal. 71 (10), 1606-1609 (2007).
- Fukui, A., et al. Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin II-mediated atrial fibrosis and fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 6 (2), 402-409 (2013).
- Schutter, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Li, N., et al. Ryanodine receptor-mediated calcium leak drives progressive development of an atrial fibrillation substrate in a transgenic mouse model. Circulation. 129 (12), 1276-1285 (2014).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovascular Research. 50 (3), 463-473 (2001).
- Schrickel, J. W., et al. Induction of atrial fibrillation in mice by rapid transesophageal atrial pacing. Basic Research in Cardiology. 97 (6), 452-460 (2002).
- Verheule, S., et al. Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1. Circulation Research. 94 (11), 1458-1465 (2004).
- Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 313-320 (2014).
- Murphy, M. B., et al. Optimizing transesophageal atrial pacing in mice to detect atrial fibrillation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 332 (1), 36-43 (2022).
- Prinsen, J. K., et al. Highly reactive isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. JACC: Basic to Translational Science. 5 (6), 602-615 (2020).
- Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFα. Nature Communications. 6, 6018 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic termination of atrial fibrillation in mice. Cardiovascular Research. 114 (5), 713-723 (2017).
- Matsushita, N., et al. IL-1β plays an important role in pressure overload-induced atrial fibrillation in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 42 (4), 543-546 (2019).
- Sato, S., et al. Cardiac overexpression of perilipin 2 induces atrial steatosis, connexin 43 remodeling, and atrial fibrillation in aged mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 317 (6), 1193-1204 (2019).
- Li, N., Wehrens, X. H. T. Programmed electrical stimulation in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
- Yao, C., et al. Enhanced cardiomyocyte NLRP3 inflammasome signaling promotes atrial fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Purohit, A., et al. Oxidized Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II triggers atrial fibrillation. Circulation. 128 (16), 1748-1757 (2013).
- Jansen, H. J., et al. Atrial fibrillation in aging and frail mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 14 (9), 01077 (2021).
- Luo, T., et al. Characterization of atrial histopathological and electrophysiological changes in a mouse model of aging. International Journal of Molecular Medicine. 31 (1), 138-146 (2013).
- McCauley, M. D., et al. Ion channel and structural remodeling in obesity-mediated atrial fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 13 (8), 00896 (2020).
- Kato, M., et al. Spectral analysis of heart rate variability during isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 77 (4), 669-674 (1992).
- Schmeckpeper, J., et al. Abstract 11402: Targeting RyR2 to suppress ventricular arrhythmias and improve left ventricular function in chronic ischemic heart disease. Circulation. 144, Suppl_1 11402 (2021).
- Kim, K., et al. Abstract B-PO01-017: RyR2 hyperactivity promotes susceptibility to ventricular tachycardia in structural heart disease. Heart Rhythm. 18, Suppl_8 57 (2021).
