En calciumphosphatinduceret mus abdominal aortaaneurisme model

Summary

Denne protokol beskriver en calciumphosphatinduceret abdominal aortaaneurisme (AAA) musemodel for at studere de patologiske egenskaber og molekylære mekanismer i AAA'er.

Abstract

En abdominal aortaaneurisme (AAA) er en livstruende hjerte-kar-sygdom, der forekommer over hele verden og er karakteriseret ved irreversibel udvidelse af abdominal aorta. I øjeblikket anvendes flere kemisk inducerede murine AAA-modeller, der hver simulerer et andet aspekt af patogenesen af AAA. Den calciumphosphatinducerede AAA-model er en hurtig og omkostningseffektiv model sammenlignet med angiotensin II- og elastaseinducerede AAA-modeller. Anvendelsen af CaPO_4-krystaller på musens aorta resulterer i elastisk fibernedbrydning, tab af glatte muskelceller, betændelse og calciumaflejring forbundet med aortaudvidelse. Denne artikel introducerer en standardprotokol for den CaPO 4-inducerede AAA-model. Protokollen omfatter materialeforberedelse, kirurgisk anvendelse af CaPO₄ til adventitia af infrarenal abdominal aorta, høst af aortas for at visualisere aortaaneurismer og histologiske analyser hos mus.

Introduction

En abdominal aortaaneurisme (AAA) er en dødelig hjerte-kar-sygdom karakteriseret ved permanent udvidelse af abdominal aorta, med høj dødelighed, når brud opstår. AAA er forbundet med aldring, rygning, mandligt køn, hypertension og hyperlipidæmi¹. Flere patologiske processer har vist sig at bidrage til AAA-dannelse, herunder ekstracellulær matrixfiberproteolyse, immuncelleinfiltration og tab af vaskulære glatte muskelceller. I øjeblikket forbliver de patologiske mekanismer i AAA undvigende, og der er ingen dokumenterede lægemidler til behandling af AAA¹. Forskning i human AAA er begrænset på grund af eksistensen af få humane aortaprøver; således er flere kemiske modifikationsinducerede AAA-modeller for dyr blevet etableret og bredt vedtaget, herunder subkutan angiotensin II (AngII) infusion, perivaskulær eller intraluminal elastaseinkubation og perivaskulær calciumphosphatanvendelse². En almindeligt anvendt musemodel er anvendelsen af calciumphosphat (CaPO₄) til adventitia af den infrarenale abdominale aorta, hvilket er omkostningseffektivt og ikke kræver genetisk modifikation.

Direkte periaortisk anvendelse af CaCl₂ på halspulsåren hos kaniner for at fremkalde aneurismeændring blev oprindeligt rapporteret af Gertz et ^al.3 og blev senere anvendt på abdominal aortas hos mus. Modellen blev udviklet af Yamanouchi et al. for at fremskynde aortaudvidelse ved hjælp af CaPO 4-krystaller i mus₄. Infiltration af CaPO₄ i mus aortas rekapitulerer mange patologiske træk observeret i humane AAA'er, herunder dyb makrofaginfiltration, ekstracellulær matrixnedbrydning og calciumaflejring. Risikofaktorerne for human AAA, såsom hyperlipidæmi, øger også CaPO 4-induceret AAA hos mus⁵. I modsætning til AngII perfusionsinduceret AAA i ApoE-/- eller LDLR^-/- mus forekommer CaPO ^4-induceret AAA i det infrarenale aortaområde, som efterligner human AAA. I øjeblikket er denne metode blevet anvendt bredt til at vurdere modtagelighed for AAA-udvikling hos genetisk modificerede mus og evaluere anti-AAA-virkningerne af lægemidler ^6,7.

Protocol

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee of Peking University Health Science Center og blev godkendt af den biomedicinske etiske komité ved Peking University (LA2015142). Alle musene til operation blev bedøvet med isofluran (1,5% -2%), og anæstesi blev nøje overvåget for at undgå smerte eller ubehag for musene.

1. Forberedelse

1. Skær 0,3 cm brede strimler af pulverfri gummihandsker og gasbind.
2. Køb 8-10 uger gamle C57BL/6J hanmus. Hus dyrene i et klimatiseret miljø med en 12 timers lys-mørk cyklus og fri adgang til mad og vand.
3. Autoklave gaze, vatpinde, saks og tang inden operationen.
4. Få betadin, 70% ethanol og antiseptisk håndvask.
5. Tag maske, kjole og sterile handsker på.

2. Kirurgisk procedure

1. Foder tyggetabletter med carprofen (5 mg/kg dosis) til en 8-10 uger gammel C57BL/6J-mus 2-4 timer før operationen. Placer derefter musen i et induktionskammer (206 mm x 210 mm x 140 mm) med isofluran ved en strømningshastighed på 1,5% -2%.
   1. Overvåg musen i ca. 5 minutter, indtil åndedrættet er synligt bremset. Sørg for, at musen ikke reagerer på smertestimulering før operationen.
2. Påfør en oftalmisk salve på øjnene og sørg for termisk støtte med en varmepude eller tæppe. Bekræft dybden af anæstesi med en tåspids hvert 15. minut under den kirurgiske procedure.
3. Barber musens abdominale hår ved hjælp af en elektrisk klipper eller hårfjerningscreme. Svøm og tør det barberede område med betadin, efterfulgt af 70% ethanol, flere gange i en cirkulær bevægelse. Skift handsker for at opretholde sterilitet.
4. Brug saks til at lave et ~ 1,5 cm snit i underlivet langs underlivet langs underlinjen.
5. Brug en steril vatpind fugtet med normal saltvand til forsigtigt at fjerne tarmen, indtil den infrarenale aorta er synlig.
6. Dissekere bindevæv og fedt fra den infrarenale aorta i en ca. 0,5 cm sektion. Bemærk de små kar til dorsalsiden og undgå at rive dem. Der er ikke behov for at adskille abdominal aorta fra abdominal hovedvenen.
7. Pak et stykke af den saltvandsblødte gummihandskestrimmel under abdominal aorta og abdominal hovedvene. Brug en vatpind til at tørre overskydende væske af.
8. Pak et stykke gaze gennemblødt med 0,5 M CaCl₂ på adventitia af den infrarenale abdominale vaskulatur i 10 minutter. For sham mus-gruppen skal du udskifte 0,5 M CaCl₂ med normal saltvand.
9. Fjern gazen og pak endnu et stykke gaze gennemblødt med PBS-opløsning i 5 minutter for at generere CaPO_4-krystaller in situ i aortaens adventitia.
10. Fjern forsigtigt gummihandskestrimlen og gasbindet. Nulstil musens tarmkanal.
11. Sutur abdominal snit og hud med en 5-0 sutur.
12. Placer musen på en varmepude, indtil musen genvinder bevidstheden. Giv postkirurgisk smertegenvindingshus og analgesi, ifølge den lokale dyreetiske komité.
13. Hus musen i yderligere 14 dage. Overvåg musen nøje efter operationen og observer mindst 1x hver dag efterfølgende. Udfør en obduktion med det samme, hvis nogen mus dør i denne periode.

3. Høst til billeddannelse af aortas

1. 14 dage efter operationen ofres musene ved hjælp af CO₂.
2. Skær musens bryst- og bughulrum op ventralt og skær højre atrium op.
3. Perfuse musene med PBS-buffer gennem hjertets venstre ventrikel for at fjerne blod i aorta, og perfus derefter med 4% paraformaldehyd som tidligere beskrevet⁸.
4. Høst aorta under stereoskopet.
5. Anbring høstede aortaer i rør indeholdende 5 ml 4% paraformaldehyd i 48 timer.
6. Fjern adventitært væv og fedt forsigtigt under stereoskopet og fastgør aorta på en sort voksplade med insektnåle.
7. Anskaf aortabilleder.

4. Evaluering af nedbrydningen af de elastiske fibre

1. Skær aortaaneurismevævene i serielle kryosektioner (7 μm tykke).
2. Analyser de elastiske fibre ved hjælp af et kommercielt elastisk van Gieson (EVG) farvningssæt i henhold til producentens protokol.
3. Bedøm elastinnedbrydningen. Grad 1: <25% nedbrydning; klasse 2: 25% til 50% nedbrydning; grad 3: 50% til 75% nedbrydning; eller klasse 4: >75% nedbrydning.

Representative Results

14 dage efter CaPO_4-påføring blev C57BL/6J-hanmusene aflivet, og deres aortaer blev høstet og renset. Aortaernes morfologi blev afbildet for at visualisere AAA-dannelsen. Som vist i figur 1A-B førte anvendelsen af CaPO₄ til udvidelse af den infrarenale abdominale aorta. Histologisk resulterede CaPO₄ i en dramatisk nedbrydning af elastiske fibre, som illustreret ved elastinbrud (figur 1C).

Figur 1: De 8 uger gamle C57BL/6J-hanmus blev behandlet med saltvand (fup) eller CaPO₄ høstet efter 14 dage. (A) Repræsentative billeder af infrarenal abdominal aorta under et stereoskop. (B) repræsentative morfologibilleder af aortas fra mus; skalastang = 1 mm. (C) Repræsentative billeder af elastisk van Gieson-farvning af aortas. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Periaortisk anvendelse af CaPO₄ er en robust tilgang til at inducere AAA hos mus. Flere undersøgelser har brugt CaPO_4-modellen og konsekvent rapporteret, at dette er en hurtig og reproducerbar metode til at studere AAA hos mus ^7,9. Denne model anses for at rekapitulere en del af funktionerne i human aortaaneurisme og give mekanistisk indsigt i AAA-patogenese, herunder inflammation og ekstracellulær matrixnedbrydning.

Risikofaktorerne for human AAA omfatter hovedsageligt aldring, mandligt køn, rygning, hyperlipidæmi, hypertension og aterosklerose¹⁰. Selvom det ikke blev systematisk undersøgt, viste hyperlipidæmi sig også at prædisponere mus for AAA-ekspansion, når de brugte CaPO_4-modellen . I modsætning til mennesker spiller aldring en mindre rolle i AAA-dannelsen i musen CaPO₄ model⁵. Tidligere store epidemiologiske undersøgelser har vist, at diabetes er en uafhængig negativ risikofaktor for human AAA¹¹. Mens nogle data tyder på, at metformin, et diabetisk lægemiddel, forårsager denne virkning, er det alternativt af interesse, at hyperglykæmi i CaPO_4-modellen hæmmer aortaudvidelse ved undertrykkelse af makrofagaktivering¹².

I øjeblikket er der etableret flere kemisk inducerede murine AAA-modeller, herunder elastaseinkubation, CaPO 4-inkubation og subkutan AngII-perfusion². Generelt er elastase- og CaPO_4-modellerne blevet udført i 8-10 uger gamle mandlige vildtypemus, og AngII-modellen er blevet udført i hyperlipidæmimus (såsom ApoE-/- og LDLR-/- mus) eller ^5-6 måneder gamle mus for at inducere AAA¹³. Alle de tre modeller fænokopierer de vigtigste patologiske egenskaber ved human AAA, herunder elastisk fibernedbrydning og immuncelleinfiltration. Sammenlignet med de to andre modeller fører CaPO 4-applikationen til en hurtig og mere end 1,5 gange udvidelse af aorta 7 dage efter operationen, forbundet med dramatisk elastinnedbrydning og calciumaflejring₄. CaPO_4-modellen inducerer en fusiformudvidelse ved den infrarenale abdominale aorta, som efterligner den humane AAA-tilstand, mens AngII-perfusion inducerer både suprarenal AAA og thoraxaortaaneurisme. I betragtning af omkostningerne ved elastase, AngII og den osmotiske minipumpe er det mere omkostningseffektivt at udføre CaPO_4-modellen. Det er dog rimeligt at sige, at CaPO_4-modellen ikke kan inducere AAA-funktioner såsom dannelse af vægmaleri og aortabrud, og modellen er hurtig og dermed mindre egnet til at udføre interventionsstudier med eksisterende AAA. CaPO_4-modellen er ideel til at arbejde med genetisk modificerede mus for at vurdere modtagelighed for AAA-udvikling.

Mekanismen bag CaPO 4-induceret AAA-dannelse er endnu ikke fuldt belyst. Tidligere undersøgelser antyder, at calciumionen direkte kan binde til de vigtigste arterielle strukturelle komponenter, elastin og kollagen, hvilket letter ekstracellulær matrixnedbrydning og nedsat karvægsstabilitet¹⁴. CaPO_4-krystaller er også blevet identificeret til at udløse signifikant NOD-lignende receptorprotein 3 (NLRP3) inflammasomaktivering og glat muskelcelleapoptose ^4,15. Desuden er mikroforkalkningskrystaller i stand til at inducere mononukleære celler i osteoklastlignende celler og fremme matrixmetalloproteinase (MMP) produktion og kan i sidste ende resultere i aortaudvidelse¹⁶.

Når du udfører CaPO_4-modellen , skal flere problemer undgås for at forbedre succesraten. Man bør undgå at rive de dorsale gren blodkar, undgå tilsætning af overskydende CaCl₂ opløsning i bukhulen, og undgå en overdosis anæstesi. Mus med svær blødning under operationen eller med postoperativ infektion bør udelukkes fra forsøget. Som tidligere rapporteret, når antallet af observationer er tilstrækkeligt, fordeles de maksimale diametre for aortaerne i CaPO_4-modellen normalt normalt, hvilket er forskelligt fra AngII-modellen⁷. Derfor anbefaler vi en sammenligning af de maksimale diametre for aortas i stedet for AAA-forekomst, når du bruger CaPO_4-modellen .

Samlet set er CaPO 4-induceret mus AAA-model en hurtig og omkostningseffektiv tilgang til at udforske de molekylære mekanismer og terapeutiske strategier for AAA og kan anvendes parallelt med de andre modeller for fuldt ud at efterligne funktionerne i human AAA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Small animal ventilator	RWD	H1550501-012