Summary
このプロトコルは、AAAの病理学的特徴と分子メカニズムを研究するためのリン酸カルシウム誘発腹部大動脈瘤(AAA)マウスモデルについて説明しています。
Abstract
腹部大動脈瘤(AAA)は、世界中で発生する生命を脅かす心血管疾患であり、腹部大動脈の不可逆的な拡張を特徴としています。現在、いくつかの化学的に誘導されたマウスAAAモデルが使用されており、それぞれがAAAの病因の異なる側面をシミュレートしている。リン酸カルシウム誘導性AAAモデルは、アンジオテンシンIIおよびエラスターゼ誘導性AAAモデルと比較して、迅速かつ費用効果の高いモデルです。CaPO4 結晶をマウス大動脈に適用すると、弾性線維の分解、平滑筋細胞の喪失、炎症、および大動脈拡張に関連するカルシウム沈着が起こります。この記事では、CaPO4誘発AAAモデルの標準プロトコルを紹介します。プロトコルには、材料の準備、腎下腹部大動脈の外膜へのCaPO4の外科的適用、大動脈瘤を視覚化するための大動脈の採取、およびマウスの組織学的分析が含まれます。
Introduction
腹部大動脈瘤(AAA)は、腹部大動脈の永久的な拡張を特徴とする致命的な心血管疾患であり、破裂が発生すると死亡率が高くなります。AAAは、加齢、喫煙、男性の性別、高血圧、および高脂血症に関連しています1。細胞外マトリックス線維タンパク質分解、免疫細胞浸潤、血管平滑筋細胞の喪失など、いくつかの病理学的プロセスがAAA形成に寄与することが示されています。現在、AAAの病理学的メカニズムはとらえどころのないままであり、AAA1の治療のための証明された薬物はない。ヒトAAAの研究は、ヒト大動脈サンプルがほとんど存在しないために限られています。したがって、皮下アンジオテンシンII(AngII)注入、血管周囲または管腔内エラスターゼインキュベーション、および血管周囲リン酸カルシウムの適用を含む、いくつかの化学修飾誘発動物AAAモデルが確立され、広く採用されています2。一般的に使用されるマウスモデルは、リン酸カルシウム(CaPO4)を腎下腹部大動脈の外膜に適用することであり、これは費用効果が高く、遺伝子改変を必要としない。
動脈瘤変化を誘導するためのウサギの頸動脈へのCaCl2の直接大動脈周囲適用は、Gertzらによって最初に報告され3、後にマウスの腹部大動脈に適用された。このモデルは、マウス4のCaPO4結晶を使用して大動脈拡張を促進するために山之内らによって開発されました4。CaPO4のマウス大動脈への浸潤は、深いマクロファージ浸潤、細胞外マトリックスの分解、カルシウム沈着など、ヒトAAAで観察される多くの病理学的特徴を再現します。高脂血症などのヒトAAAの危険因子も、マウス5においてCaPO4誘導性AAAを増強する。ApoE-/-またはLDLR-/-マウスにおけるAngII灌流誘発AAAとは対照的に、CaPO4誘導性AAAは、ヒトAAAを模倣する腎下大動脈領域で生じる。現在、この方法は、遺伝子改変マウスにおけるAAA発生に対する感受性を評価し、薬物の抗AAA効果を評価するために広く適用されている6,7。
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Protocol
動物実験は、北京大学健康科学センターの施設動物管理および使用委員会のガイドラインに準拠して実施され、北京大学の生物医学倫理委員会(LA2015142)によって承認されました。手術用のすべてのマウスをイソフルラン(1.5%〜2%)で麻酔し、マウスの痛みや不快感を避けるために麻酔を注意深く監視しました。
1. 事前準備
- 幅0.3 cmのパウダーフリーゴム手袋とガーゼを切ります。
- 8〜10週齢のC57BL / 6Jオスマウスを購入します。12時間の明暗サイクルと食物と水への自由なアクセスを備えたエアコン付きの環境に動物を収容します。
- 手術前にガーゼ、綿棒、はさみ、鉗子をオートクレーブします。
- ベタジン、70%エタノール、消毒手洗いを入手してください。
- マスク、ガウン、滅菌手袋を着用してください。
2.外科的処置
- チュアブルカルプロフェン錠(5 mg / kg用量)を手術の2〜4時間前に8〜10週齢のC57BL / 6Jマウスに与えます。.次に、マウスをイソフルランを含む誘導チャンバー(206 mm x 210 mm x 140 mm)に1.5%〜2%の流速で置きます。
- 呼吸が目に見えて遅くなるまで、マウスを約5分間監視します。手術前にマウスが痛みの刺激に反応しないことを確認してください。
- 眼科用軟膏を目に塗り、加熱パッドまたは毛布で熱サポートを提供します。手術中は15分ごとにつま先をつまんで麻酔の深さを確認します。
- 電気バリカンまたは脱毛クリームを使用してマウスの腹毛を剃ります。剃った部分をベタジンで拭き取り、続いて70%エタノールを円を描くように数回拭きます。無菌性を維持するために手袋を交換してください。
- はさみを使用して、腹部の正中線に沿って下腹部を~1.5 cm切開します。
- 通常の生理食塩水で湿らせた滅菌綿棒を使用して、腎下大動脈が見えるまで腸を慎重に取り除きます。
- 腎下大動脈から結合組織と脂肪を約0.5cmの切片で解剖します。背側の小さな血管に注意し、それらを引き裂かないようにしてください。腹部大動脈を腹部主静脈から分離する必要はありません。
- 生理食塩水に浸したゴム手袋を腹部大動脈と腹部主静脈の下に詰めます。綿棒を使用して余分な液体を拭き取ります。
- 0.5 M CaCl2 を浸したガーゼを腎下腹部血管系の外膜に10分間詰めます。偽マウス群については、0.5 M CaCl2 を生理食塩水と交換します。
- ガーゼを取り出し、PBS溶液に浸した別のガーゼを5分間詰めて、大動脈の外膜にその場でCaPO4結晶を生成します。
- ゴム手袋ストリップとガーゼを慎重に取り外します。マウスの腸管をリセットします。
- 腹部切開と皮膚を5-0縫合糸で縫合します。
- マウスが意識を取り戻すまで、マウスを加熱パッドの上に置きます。地元の動物倫理委員会によると、術後の痛みの回復住宅と鎮痛を提供します。
- マウスをさらに14日間収容します。手術後にマウスを注意深く監視し、その後毎日少なくとも1回観察します。この期間中にマウスが死亡した場合は、すぐに剖検を行います。
3. 大動脈イメージングのための採取
- 手術の14日後に、CO2を用いてマウスを屠殺する。
- マウスの胸腔と腹腔を腹側に切り開き、右心房を切り開きます。
- 心臓の左心室を通してPBS緩衝液でマウスを灌流して大動脈の血液を除去し、次に前述のように4%パラホルムアルデヒドで灌流します8。
- ステレオスコープの下で大動脈を収穫します。
- 採取した大動脈を5 mLの4%パラホルムアルデヒドを含むチューブに48時間入れます。
- ステレオスコープの下で外膜組織と脂肪を慎重に取り除き、昆虫の針で黒いワックスプレートに大動脈を固定します。
- 大動脈画像を取得します。
4. 弾性繊維の劣化評価
- 大動脈瘤組織を連続凍結切開(厚さ7μm)に切断します。
- メーカーのプロトコルに従って、市販の弾性バンギーソン(EVG)染色キットを使用して弾性繊維を分析します。
- エラスチン分解を評価します。グレード1:<25%の劣化。グレード2:25%から50%の劣化。グレード3:50%から75%の劣化。またはグレード4:>75%の劣化。
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Representative Results
CaPO4投与の14日後、C57BL/6J雄マウスを安楽死させ、大動脈を採取して洗浄した。大動脈の形態を画像化し、AAA形成を可視化した。図1A-Bに示すように、CaPO4の適用は腹部下大動脈の拡張をもたらした。組織学的には、CaPO4は、エラスチンの切断によって示されるように、弾性繊維の劇的な分解をもたらした(図1C)。
図1:8週齢の雄C57BL/6Jマウスを、14日後に採取した生理食塩水(偽)またはCaPO4で処理した。 (A)ステレオスコープ下での腹部下大動脈の代表的な画像。(B)マウス由来の大動脈の代表的な形態像;スケールバー= 1 mm。 (C)大動脈の弾性ファンギーソン染色の代表的な画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
CaPO4の周囲への適用は、マウスにおいてAAAを誘導するための堅牢なアプローチである。いくつかの研究はCaPO4モデルを使用しており、これがマウス7,9でAAAを研究するための迅速かつ再現性のある方法であることを一貫して報告しています。このモデルは、ヒト大動脈瘤の特徴の一部を要約し、炎症や細胞外マトリックスの分解を含むAAAの病因に関する機構的な洞察を提供すると考えられています。
ヒトAAAの危険因子には、主に加齢、男性の性別、喫煙、高脂血症、高血圧、およびアテローム性動脈硬化症が含まれます10。体系的に研究されていないが、高脂血症は、CaPO4モデルを使用した場合、マウスにAAA拡大の素因があることもわかりました。ヒトとは異なり、加齢はマウスCaPO4モデル5におけるAAA形成において小さな役割を果たす。以前の大規模な疫学研究では、糖尿病がヒトAAA11の独立した負の危険因子であることが示されています。糖尿病治療薬であるメトホルミンがこの効果を引き起こすことを示唆するデータもありますが、代わりに、CaPO4モデルでは、高血糖がマクロファージ活性化の抑制によって大動脈拡張を阻害することが興味深い12。
現在、エラスターゼインキュベーション、CaPO4インキュベーション、皮下AngII灌流2など、いくつかの化学的に誘導されたマウスAAAモデルが確立されています。一般に、エラスターゼおよびCaPO4モデルは、8〜10週齢の雄野生型マウスにおいて実施されており、AngIIモデルは、高脂血症マウス(ApoE−/−およびLDLR−/−マウスなど)または5〜6ヶ月齢マウスにおいてAAA13を誘導するために実施されている。3つのモデルはすべて、弾性線維分解および免疫細胞浸潤を含むヒトAAAの主要な病理学的特徴を表現コピーした。他の2つのモデルと比較して、CaPO4の適用は、劇的なエラスチン分解およびカルシウム沈着に関連する、手術後7日目の大動脈の急速かつ1.5倍以上の拡張をもたらす4。CaPO4モデルは、ヒトAAA状態を模倣する腹部下大動脈に紡錘状拡張を誘発しますが、AngII灌流は腎上AAAと胸部大動脈瘤の両方を誘発します。エラスターゼ、AngII、および浸透圧ミニポンプのコストを考慮すると、CaPO4モデルを実行する方が費用効果が高くなります。ただし、CaPO4モデルは壁血栓形成や大動脈破裂などのAAA機能を誘発できず、モデルは迅速であるため、既存のAAAで介入研究を行うのにはあまり適していないと言っても過言ではありません。CaPO4モデルは、遺伝子組み換えマウスを用いてAAA発生に対する感受性を評価するのに理想的です。
CaPO4誘導性AAA形成のメカニズムはまだ完全には解明されていません。以前の研究では、カルシウムイオンが主要な動脈構造成分であるエラスチンとコラーゲンに直接結合し、細胞外マトリックスの分解を促進し、血管壁の安定性を低下させる可能性があることが示唆されています14。CaPO4結晶は、有意なNOD様受容体タンパク質3(NLRP3)インフラマソーム活性化および平滑筋細胞アポトーシスを引き起こすことも同定されている4、15。さらに、微小石灰化結晶は、単核球を破骨細胞様細胞に誘導し、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)産生を促進することができ、最終的には大動脈拡張をもたらす可能性があります16。
CaPO4モデルを実行する場合、成功率を向上させるためにいくつかの問題を回避する必要があります。背側枝血管を引き裂くことを避け、腹腔内に過剰なCaCl2溶液を添加することを避け、そして麻酔の過剰投与を避けるべきである。手術中または術後感染を伴う重度の出血のあるマウスは、実験から除外する必要があります。既報のとおり、観測数が十分であれば、CaPO4モデルの大動脈の最大直径は通常正規分布しており、AngIIモデル7とは異なります。したがって、CaPO4モデルを使用する場合は、AAA発生率ではなく大動脈の最大直径を比較することをお勧めします。
全体として、CaPO4誘導マウスAAAモデルは、AAAの分子メカニズムと治療戦略を探求するための迅速かつ費用効果の高いアプローチであり、他のモデルと並行して適用して、ヒトAAAの特徴を完全に模倣することができます。
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Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC、81730010、91839302、81921001、31930056、91529203)および中国国家重点研究開発プログラム(2019YFA 0801600)からの資金提供によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | MECKLIN | C805225 | |
| NaCl | Biomed | SH5001-01 | |
| PBS | HARVEYBIO | MB5051 | |
| Small animal ventilator | RWD | H1550501-012 |
References
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