Summary
Detta protokoll beskriver en kalciumfosfatinducerad bukaortaaneurysm (AAA) musmodell för att studera de patologiska egenskaperna och molekylära mekanismerna hos AAA.
Abstract
En bukaortaaneurysm (AAA) är en livshotande hjärt-kärlsjukdom som uppträder över hela världen och kännetecknas av irreversibel utvidgning av bukaorta. För närvarande används flera kemiskt inducerade murina AAA-modeller, var och en simulerar en annan aspekt av patogenesen av AAA. Den kalciumfosfatinducerade AAA-modellen är en snabb och kostnadseffektiv modell jämfört med angiotensin II- och elastasinducerade AAA-modeller. Appliceringen av CaPO4-kristaller på musaortan resulterar i elastisk fibernedbrytning, förlust av glattmuskelceller, inflammation och kalciumavsättning i samband med aortautvidgning. Den här artikeln introducerar ett standardprotokoll för CaPO4-inducerad AAA-modell. Protokollet inkluderar materialberedning, kirurgisk applicering av CaPO4 på adventitia av den infrarenala bukaortan, skörden av aortor för att visualisera aortaaneurysmer och histologiska analyser hos möss.
Introduction
En bukaortaaneurysm (AAA) är en dödlig hjärt-kärlsjukdom som kännetecknas av permanent utvidgning av bukaorta, med hög dödlighet när bristning inträffar. AAA är associerad med åldrande, rökning, manligt kön, hypertoni och hyperlipidemi1. Flera patologiska processer har visat sig bidra till AAA-bildning, inklusive extracellulär matrisfiberproteolys, immuncellsinfiltration och förlust av vaskulära glattmuskelceller. För närvarande förblir de patologiska mekanismerna för AAA svårfångade, och det finns inga beprövade läkemedel för behandling av AAA1. Forskning om human AAA är begränsad på grund av förekomsten av få humana aortaprover; Således har flera kemiska modifieringsinducerade AAA-modeller för djur etablerats och antagits i stor utsträckning, inklusive subkutan angiotensin II (AngII) infusion, perivaskulär eller intraluminal elastasinkubation och perivaskulär kalciumfosfatapplikation2. En vanligt förekommande musmodell är appliceringen av kalciumfosfat (CaPO4) på adventitia i den infrarenala bukaortan, vilket är kostnadseffektivt och inte kräver genetisk modifiering.
Direkt periaortisk applicering av CaCl2 på halspulsådern hos kaniner för att inducera aneurysmal förändring rapporterades ursprungligen av Gertz et al.3 och appliceradessenare på bukaorta hos möss. Modellen utvecklades av Yamanouchi et al. för att påskynda aortautvidgningen genom att använda CaPO 4-kristaller i möss4. Infiltration av CaPO4 i mössaortor rekapitulerar många patologiska egenskaper som observerats hos humana AAA, inklusive djup makrofaginfiltration, extracellulär matrisnedbrytning och kalciumavsättning. Riskfaktorerna för humant AAA, såsom hyperlipidemi, förstärker också CaPO4-inducerad AAA hos möss5. I motsats till AngII-perfusionsinducerad AAA hos ApoE-/- eller LDLR-/- möss förekommer CaPO 4-inducerad AAA i den infrarenala aortaregionen, som efterliknar human AAA. För närvarande har denna metod använts i stor utsträckning för att bedöma mottaglighet för AAA-utveckling hos genetiskt modifierade möss och utvärdera anti-AAA-effekterna av läkemedel 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstudier utfördes i enlighet med riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee vid Peking University Health Science Center och godkändes av Biomedical Ethics Committee of Peking University (LA2015142). Alla möss för operation bedövades med isofluran (1,5% -2%), och anestesi övervakades noggrant för att undvika smärta eller obehag för mössen.
1. Förberedelse
- Skär 0,3 cm breda remsor av pulverfria gummihandskar och gasväv.
- Köp 8-10 veckor gamla C57BL/6J hanmöss. Inhys djuren i en luftkonditionerad miljö med en 12 timmars ljus-mörk cykel och fri tillgång till mat och vatten.
- Autoklavera gasväv, bomullspinne, sax och pincett före operationen.
- Skaffa betadin, 70% etanol och antiseptisk handtvätt.
- Ta på dig en mask, klänning och sterila handskar.
2. Kirurgiskt ingrepp
- Mata tuggbara karprofentabletter (5 mg/kg dos) till en 8-10 veckor gammal C57BL/6J mus 2-4 h före operation. Placera sedan musen i en induktionskammare (206 mm x 210 mm x 140 mm) med isofluran med en flödeshastighet på 1,5% -2%.
- Övervaka musen i cirka 5 minuter tills andningen är synligt långsammare. Se till att musen inte har något svar på smärtstimulering före operationen.
- Applicera en oftalmisk salva på ögonen och ge termiskt stöd med en värmepanna eller filt. Bekräfta djupet av anestesi med en tå nypa var 15: e minut under det kirurgiska ingreppet.
- Raka musens bukhår med en elektrisk klippare eller hårborttagningskräm. Svabba och torka av det rakade området med betadin, följt av 70% etanol, flera gånger i en cirkulär rörelse. Byt handskar för att bibehålla sterilitet.
- Använd sax för att göra ett ~ 1,5 cm snitt vid underlivet längs bukens mittlinje.
- Använd en steril bomullspinne fuktad med normal saltlösning för att försiktigt ta bort tarmen tills den infrarenala aortan är synlig.
- Dissekera bindväven och fettet från den infrarenala aortan i en sektion på cirka 0,5 cm. Notera de små kärlen på ryggsidan och undvik att riva dem. Det finns inget behov av att separera bukaortan från bukens huvudven.
- Packa en bit av den saltindränkta gummihandskremsan under bukaortan och bukens huvudven. Använd en bomullspinne för att torka bort överflödig vätska.
- Packa en bit gasväv blöt med 0,5 M CaCl2 på adventitia av den infrarenala bukkärlen i 10 min. För skenmusgruppen, ersätt 0,5 M CaCl2 med normal saltlösning.
- Ta bort gasbindningen och packa en annan bit gasväv som blötläggs med PBS-lösning i 5 minuter för att generera CaPO 4-kristaller på plats i aortans adventitia.
- Ta försiktigt bort gummihandskremsan och gasväven. Återställ musens tarmkanal.
- Suturera buksnittet och huden med en 5-0 sutur.
- Placera musen på en värmedyna tills musen återfår medvetandet. Ge posturgisk smärtåterhämtning och analgesi, enligt den lokala djuretiska kommittén.
- Hus musen i ytterligare 14 dagar. Övervaka musen noggrant efter operationen och observera minst 1x varje dag därefter. Utför en obduktion omedelbart om några möss dör under denna period.
3. Skörd för avbildning av aorta
- 14 dagar efter operationen, offra mössen med CO2.
- Skär upp musens bröstkorgs- och bukhålor ventralt och skär upp det högra förmaket.
- Perfuse mössen med PBS-buffert genom hjärtans vänstra kammare för att ta bort blod i aortan och sedan perfusa med 4% paraformaldehyd som tidigare beskrivits8.
- Skörda aortan under stereoskopet.
- Placera skördade aortor i rör som innehåller 5 ml 4% paraformaldehyd i 48 timmar.
- Ta bort adventitial vävnad och fett försiktigt under stereoskopet och stifta aortan på en svart vaxplatta med insektsnålar.
- Skaffa aortabilder.
4. Utvärdering av nedbrytningen av de elastiska fibrerna
- Skär aortaaneurysmvävnaderna i seriella kryosektioner (7 μm tjocka).
- Analysera de elastiska fibrerna med hjälp av en kommersiell elastisk van Gieson (EVG) färgningssats enligt tillverkarens protokoll.
- Gradera elastinnedbrytningen. Grad 1: <25% nedbrytning; grad 2: 25% till 50% nedbrytning; grad 3: 50% till 75% nedbrytning; eller grad 4: >75% nedbrytning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
14 dagar efter appliceringen av CaPO4 avlivades C57BL/6J-hanmössen och deras aortor skördades och rengjordes. Aortas morfologi avbildades för att visualisera AAA-bildning. Som visas i figur 1A-B ledde appliceringen av CaPO4 till utvidgning av den infrarenala bukaortan. Histologiskt resulterade CaPO4 i en dramatisk nedbrytning av elastiska fibrer, vilket illustreras av elastinbrott (figur 1C).
Figur 1: De 8 veckor gamla hanmössen C57BL/6J behandlades med saltlösning (bluff) eller CaPO4 skördad efter 14 dagar. (A) Representativa bilder av infrarenal abdominal aorta under ett stereoskop. B) Representativa morfologiska bilder av aortor från möss. skalstång = 1 mm. (C) Representativa bilder av elastisk van Gieson-färgning av aortor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Periaortisk applicering av CaPO4 är ett robust tillvägagångssätt för att inducera AAA hos möss. Flera studier har använt CaPO4-modellen och konsekvent rapporterat att detta är en snabb och reproducerbar metod för att studera AAA hos möss 7,9. Denna modell anses rekapitulera en del av egenskaperna hos humant aortaaneurysm och ge mekanistiska insikter i AAA-patogenes, inklusive inflammation och extracellulär matrisnedbrytning.
Riskfaktorerna för human AAA inkluderar främst åldrande, manligt kön, rökning, hyperlipidemi, hypertoni och åderförkalkning10. Även om det inte studerades systematiskt, visade sig hyperlipidemi också predisponera möss för AAA-expansion vid användning av CaPO4-modellen . Till skillnad från människor spelar åldrande en mindre roll i AAA-bildning i musen CaPO4 modell5. Tidigare stora epidemiologiska studier har visat att diabetes är en oberoende negativ riskfaktor för humant AAA11. Medan vissa data tyder på att metformin, ett diabetesläkemedel, orsakar denna effekt, är det alternativt av intresse att hyperglykemi i CaPO4-modellen hämmar aortautvidgning genom undertryckande av makrofagaktivering12.
För närvarande har flera kemiskt inducerade murina AAA-modeller etablerats, inklusive elastasinkubation, CaPO 4-inkubation och subkutan AngII-perfusion2. I allmänhet har elastas- och CaPO4-modellerna utförts på 8-10 veckor gamla hanmöss av vildtyp, och AngII-modellen har utförts på hyperlipidemimöss (såsom ApoE-/- och LDLR-/- möss) eller 5-6 månader gamla möss för att inducera AAA13. Alla de tre modellerna fenoskopi de viktigaste patologiska egenskaperna hos human AAA, inklusive elastisk fibernedbrytning och immuncellinfiltration. Jämfört med de andra två modellerna leder CaPO 4-applikationen till en snabb och mer än 1,5-faldig expansion av aortan 7 dagar efter operationen, förknippad med dramatisk elastinnedbrytning och kalciumavsättning4. CaPO4-modellen inducerar en fusiform utvidgning vid den infrarenala bukaortan, som efterliknar det humana AAA-tillståndet, medan AngII-perfusion inducerar både suprarenal AAA och thoraxaortaaneurysm. Med tanke på kostnaden för elastas, AngII och den osmotiska minipumpen är det mer kostnadseffektivt att utföra CaPO4-modellen. Det är dock rättvist att säga att CaPO4-modellen inte kan inducera AAA-funktioner som väggmålningstrombbildning och aortabrott, och modellen är snabb och därmed mindre lämplig för att utföra interventionsstudier med befintlig AAA. CaPO4-modellen är idealisk för att arbeta med genetiskt modifierade möss för att bedöma mottaglighet för AAA-utveckling.
Mekanismen bakom CaPO4-inducerad AAA-bildning har inte helt belysts ännu. Tidigare studier antyder att kalciumjonen direkt kan binda till de viktigaste arteriella strukturella komponenterna, elastin och kollagen, vilket underlättar extracellulär matrisnedbrytning och minskad kärlväggsstabilitet14. CaPO4-kristaller har också identifierats för att utlösa signifikant NOD-liknande receptorprotein 3 (NLRP3) inflammasomaktivering och glattmuskelcellsapoptos 4,15. Dessutom kan mikroförkalkningskristaller inducera mononukleära celler till osteoklasterliknande celler och främja produktion av matrismetalloproteinas (MMP) och kan i slutändan resultera i aortaexpansion16.
När du utför CaPO4-modellen måste flera problem undvikas för att förbättra framgångsgraden. Man bör undvika att riva dorsalgrenens blodkärl, undvika tillsats av överskott av CaCl2-lösning i bukhålan och undvika överdosering av anestesi. Möss med svår blödning under operationen eller med postoperativ infektion bör uteslutas från experimentet. Som tidigare rapporterats, när antalet observationer är tillräckligt, fördelas vanligtvis de maximala diametrarna för aortorna i CaPO4-modellen , vilket skiljer sig från AngII-modellen7. Därför rekommenderar vi en jämförelse av de maximala diametrarna för aorta istället för AAA-incidens vid användning av CaPO4-modellen .
Sammantaget är CaPO4-inducerade möss AAA-modellen ett snabbt och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att utforska de molekylära mekanismerna och terapeutiska strategierna för AAA och kan tillämpas parallellt med de andra modellerna för att fullt ut imitera funktionerna hos human AAA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av finansiering från National Natural Science Foundation of China (NSFC, 81730010, 91839302, 81921001, 31930056 och 91529203) och National Key R&D Program of China (2019YFA 0801600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | MECKLIN | C805225 | |
| NaCl | Biomed | SH5001-01 | |
| PBS | HARVEYBIO | MB5051 | |
| Small animal ventilator | RWD | H1550501-012 |
References
- Kent, K. C. Abdominal aortic aneurysms. The New England Journal of Medicine. 371, 2101-2108 (2014).
- Patelis, N., et al. Animal models in the research of abdominal aortic aneurysms development. Physiological Research. 66 (6), 899-915 (2017).
- Gertz, S. D., Kurgan, A., Eisenberg, D. Aneurysm of the rabbit common carotid artery induced by periarterial application of calcium-chloride in vivo. Journal of Clinical Investigation. 81 (3), 649-656 (1988).
- Yamanouchi, D., et al. Accelerated aneurysmal dilation associated with apoptosis and inflammation in a newly developed calcium phosphate rodent abdominal aortic aneurysm model. Journal of Vascular Surgery. 56 (2), 455-461 (2012).
- Wang, Y. T., et al. Influence of apolipoprotein E, age and aortic site on calcium phosphate induced abdominal aortic aneurysm in mice. Atherosclerosis. 235 (1), 204-212 (2014).
- Zhao, G., et al. Unspliced xbp1 confers VSMC homeostasis and prevents aortic aneurysm formation via foxo4 interaction. Circulation Research. 121 (12), 1331-1345 (2017).
- Jia, Y., et al. Targeting macrophage TFEB-14-3-3 epsilon interface by naringenin inhibits abdominal aortic aneurysm. Cell Discovery. 8 (1), 21 (2022).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Yu, B., et al. CYLD deubiquitinates nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4 contributing to adventitial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1698-1709 (2017).
- Altobelli, E., Rapacchietta, L., Profeta, V. F., Fagnano, R. Risk factors for abdominal aortic aneurysm in population-based studies: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2805 (2018).
- Theivacumar, N. S., Stephenson, M. A., Mistry, H., Valenti, D. Diabetes mellitus and aortic aneurysm rupture: A favorable association. Vascular and Endovascular Surgery. 48 (1), 45-50 (2014).
- Tanaka, T., Takei, Y., Yamanouchi, D. Hyperglycemia suppresses calcium phosphate-induced aneurysm formation through inhibition of macrophage activation. Journal of the American Heart Association. 5 (3), 003062 (2016).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Urry, D. W. Neutral sites for calcium ion binding to elastin and collagen: A charge neutralization theory for calcification and its relationship to atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (4), 810-814 (1971).
- Li, Z. Q., et al. Runx2 (runt-related transcription factor 2)-mediated microcalcification is a novel pathological characteristic and potential mediator of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (5), 1352-1369 (2020).
- Kelly, M. J., Igari, K., Yamanouchi, D. Osteoclast-like cells in aneurysmal disease exhibit an enhanced proteolytic phenotype. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4689 (2019).
