Summary
L’infection par le virus de la grippe A (IAV) active les caspases qui clivent les protéines de l’hôte et les protéines virales, qui, à leur tour, ont des fonctions provirales et antivirales. En utilisant des inhibiteurs, l’interférence ARN, la mutagénèse dirigée et des techniques de transfert Western et de RT-qPCR, les caspases dans les cellules de mammifères infectées qui clivent la cortactine de l’hôte et les histone désacétylases ont été identifiées.
Abstract
Les caspases, une famille de cystéines protéases, orchestrent la mort cellulaire programmée en réponse à divers stimuli, y compris les infections microbiennes. Initialement décrite comme se produisant par apoptose, la mort cellulaire programmée est maintenant connue pour englober trois voies interconnectées: la pyroptose, l’apoptose et la nécroptose, inventées ensemble comme un seul processus, PANoptosis. L’infection virale Influence A (IAV) induit une panoptique dans les cellules de mammifères en induisant l’activation de différentes caspases, qui, à leur tour, clivent diverses protéines hôtes et virales, conduisant à des processus tels que l’activation de la réponse antivirale innée de l’hôte ou la dégradation des protéines antagonistes de l’hôte. À cet égard, le clivage médié par la caspase 3 de la cortactine de l’hôte, de l’histone désacétylase 4 (HDAC4) et de l’histone désacétylase 6 (HDAC6) a été découvert dans des cellules épithéliales animales et humaines en réponse à l’infection par le VIA. Pour démontrer cela, des inhibiteurs, des interférences ARN et une mutagénèse dirigée ont été utilisés et, par la suite, le clivage ou la résistance au clivage et la récupération des polypeptides cortactin, HDAC4 et HDAC6 ont été mesurés par transfert Western. Ces méthodes, associées à la RT-qPCR, constituent une stratégie simple mais efficace pour identifier l’hôte ainsi que les protéines virales subissant un clivage médié par la caspase lors d’une infection par le virus IAV ou d’autres virus humains et animaux. Le présent protocole élabore les résultats représentatifs de cette stratégie, et les moyens de la rendre plus efficace sont également discutés.
Introduction
Le virus de la grippe A (IAV) est le membre prototypique de la famille des Orthomyxoviridae et est connu pour causer des épidémies mondiales et des pandémies imprévisibles. L’IAV provoque une maladie respiratoire humaine, la grippe, communément appelée « grippe ». La grippe est une maladie aiguë qui entraîne l’induction de réponses immunitaires innées pro et anti-inflammatoires de l’hôte et la mort des cellules épithéliales dans les voies respiratoires humaines. Les deux processus sont régis par un phénomène appelé mort cellulaire programmée1. La signalisation de la mort cellulaire programmée est induite dès que divers récepteurs de reconnaissance des agents pathogènes détectent les particules virales entrantes dans les cellules hôtes. Cela conduit à la programmation de la mort des cellules infectées et à la signalisation aux cellules saines voisines par trois voies interconnectées appelées pyroptose, apoptose et nécroptose - récemment inventées comme un seul processus, PANoptosis1.
PANoptosis implique le traitement protéolytique de nombreuses protéines hôtes et virales de l’induction à l’exécution. Un tel traitement des protéines est principalement mené par une famille de cystéines protéases appelées caspases 1,2. Jusqu’à 18 caspases (de la caspase 1 à la caspase 18) sont connues3. La plupart des caspases sont exprimées en pro-caspases et activées en subissant leur propre traitement protéolytique soit par autocatalyse, soit par d’autres caspases4 en réponse à un stimulus comme une infection virale. On pensait que la panoptique des cellules infectées par IAV était un mécanisme de défense de l’hôte, mais l’IAV a mis au point des moyens de l’échapper et de l’exploiter pour faciliter sa réplication 1,2,5,6. L’une d’entre elles consiste à antagoniser les facteurs de l’hôte par le biais d’un clivage ou d’une dégradation médiée par la caspase qui sont intrinsèquement antiviraux ou interfèrent avec l’une des étapes du cycle de vie de l’IAV. À cette fin, on a découvert que les facteurs de l’hôte, la cortactine, HDAC4 et HDAC6 subissent un clivage ou une dégradation médiée par la caspase dans les cellules épithéliales infectées par l’IAV 7,8,9. Les HDAC4 et HDAC6 sont des facteurs anti-IAV 8,10, et la cortactine interfère avec la réplication de l’IAV à un stade ultérieur de l’infection, potentiellement pendant l’assemblage viral et le bourgeonnement 11.
En outre, diverses caspases sont également activées, qui, à leur tour, clivent plusieurs protéines pour activer la réponse inflammatoire de l’hôte lors de l’infection IAV 1,2. En outre, la nucléoprotéine (NP), la protéine M2 des canaux ioniques IAV 12,13,14 et diverses protéines d’autres virus 3,15,16 subissent également un clivage médié par la caspase au cours de l’infection, ce qui influence la pathogenèse virale. Par conséquent, il existe un besoin continu d’étudier le clivage ou la dégradation médiée par la caspase des protéines de l’hôte et des protéines virales au cours de l’IAV et d’autres infections virales pour comprendre la base moléculaire de la pathogenèse virale. Ici, les méthodes sont présentées pour (1) évaluer le clivage ou la dégradation de ces protéines par les caspases, (2) identifier ces caspases, et (3) localiser les sites de clivage.
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Protocol
Les approbations réglementaires ont été obtenues du comité institutionnel de sécurité biologique de l’Université d’Otago pour travailler avec l’IAV et les cellules de mammifères. Les cellules A549 alvéolaires alvéolaires du rein canin Madin-Darby (MDCK) ou du poumon humain et les sous-types IAV H1N1 ont été utilisés pour la présente étude. IAV a été cultivé dans des œufs de poule, comme décrit ailleurs17. Des conditions stériles et aseptiques ont été utilisées pour travailler avec des cellules de mammifères, et une installation de niveau de biosécurité 2 (ou confinement physique 2) et une enceinte de biosécurité de classe II ont été utilisées pour travailler avec des sous-types de VAI.
1. Évaluation du clivage ou de la dégradation des protéines dans les cellules infectées par l’IAV par les caspases
- Ensemencer 3 x 105 cellules MDCK ou A549 par puits dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits.
REMARQUE: Si vous utilisez des cellules MDCK, assurez-vous que l’anticorps contre la protéine d’intérêt reconnaît son espèce canine. - Ensemencer les puits par paires, c’est-à-dire une paire témoin - un puits pour l’échantillon simulé non infecté et un pour l’échantillon simulé infecté - et une paire d’essais - un puits pour l’échantillon A inhibiteur non infecté et un pour l’échantillon infecté-inhibiteur A. Augmenter le nombre de paires avec chaque inhibiteur supplémentaire (voir références 7,8).
- Incuber les cellules à 37 °C sous une atmosphère de 5% de CO2 pendant une nuit.
- Le lendemain, infectez les cellules avec IAV (un sous-type H1N1 ou un autre sous-type).
- Pour cela, préparer l’inoculum du virus en diluant le stock de virus dans 400 μL de milieu essentiel (MEM) minimum sans sérum (MEM) (voir le tableau des matériaux) à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,5 à 3,0 unités plaqueuses (pfu)/cellule 7,11 (un facteur du doublement du nombre de cellules lors du calcul de l’MOI).
NOTE: Pour infecter les cellules MDCK, compléter l’inoculum du virus avec tosyl phénylalanyl chlorométhylcétone (TPCK)-trypsine à une concentration finale de 1 μg/mL.
- Pour cela, préparer l’inoculum du virus en diluant le stock de virus dans 400 μL de milieu essentiel (MEM) minimum sans sérum (MEM) (voir le tableau des matériaux) à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,5 à 3,0 unités plaqueuses (pfu)/cellule 7,11 (un facteur du doublement du nombre de cellules lors du calcul de l’MOI).
- Retirer l’ancien milieu de culture des cellules (étape 1.3) et laver les cellules avec 1 mL/puits de MEM 2x sans sérum.
- Ajouter 400 μL d’inoculum viral (étape 1.4.1) aux cellules et les incuber pendant 1 h à 35 °C sous une atmosphère de CO2 à 5%.
- Entre-temps, diluer un inhibiteur de la caspase (p. ex. Z-DEVD-FMK), un inhibiteur du lysosome (p. ex.NH4Cl) ou un inhibiteur du protéasome (p. ex. MG132) (voir le tableau des matières) à une concentration finale de 40 μM, 20 mM ou 10 μM, respectivement, dans le MEM7 sans sérum (voir le tableau des matériaux). Les deux derniers inhibiteurs servent de contrôle. Diluer un volume égal du solvant (s’il n’est pas de l’eau) utilisé pour reconstituer l’un des inhibiteurs dans un milieu sans sérum comme un simulacre.
- Retirer l’inoculum du virus et laver les cellules comme à l’étape 1.5 (1x).
- Ajouter le MEM sans sérum, 1 mL/puits, simulé ou complété par un inhibiteur, aux cellules et incuber les cellules comme à l’étape 1.6. Ce point temporel est considéré comme une infection de 0 h.
- Après 24 h, récoltez les cellules en les grattant avec un piston de seringue de 1 mL (côté caoutchouc) et transférez-les dans un tube en polypropylène de 1,5 mL.
- Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 1-2 min à température ambiante. Recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette.
REMARQUE : Ce surnageant pourrait être jeté ou utilisé pour un essai de plaque8 afin de mesurer le titre de la descendance virale libérée. - Laver la pastille cellulaire avec 250 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par recentrifugation comme à l’étape 1.11.
- Retirer le surnageant et lyser les cellules en ajoutant 80-100 μL de tampon de lyse cellulaire (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% de dodécylsulfate de sodium (SDS), 0,5% de désoxycholate de sodium, 1% Triton X-100 et 1x cocktail inhibiteur de protéase, voir Tableau des matériaux) et vortex.
- Chauffer le tube à 98 °C pendant 10 min pour lyser complètement et préparer le lysat cellulaire total. Conservez les lysats à 4 °C pour effectuer les étapes 1.15-1.17 le lendemain, mais, pour de meilleurs résultats, terminez ces étapes le même jour.
- Estimer la quantité de protéines dans chaque échantillon à l’aide d’une trousse de dosage BCA (voir le tableau des matières).
- Résoudre des quantités égales de protéines provenant d’échantillons non infectés et infectés par électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide standard (SDS-PAGE)11 avec des marqueurs de poids moléculaire 11.
- Transférer la protéine dans une membrane de nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidène (PVDF) (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : La membrane PVDF peut donner un arrière-plan élevé dans certains imageurs Western Blot; Vérifiez la compatibilité. - Effectuer le transfert Western pour détecter la protéine d’intérêt en utilisant la méthode décrite ailleurs11.
- Comparez les niveaux de protéines dans les voies d’échantillonnage infectées traitées simulées et traitées par inhibiteur.
REMARQUE: Si le niveau de protéine s’est rétabli dans la voie d’échantillonnage infectée traitée par inhibiteur de caspase, la protéine est clivée ou dégradée par les caspases. Sinon, il est dégradé par le lysosome ou le protéasome. - Quantifier la récupération de la protéine en mesurant l’intensité de sa bande dans chaque voie à partir d’au moins trois répétitions de la même expérience et en la normalisant avec la bande de contrôle de charge correspondante.
- Utilisez n’importe quel imageur contemporain et le logiciel associé (voir le tableau des matériaux) pour imager les Western blots et quantifier la récupération des protéines.
2. Confirmation du clivage médié par la caspase ou de la dégradation des protéines dans les cellules infectées par l’IAV par interférence ARN
- Concevoir ou obtenir un petit ARN interférent (siRNA) pré-conçu ciblant les caspases canines ou humaines 3, la caspase 6 et la caspase 7 (caspasesbourreaux 1) et un siRNA témoin non ciblé (voir le tableau des matériaux).
- Délivrer chaque siRNA aux cellules MDCK ou A549 par transfection inverse 8,11.
- Pour cela, diluer dans des tubes séparés 100 nM de siRNA témoin ou de caspase siRNA ou un volume recommandé de réactif de transfection (voir Tableau des matériaux) dans 100 μL de milieu approprié (comme OptiMEM, voir Tableau des matériaux), et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Préparer chaque dilution en deux exemplaires.
NOTE: Ce duplicata comprend une réplique pour analyser l’élimination de l’expression de la caspase par RT-qPCR ou Western blot (si des anticorps contre les caspases sont disponibles) et une autre pour évaluer la récupération de la protéine d’intérêt par Western blotting. - Mélanger 100 μL de chaque solution siRNA avec 100 μL de solution de réactif de transfection (étape 2.3) et incuber pendant 20-45 min à température ambiante pour former le complexe réactif siRNA-transfection.
- Entre-temps, diviser et ajouter 1 x 10 5 cellules MDCK ou A549 dans 800 μL du milieu de croissance complet, mélanger avec 200 μL de complexe réactif siRNA-transfection (étape2.5 ) et ajouter 1 mL de la suspension dans un puits d’une plaque de culture de 12 puits. Cette dilution porte la concentration finale de siRNA témoin ou de siRNA de caspase à 10 nM.
- Incuber les cellules à 37 °C sous une atmosphère de 5% de CO2 pendant 72 h.
- Récolter les cellules d’une réplication comme à l’étape 1.10 et les traiter pour valider ou confirmer l’élimination de l’expression de la caspase 3, de la caspase 6 et de la caspase 7 par RT-qPCR ou Western blotting, respectivement, en utilisant des méthodes et protocoles standard 8,11.
- Infecter les cellules de l’autre réplication avec IAV comme décrit aux étapes 1.4-1.9 (sans inhibiteurs).
- Après 24 h, prélever, traiter et analyser les cellules par transfert Western et mesurer et quantifier la récupération des protéines comme décrit aux étapes 1.10-1.20.
3. Mutagénèse dirigée pour localiser le(s) site(s) de clivage de la caspase dans le polypeptide
- Cloner la protéine codant pour le gène d’intérêt dans un plasmide d’expression11 chez un mammifère ou l’obtenir d’un laboratoire de recherche ou d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: Il est préférable si le gène est cloné avec une étiquette épitopique ou en tant que fusion GFP pour distinguer le polypeptide exprimé ectopiquement de celui exprimé de manière endogène pendant le Western blotting. - À l’aide de bases de données de substrats de caspases 4 ou d’outils d’alignement protéique, localisez les motifs de clivagede la caspase consensuels, XXXD et DXXD, sur le polypeptide. Presque tous les motifs de clivage des caspases possèdent l’acide aspartique au site de clivage (P1)3,4.
- Faire muter l’acide aspartique P1 putatif en acide glutamique ou en un acide aminé non polaire (alanine, valine) par mutagénèse dirigée suivie d’un séquençage de l’ADN11 à l’aide de méthodes et de protocoles standard.
- Délivrer l’ADN plasmidique de type sauvage (WT) et mutant aux cellules MDCK ou A549 par transfectioninverse 11.
- Pour cela, diluer 2 μg d’ADN plasmidique ou un volume recommandé du réactif de transfection dans 100 μL d’un milieu approprié (voir étape 2.3 et Tableau des matériaux) dans des tubes séparés, et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Mélanger 100 μL de chaque solution d’ADN plasmidique avec 100 μL de la solution de réactif de transfection et incuber pendant 20-45 min à température ambiante pour former le complexe de réactif de transfection ADN.
- Entre-temps, diviser et ajouter 3 x 105 cellules MDCK ou A549 à 800 μL du milieu de croissance complet, mélanger avec 200 μL de complexe de réactif de transfection d’ADN et ajouter la suspension de 1 mL à un puits d’une plaque de culture de 12 puits.
- Incuber les cellules à 37 °C sous une atmosphère de 5% de CO2 .
- Après 48 h, infecter les cellules avec IAV comme décrit aux étapes 1.4-1.9 (sans ajouter les inhibiteurs).
- Après 24 h, prélever, traiter et analyser les cellules par transfert Western (le cas échéant, en utilisant l’anticorps contre un marqueur d’épitope ou GFP). Ensuite, mesurez et quantifiez la récupération des protéines comme décrit aux étapes 1.10-1.20.
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Representative Results
Traitement par inhibiteur de la caspase 3
Il a été découvert que les polypeptides de cortactine, HDAC4 et HDAC6 de l’hôte subissent une dégradation en réponse à l’infection par le VAI dans les cellules canines (MDCK) et humaines (A549, NHBE) 7,8,9. En utilisant les approches ci-dessus, il a été découvert que les caspases hôtes induites par l’IAV, en particulier les caspases 3, provoquent leur dégradation 7,8,9. La cortactine a été dégradée d’une manière dépendante de la dose et du temps de l’infection et d’une manière indépendante de la cellule hôte et de la souche IAV7. Des résultats similaires ont été obtenus pour HDAC48 et HDAC69. Fait intéressant, la dégradation des trois protéines hôtes a coïncidé avec le clivage du virus NP 7,8,9, qui est connu pour subir un clivage médié par la caspase14. Ainsi, on a émis l’hypothèse que la cortactine, HDAC4 et HDAC6 subissent également un clivage médié par la caspase et une dégradation ultérieure. Pour tester cela, d’abord, les cellules infectées par IAV ont été traitées avec un inhibiteur de la caspase 3, et le sauvetage des polypeptides cortactin, HDAC4 et HDAC6 a été analysé par transfert Western. Les trois polypeptides (ainsi que le NP viral) récupérés de la dégradation induite par l’infection par le VAI après un traitement par inhibiteur de la caspase 3 7,8,9. Les données représentatives7 pour la cortactine sont présentées à la figure 1A. Cette récupération a été quantifiée en mesurant l’intensité des bandes protéiques et en normalisant la valeur de la bande de cortactine par la valeur de la bande d’actine correspondante (contrôle de charge). Par la suite, la valeur normalisée de la cortactine dans les échantillons non infectés correspondants a été considérée à 100% pour déterminer sa valeur dans les échantillons infectés. Cette méthode de quantification a permis de déterminer la récupération du polypeptide de cortactine dans les cellules infectées traitées par un inhibiteur de la caspase 3 de 78,8 % contre 20,7 % dans les cellules infectées non traitées7 (figure 1B).
Knockdown médié par interférence ARN de l’expression de la caspase 3
Ensuite, un outil génétique, l’interférence ARN (ARNi), a été utilisé, suivi d’un transfert Western pour confirmer le rôle des caspases dans la dégradation de la cortactine11 et de la HDAC48 induite par l’infection par le VAI. Dans les cellules appauvries en caspase 3 (Figure 2C)11, les polypeptides de cortactine (Figure 2A)11 et HDAC48 se sont rétablis de la dégradation induite par l’infection par le VAI. Cependant, dans les cellules appauvries en caspase 6- ou caspase 7 (Figure 2C)11, aucune récupération significative des niveaux de polypeptide de cortactine n’a été observée (Figure 2A)11. Plus précisément, lorsqu’il a été quantifié et comparé à leurs niveaux dans les cellules non infectées correspondantes comme mentionné ci-dessus, le niveau de polypeptide de cortactine dans les cellules infectées avec une expression appauvrie de caspase 3 est passé de 28,6% à 83% dans les cellules infectées avec une expression normale de caspase 3 (Figure 2B)11.
Motifs de clivage des caspases dans la cortactine et les polypeptides HDAC6
Enfin, la séquence d’acides aminés dans la cortactine et les polypeptides HDAC6 a été criblée et, dans les motifs putatifs de clivage de la caspase, l’acide aspartique en position P1 a été muté en acide glutamique 9,11. Cette approche a permis d’identifier l’acide aspartique 116 dans le polypeptide11 de cortactine et l’acide aspartique 1088 dans le polypeptide9 HDAC6 comme site de clivage de la caspase. La mutation des deux résidus d’acide aspartique en acide glutamique a rendu les polypeptides de cortactine (Figure 3A)11 et HDAC69 résistants à la dégradation induite par l’infection par le VAI. Plus précisément, lorsqu’ils ont été quantifiés et comparés à leurs niveaux dans les cellules non infectées correspondantes comme mentionné ci-dessus, le niveau de polypeptide de cortactine mutante exprimé par plasmide dans les cellules infectées était de 77,9%, tandis que le niveau de polypeptide de cortactine de type sauvage exprimé par plasmide dans les cellules infectées était de 23,6% (Figure 3B)11.
Figure 1 : Le polypeptide de coractine subit une dégradation médiée par la caspase 3 dans les cellules infectées par l’IAV. (A) Les cellules MDCK ont été infectées par la souche A/New Caledonia/20/1999/H1N1 du virus de la grippe à une MOI de 0,5 et ont ensuite été traitées comme simulées ou avec un inhibiteur de la caspase 3 (Cas3-I, 40 μM). Après 24 h, les polypeptides de cortactine, de NP viral et d’actine ont été détectés dans les lysats cellulaires totaux par transfert Western. UNI, non infecté; INF, infecté. Les flèches pointent vers le NP sur toute la longueur et clivé. (B) L’intensité des bandes de cortactine et d’actine a été quantifiée. Ensuite, la valeur de la cortactine a été normalisée avec la valeur de l’actine. La quantité normalisée de cortactine dans les échantillons UNI a été considérée à 100% pour déterminer sa quantité dans les échantillons INF correspondants. Les données présentées sont des moyennes ± SE de trois réplications biologiques. P = 0,0006, calculé à l’aide d’ANOVA bidirectionnelle. ns, non significatif. Cette figure a été modifiée à partir de Chen et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’élimination de l’expression de la caspase 3 a sauvé la dégradation du polypeptide de cortactine dans les cellules infectées par l’IAV. (A) Les cellules A549 ont été transfectées en double avec 10 nM de contrôle (Ctrl), caspase 3 (Cas3), caspase 6 (Cas6) ou caspase 7 (Cas7) siRNA. Après 72 h, les cellules d’une réplique ont été récoltées et traitées pour extraire l’ARN total. Les cellules de l’autre réplica ont été infectées par le sous-type A/WSN/1933/H1N1 du virus de la grippe à un MOE de 3,0. Après 24 heures, les polypeptides de cortactine, de NP viral et d’actine ont été détectés par transfert Western. UNI, non infecté; INF, infecté. (B) L’intensité des bandes de cortactine et d’actine a été quantifiée, et la valeur de la cortactine a été normalisée avec la valeur de l’actine. Ensuite, la quantité normalisée de cortactine dans les échantillons UNI a été considérée à 100% pour déterminer sa quantité dans les échantillons INF correspondants. Les données présentées sont des moyennes ± SE de trois réplications biologiques. P < 0,0001, ***P = 0,0007, ***P = 0,0002, calculé à l’aide d’ANOVA bidirectionnelle. ns, non significatif. (C) L’ARN total extrait ci-dessus a été converti en ADNc, qui a ensuite été utilisé comme modèle pour détecter les niveaux de caspase 3, de caspase 6, de caspase 7 et d’ARNm d’actine par RT-qPCR. Le niveau d’ARNm de l’actine a été utilisé comme référence, et le niveau d’ARNm de chaque caspase dans les cellules contrôlées siRNA (Ctrl) et les cellules transfectées siRNA de caspase (Cas) respectives a été calculé à l’aide de la méthode standard 2−ΔΔCT. P < 0,0001, calculé à l’aide de l’ANOVA bidirectionnelle. Ce chiffre a été modifié à partir de Chen et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La mutation de l’acide aspartique 116 en acide glutamique a rendu le polypeptide de cortactine résistant à la dégradation induite par l’infection par le VAI. (A) Les cellules MDCK ont été transfectées avec un plasmide exprimant la fusion GFP-cortactine de type sauvage (WT) ou mutée (D116E). Après 48 heures, les cellules ont été infectées par le sous-type A/WSN/1933/H1N1 du virus de la grippe à une MOI de 3,0. Après 24 h, les polypeptides GFP-cortactin, NP viral et actine ont été détectés par transfert Western. UNI, non infecté; INF, infecté. (B) L’intensité des bandes de cortactine et d’actine a été quantifiée, et la valeur de la cortactine a été normalisée avec la valeur de l’actine. Ensuite, la quantité normalisée de cortactine dans les échantillons UNI a été considérée à 100% pour déterminer sa quantité dans les échantillons INF correspondants. Les données présentées sont des moyennes ± SE de trois réplications biologiques. **P = 0,001, calculé à l’aide d’ANOVA bidirectionnelle. ns, non significatif. Ce chiffre a été modifié à partir de Chen et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Il est établi que les virus adaptent les facteurs et les voies de l’hôte à leur avantage. À leur tour, les cellules hôtes résistent à cela en employant diverses stratégies. L’une de ces stratégies est PANoptosis, que les cellules hôtes utilisent comme stratégie antivirale contre les infections virales. Cependant, des virus comme IAV ont développé leurs propres stratégies pour contrer PANoptosis et l’exploiter à leur avantage 1,3,6. Cette interaction implique le clivage de diverses protéines de l’hôte et virales par les caspases. L’identification de ces caspases et de leurs sites de clivage dans les protéines substrat est importante pour élucider les mécanismes et la signification d’une telle interaction.
À cette fin, des méthodes biochimiques et moléculaires standard ont été utilisées pour identifier les caspases et leurs sites de clivage dans la cortactine hôte, HDAC4 et HDAC6 7,8,9,11. Les protocoles décrits ci-dessus peuvent être utilisés pour de telles études impliquant des virus de la grippe, d’autres virus de mammifères, d’autres microbes et des stimuli externes tels que des toxines et des produits chimiques. De plus, ces méthodes peuvent être reproduites dans un laboratoire de biologie moléculaire standard avec des compétences pertinentes et ne nécessitent pas d’équipement spécialisé ni de formation logicielle. Le format de plaque de culture cellulaire à 12 puits a été adapté avec succès pour ces études et des études similaires afin de générer des quantités d’échantillons suffisantes pour les analyses en aval par transfert Western et RT-qPCR. Néanmoins, si nécessaire, ce format peut être réduit ou mis à l’échelle en conséquence. Lors d’une expérience impliquant un inhibiteur de caspase pour la première fois, il est suggéré d’utiliser un inhibiteur de pan-caspase (Z-VAD-FMK) aux côtés d’un inhibiteur du lysosome et du protéasome pour évaluer si la protéine d’intérêt subit une dégradation médiée par la caspase. En outre, en plus de NH4Cl et MG132, d’autres inhibiteurs du lysosome et du protéasome comme la bafilomycine A et l’époxomicine, respectivement, peuvent être utilisés. Après des résultats positifs avec un inhibiteur de pan-caspase, soit des inhibiteurs spécifiques de caspases individuelles peuvent être utilisés, soit une interférence ARN peut être utilisée. Pour les premiers, il est important d’optimiser les concentrations inhibitrices efficaces pour éviter la toxicité pour le type de cellule cible et des résultats non spécifiques.
Un outil génétique comme l’interférence ARN ou CRISPR doit être utilisé pour confirmer l’implication des caspases, car les inhibiteurs réagissent de manière croisée. Alternativement, une interférence ARN ou un criblage CRISPR ciblant individuellement toutes les caspases connues peut être effectué. Les paires d’amorces siRNA, gRNA et RT-qPCR de toutes les caspases connues pourraient être obtenues comme préconçues ou conçues à l’aide d’outils en ligne. De plus, deux caspases ou plus peuvent être épuisées simultanément pour évaluer le clivage séquentiel ou coopératif des polypeptides (cette stratégie a récemment été utilisée dans une étude qui n’a pas encore été publiée). L’interférence ARN est considérée comme un outil idéal pour la recherche sur l’interaction virus-cellule hôte. Cette dernière nécessite une manipulation contrôlée de l’expression du gène de l’hôte afin que les cellules hôtes restent relativement viables pour l’infection virale et l’achèvement du cycle de vie pour afficher le phénotype de cette manipulation. Cependant, l’optimisation d’une concentration efficace de siRNA et d’une combinaison de réactif siRNA-transfection est nécessaire pour chaque type de cellule afin d’obtenir un rapport optimal pour une infection ultérieure.
Pour localiser les motifs putatifs de clivage des caspases, de nombreuses bases de données telles que CASBAH18, CaspDB19, CutDB 20, DegraBase 21, MEROPS 22 et TopFIND23,24 ont été développées. Un criblage visuel a été effectué pour localiser ces motifs sur le polypétide HDAC69, mais pour la cortactine11, la CaspDB a été utilisée (bien que le site Web de CaspDB ait été inaccessible récemment). Ces motifs ont été confirmés avec succès comme sites de clivage de la caspase en faisant muter l’acide aspartique P1 en acide glutamique. Cependant, il est suggéré de faire d’abord muter l’acide aspartique en alanine ou en valine de type acide aminé non polaire, car certaines caspases peuvent se cliver après l’acide glutamique P14. Cet exercice peut rapidement aboutir à l’identification du ou des sites de clivage de la caspase, mais pourrait nécessiter la génération de dizaines de mutants si le polypeptide cible est riche en acides aspartiques et que les motifs cibles présumés ne sont pas canoniques. Pour la livraison de plasmides (et de siRNA) aux cellules, une transfection directe au lieu de l’inverse peut être effectuée. De plus, la dose d’infection et la cinétique temporelle doivent être effectuées à l’aide d’une FDS-PAGE à gradient de 4 % à 20 % pour le transfert Western afin d’évaluer la cinétique de dégradation des polypeptides et d’identifier tout produit de clivage de plus petite taille. Enfin, pour confirmer la protéine d’intérêt en tant que substrat direct de caspase, des essais biochimiques in vitro contenant des caspases purifiées et des protéines cibles (WT ou mutant) et d’éventuels cofacteurs pourraient être développés.
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Disclosures
L’auteur n’a aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
L’auteur remercie Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, le BEI Resources (NIAID), le Health Research Council of New Zealand, le Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nouvelle-Zélande), le H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin), le Département de microbiologie et d’immunologie et l’École des sciences biomédicales (Université d’Otago).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
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