Summary
インフルエンザAウイルス(IAV)感染は、宿主およびウイルスタンパク質を切断するカスパーゼを活性化し、次に、プロウイルスおよび抗ウイルス機能を有する。阻害剤、RNA干渉、部位特異的突然変異誘発、およびウェスタンブロッティングおよびRT-qPCR技術を採用することにより、宿主コルタクチンおよびヒストンデアセチラーゼを切断する感染哺乳類細胞におけるカスパーゼが同定された。
Abstract
システインプロテアーゼのファミリーであるカスパーゼは、微生物感染を含むさまざまな刺激に応答してプログラムされた細胞死を調整します。当初はアポトーシスによって起こると説明されていましたが、プログラムされた細胞死は、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスの3つの相互接続された経路を含むことが現在知られており、一緒になって1つのプロセスであるパントーシスとして造られています。インフルエンスAウイルス(IAV)感染は、さまざまなカスパーゼの活性化を誘導することにより哺乳類細胞のパンノプトーシスを誘導し、さまざまな宿主およびウイルスタンパク質を切断し、宿主の自然抗ウイルス応答の活性化や拮抗宿主タンパク質の分解などのプロセスを引き起こします。これに関して、宿主コルタクチンのカスパーゼ3媒介切断、ヒストンデアセチラーゼ4(HDAC4)、およびヒストンデアセチラーゼ6(HDAC6)が、IAV感染に応答して動物およびヒト上皮細胞の両方で発見されている。これを実証するために、阻害剤、RNA干渉、および部位特異的突然変異誘発法を使用し、続いて、コルタクチン、HDAC4、およびHDAC6ポリペプチドの切断または切断に対する耐性および回収をウェスタンブロッティングによって測定しました。これらの方法は、RT-qPCRと組み合わせて、IAVまたは他のヒトおよび動物ウイルスの感染中にカスパーゼ媒介切断を受けている宿主およびウイルスタンパク質を同定するための単純でありながら効果的な戦略を形成します。本議定書は、この戦略の代表的な結果を詳述し、それをより効果的にする方法についても議論する。
Introduction
インフルエンザAウイルス(IAV)は、 オルトミクソウイルス科 のプロトタイプメンバーであり、世界的な流行と予測不可能なパンデミックを引き起こすことが知られています。IAVは、一般に「インフルエンザ」として知られているヒト呼吸器疾患、インフルエンザを引き起こします。インフルエンザは、宿主の炎症誘発性および抗炎症性の自然免疫応答の誘導とヒト気道の上皮細胞の死をもたらす急性疾患です。どちらのプロセスも、プログラムされた細胞死と呼ばれる現象によって支配されています1。プログラムされた細胞死のシグナル伝達は、さまざまな病原体認識受容体が宿主細胞に入ってくるウイルス粒子を感知するとすぐに誘導されます。これは、感染した細胞の死のプログラミングと、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスと呼ばれる3つの相互接続された経路による隣接する健康な細胞へのシグナル伝達につながります-最近、1つのプロセスとして造られました、 PANoptosis1。
PANoptosisは、誘導から実行までの多くの宿主およびウイルスタンパク質のタンパク質分解プロセスを含みます。このようなタンパク質のプロセシングは、主にカスパーゼ1,2と呼ばれるシステインプロテアーゼのファミリーによって主導されています。最大18個のカスパーゼ(カスパーゼ1からカスパーゼ18まで)が知られています3。ほとんどのカスパーゼはプロカスパーゼとして発現され、ウイルス感染のような刺激に応答して自己触媒または他のカスパーゼ4のいずれかによって独自のタンパク質分解処理を受けることによって活性化される。IAV感染細胞のPANoptosisは宿主防御機構であると考えられていましたが、IAVは、その複製を促進するためにそれを回避および悪用する方法を進化させました1,2,5,6。それらの1つは、本質的に抗ウイルス性であるか、IAVライフサイクルのステップの1つを妨害するカスパーゼ媒介性の切断または分解を介して宿主因子に拮抗することです。この目的のために、宿主因子であるコルタクチン、HDAC4、およびHDAC6は、IAV感染上皮細胞においてカスパーゼ媒介切断または分解を受けることが発見されている7、8、9。HDAC4およびHDAC6は抗IAV因子8,10であり、コルタクチンは感染の後期段階、潜在的にウイルスの集合および出芽中にIAV複製を妨害する11。
さらに、さまざまなカスパーゼも活性化され、それが次に複数のタンパク質を切断して、IAV感染中の宿主炎症反応を活性化します1,2。さらに、核タンパク質(NP)、IAV 12,13,14のイオンチャネルM2タンパク質、および他のウイルス3,15,16の様々なタンパク質も、感染中にカスパーゼ媒介切断を受け、ウイルスの病因に影響を与える。したがって、ウイルス病因の分子基盤を理解するために、IAVおよび他のウイルス感染中の宿主およびウイルスタンパク質のカスパーゼ媒介切断または分解を研究することが継続的に必要とされています。本明細書では、(1)カスパーゼによるそのようなタンパク質の切断または分解を評価し、(2)それらのカスパーゼを同定し、および(3)切断部位を特定するための方法が提示される。
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Protocol
オタゴ大学機関生物学的安全委員会から、IAVおよび哺乳類細胞を扱うための規制当局の承認が得られました。マディンダービーイヌ腎臓(MDCK)またはヒト肺胞上皮A549細胞およびIAV H1N1サブタイプが本研究に使用されました。IAVは、他の場所に記載されているように、鶏の卵で育てられました17。無菌および無菌条件を使用して哺乳類細胞を処理し、バイオセーフティレベル2(または物理的封じ込め2)施設とクラスIIバイオセーフティキャビネットを使用してIAVサブタイプを処理します。
1. カスパーゼによるIAV感染細胞におけるタンパク質の切断または分解の評価
- ウェルあたり3 x 105 MDCKまたはA549細胞を12ウェル細胞培養プレートに播種します。
注:MDCK細胞を使用する場合は、目的のタンパク質に対する抗体がそのイヌ種を認識していることを確認してください。 - ウェルをペアで播種します、すなわち、対照ペア(感染していない模擬サンプル用のウェルと感染した模擬サンプル用のウェル)と、テストペア(感染していない阻害剤Aサンプル用のウェルと感染阻害剤Aサンプル用のウェル)をシードします。追加の阻害剤ごとにペアの数を増やします(参考文献7、8を参照)。
- 細胞を5%CO2 雰囲気下37°Cで一晩インキュベートする。
- 翌日、細胞にIAV(H1N1サブタイプまたは別のサブタイプ)を感染させます。
- このために、ウイルスストックを400μLの無血清最小必須培地(MEM)(材料の表を参照)で0.5〜3.0プラーク形成単位(pfu)/細胞7,11(MOIを計算するときの細胞数の倍増の倍率)の感染多重度(MOI)で希釈することにより、ウイルス接種材料を調製します。
注:MDCK細胞に感染させるには、ウイルス接種源にトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン(TPCK)-トリプシンを最終濃度1μg/mLで補給します。
- このために、ウイルスストックを400μLの無血清最小必須培地(MEM)(材料の表を参照)で0.5〜3.0プラーク形成単位(pfu)/細胞7,11(MOIを計算するときの細胞数の倍増の倍率)の感染多重度(MOI)で希釈することにより、ウイルス接種材料を調製します。
- 細胞から古い培養液を取り出し(ステップ1.3)、1 mL/ウェルの無血清MEM 2xで細胞を洗浄します。
- 400 μLのウイルス接種材料を細胞に加え(ステップ1.4.1)、5%CO2 雰囲気下で35°Cで1時間インキュベートします。
- それまでの間、カスパーゼ阻害剤(Z-DEVD-FMKなど)、リソソーム阻害剤(NH4Clなど)、またはプロテアソーム阻害剤(MG132など)(材料の表を参照)を、無血清MEM7でそれぞれ最終濃度40 μM、20 mM、または10 μMに希釈します(材料の表を参照)。後者の2つの阻害剤は対照として役立つ。阻害剤の1つを無血清培地で再構成するために使用した溶媒(水以外の場合)をモックとして等容量に希釈します。
- ウイルスの接種材料を取り除き、ステップ1.5(1x)のように細胞を洗浄します。
- 無血清MEM、1 mL/ウェル、モック、または阻害剤を添加して細胞に加え、ステップ1.6と同様に細胞をインキュベートします。この時点は0時間の感染と見なされます。
- 24時間後、1 mLシリンジプランジャー(ゴム側)で細胞をこすって細胞を回収し、1.5 mLポリプロピレンチューブに移します。
- チューブを12,000 x g で室温で1〜2分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を採取する。
注:この上清は廃棄するか、プラークアッセイ8 に使用して、放出されたウイルス子孫の力価を測定することができます。 - ステップ1.11と同様に再遠心分離により、細胞ペレットを250 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
- 上清を除去し、80〜100 μLの細胞溶解バッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1%Triton X-100、および1xプロテアーゼ阻害剤カクテル、 材料の表を参照)を添加して細胞を溶解し、ボルテックスします。
- チューブを98°Cで10分間加熱して完全に溶解し、全細胞溶解液を調製します。翌日手順1.15〜1.17を実行するためにライセートを4°Cで保管しますが、最良の結果を得るには、同じ日にこれらの手順を完了します。
- BCAアッセイキットを使用して、各サンプルのタンパク質量を推定します(材料の表を参照)。
- 標準SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)11 と分子量マーカー11により、感染していないサンプルと感染したサンプルから等量のタンパク質を分離します。
- タンパク質をニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に移します( 材料表を参照)。
注:PVDFメンブレンは、一部のウェスタンブロットイメージャーで高いバックグラウンドを与える場合があります。互換性を確認します。 - ウエスタンブロッティングを行い、他の11に記載の方法を用いて目的のタンパク質を検出する。
- 模擬処理された感染サンプルレーンと阻害剤処理された感染サンプルレーンのタンパク質レベルを比較します。
注:カスパーゼ阻害剤で処理された感染サンプルレーンでタンパク質レベルが回復した場合、タンパク質はカスパーゼによって切断または分解されます。そうでなければ、それはリソソームまたはプロテアソームのいずれかによって分解される。 - 同じ実験の少なくとも3回の反復から各レーンでバンド強度を測定し、対応するローディングコントロールバンドで正規化することにより、タンパク質回収率を定量化します。
- 最新のイメージャーと関連ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、ウェスタンブロットをイメージングし、タンパク質回収率を定量化します。
2. RNA干渉によるIAV感染細胞におけるカスパーゼを介したタンパク質の切断または分解の確認
- イヌまたはヒトのカスパーゼ3、カスパーゼ6、およびカスパーゼ7(実行者カスパーゼ1)のいずれかを標的とする低分子干渉RNA(siRNA)およびノンターゲティングコントロールsiRNAを設計または取得します( 材料の表を参照)。
- 各siRNAをリバーストランスフェクションによりMDCKまたはA549細胞に送達する8,11。
- このためには、100 nMのコントロールsiRNAまたはカスパーゼsiRNA、または推奨量のトランスフェクション試薬( 材料の表を参照)を100 μLの適切な培地(OptiMEMなど、 材料の表を参照)で別のチューブで希釈し、室温で5分間インキュベートします。
- 各希釈液を2回に分けて調製する。
注:この複製には、RT-qPCRまたはウェスタンブロッティング(カスパーゼに対する抗体が利用可能な場合)によるカスパーゼ発現のノックダウンを分析するための複製と、ウェスタンブロッティングによる目的のタンパク質の回収を評価するための複製が含まれます。 - 各siRNA溶液100 μLをトランスフェクション試薬溶液100 μLと混合し(ステップ2.3)、室温で20〜45分間インキュベートして、siRNA-トランスフェクション試薬複合体を形成します。
- その間に、800 μLの完全増殖培地に1 x 10 5 MDCKまたはA549細胞を分割して添加し、200 μLのsiRNAトランスフェクション試薬複合体と混合し(ステップ2.5 )、1 mLの懸濁液を12ウェル培養プレートのウェルに加えます。この希釈により、コントロールsiRNAまたはカスパーゼsiRNAの最終濃度は10 nMになります。
- 細胞を5%CO2雰囲気下37°Cで72 時間インキュベートします。
- ステップ1.10のように1回の複製から細胞を回収し、標準的な方法とプロトコル8,11を使用して、それぞれRT-qPCRまたはウェスタンブロッティングによってカスパーゼ3、カスパーゼ6、およびカスパーゼ7の発現のノックダウンを検証または確認するために処理します8,11。
- ステップ1.4〜1.9に記載されるようにIAVで複製する他の細胞を感染させる(阻害剤なし)。
- 24時間後、ウェスタンブロッティングにより細胞を回収、処理、および分析し、ステップ1.10〜1.20に記載されているようにタンパク質回収率を測定および定量します。
3. ポリペプチド中のカスパーゼ切断部位を特定するための部位特異的突然変異誘発
- 目的の遺伝子コードタンパク質を哺乳類発現プラスミド11 にクローニングするか、または研究室または市販のソースから入手してください( 材料の表を参照)。
注:遺伝子をエピトープタグでクローニングするか、GFP融合としてクローニングして、ウェスタンブロッティング中に異所性発現ポリペプチドと内因性発現ポリペプチドを区別することが好ましい。 - カスパーゼ基質データベース4またはタンパク質アライメントツールを使用して、ポリペプチド上のコンセンサスカスパーゼ切断モチーフXXXDおよびDXXDを見つけます。ほとんどすべてのカスパーゼ切断モチーフは、切断部位(P1)にアスパラギン酸を持っています3,4。
- 推定P1アスパラギン酸をグルタミン酸または非極性アミノ酸(アラニン、バリン)に部位特異的突然変異誘発法とそれに続く標準的な方法およびプロトコルを使用したDNAシーケンシング11 によって変異させる。
- 野生型(WT)および変異型プラスミドDNAをリバーストランスフェクション11によりMDCKまたはA549細胞に送達する。
- そのためには、2 μgのプラスミドDNAまたは推奨容量のトランスフェクション試薬を100 μLの適切な培地(ステップ2.3および 材料表を参照)で別々のチューブで希釈し、室温で5分間インキュベートします。
- 各プラスミドDNA溶液100 μLとトランスフェクション試薬溶液100 μLを混合し、室温で20〜45分間インキュベートして、DNAトランスフェクション試薬複合体を形成します。
- その間に、3 x 105 MDCKまたはA549細胞を800 μLの完全増殖培地に分割して添加し、200 μLのDNAトランスフェクション試薬複合体と混合し、1 mL懸濁液を12ウェル培養プレートのウェルに加えます。
- 細胞を5%CO2 雰囲気下で37°Cでインキュベートする。
- 48時間後、ステップ1.4〜1.9に記載されているように細胞にIAVを感染させる(阻害剤を添加せずに)。
- 24時間後、細胞を回収、処理、およびウェスタンブロッティング(該当する場合、エピトープタグまたはGFPに対する抗体を使用)によって分析します。次いで、ステップ1.10〜1.20に記載のタンパク質回収率を測定および定量する。
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Representative Results
カスパーゼ3阻害剤による治療
宿主のコルタクチン、HDAC4、およびHDAC6ポリペプチドは、イヌ(MDCK)細胞とヒト(A549、NHBE)細胞の両方でIAV感染に応答して分解を受けることが発見されています7、8、9。上記のアプローチを使用することにより、IAV誘発宿主カスパーゼ、特にカスパーゼ3がそれらの分解を引き起こすことが明らかになりました7、8、9。コルタクチンは、感染用量および時間依存的に、および宿主細胞およびIAV株に依存しない方法で分解された7。HDAC48およびHDAC69についても同様の結果が得られた。興味深いことに、3つの宿主タンパク質すべての分解は、カスパーゼ媒介切断を受けることが知られているウイルスNP 7,8,9の切断と一致した14。したがって、コルタクチン、HDAC4、およびHDAC6もカスパーゼを介した切断とその後の分解を受けるという仮説が立てられました。これを試験するために、まず、IAV感染細胞をカスパーゼ3阻害剤で処理し、コルタクチン、HDAC4、およびHDAC6ポリペプチドのレスキューをウエスタンブロッティングによって分析した。3つのポリペプチド全て(ならびにウイルスNP)は、カスパーゼ3阻害剤処理後のIAV感染誘導分解から回復した7、8、9。コルタクチンについての代表的なデータ7を図1Aに示す。この回収率は、タンパク質バンドの強度を測定し、コルタクチンバンドの値を対応するアクチン(ローディングコントロール)バンドの値で正規化することによって定量化した。続いて、対応する非感染サンプル中のコルタクチンの正規化値を100%考慮して、感染サンプルにおけるその値を決定した。この定量法は、カスパーゼ3阻害剤処理感染細胞におけるコルタクチンポリペプチドの回収率を、未処理感染細胞における20.7%から78.8%として説明した7(図1B)。
カスパーゼ3発現のRNA干渉媒介ノックダウン
次に、遺伝ツールであるRNA干渉(RNAi)を使用し、続いてウェスタンブロッティングを使用して、IAV感染によるコルタクチン11およびHDAC48の分解におけるカスパーゼの役割を確認しました。カスパーゼ3枯渇細胞(図2C)11において、コルタクチン(図2A)11およびHDAC48ポリペプチドの両方がIAV感染誘導分解から回復した。しかし、カスパーゼ6またはカスパーゼ7枯渇細胞(図2C)11では、コルタクチンポリペプチドレベルの有意な回復は観察されなかった(図2A)11。具体的には、上記のように対応する非感染細胞におけるそれらのレベルを定量して比較すると、カスパーゼ3発現が枯渇した感染細胞におけるコルタクチンポリペプチドレベルは、正常なカスパーゼ3発現を有する感染細胞の28.6%から83%に回復した(図2B)11。
コルタクチンおよびHDAC6ポリペプチドにおけるカスパーゼ切断モチーフ
最後に、コルタクチンおよびHDAC6ポリペプチドのアミノ酸配列をスクリーニングし、推定カスパーゼ切断モチーフにおいて、P1位のアスパラギン酸をグルタミン酸9,11に変異させた。このアプローチにより、コルタクチンポリペプチド11のアスパラギン酸116およびHDAC6ポリペプチド9のアスパラギン酸1088がカスパーゼ切断部位として同定された。両方のアスパラギン酸残基のグルタミン酸への変異により、コルタクチン(図3A)11およびHDAC69ポリペプチドがIAV感染誘発性分解に対して耐性になりました。具体的には、上記のように対応する非感染細胞におけるそれらのレベルを定量して比較した場合、感染細胞におけるプラスミド発現変異型コルタクチンポリペプチドのレベルは77.9%であったのに対し、感染細胞におけるプラスミド発現野生型コルタクチンポリペプチドのレベルは23.6%であった(図3B)11。
図1:コルタクチンポリペプチドは、IAV感染細胞においてカスパーゼ3媒介分解を受ける 。 (A)MDCK細胞をインフルエンザウイルスA/ニューカレドニア/20/1999/H1N1株にMOI0.5で感染させ、その後、モックまたはカスパーゼ3阻害剤(Cas3-I、40μM)で処理した。24時間後、コルタクチン、ウイルスNP、およびアクチンポリペプチドを、ウェスタンブロッティングによって全細胞ライセート中に検出した。UNI、感染していない。INF、感染。矢印は全長と切断されたNPを指しています。(B)コルタクチンおよびアクチンバンドの強度を定量した。次に、コルタクチンの値をアクチンの値で正規化した。UNIサンプル中のコルタクチンの正規化された量を100%考慮して、対応するINFサンプル中のその量を決定しました。提示されたデータは±3つの生物学的複製のSEの手段である。P = 0.0006、二元配置分散分析を使用して計算。NS、重要ではありません。この図は、Chenら7から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:カスパーゼ3発現のノックダウンは、IAV感染細胞におけるコルタクチンポリペプチド分解を救出した。 (A)A549細胞を、10 nMのコントロール(Ctrl)、カスパーゼ3(Cas3)、カスパーゼ6(Cas6)、またはカスパーゼ7(Cas7)siRNAで重複してトランスフェクトした。72時間後、1回の複製で細胞を回収し、全RNAを抽出するために処理した。もう一方の複製の細胞は、MOI3.0でインフルエンザウイルスA/WSN/1933/H1N1サブタイプに感染していた。24時間後、コルタクチン、ウイルスNP、およびアクチンポリペプチドをウェスタンブロッティングにより検出した。UNI、感染していない。INF、感染。(B)コルタクチンおよびアクチンバンドの強度を定量し、コルタクチンの値をアクチンの値で正規化した。次いで、UNIサンプル中のコルタクチンの正規化量を100%考慮し、対応するINFサンプルにおけるその量を決定した。提示されたデータは±3つの生物学的複製のSEの手段である。P < 0.0001、****P = 0.0007、***P = 0.0002、二元配置分散分析を使用して計算。NS、重要ではありません。(C)上記で抽出した全RNAをcDNAに変換し、これをテンプレートとして使用して、RT-qPCRによってカスパーゼ3、カスパーゼ6、カスパーゼ7、およびアクチンmRNAレベルを検出しました。アクチンmRNAレベルを基準とし、コントロールsiRNA(Ctrl)および各カスパーゼsiRNA(Cas)トランスフェクト細胞における各カスパーゼのmRNAレベルを標準的な2−ΔΔCT法を用いて計算した。P < 0.0001、二元配置分散分析を使用して計算。この図はChenら11から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アスパラギン酸116のグルタミン酸への変異により、コルタクチンポリペプチドはIAV感染誘発性の分解に対して耐性になりました 。 (A)MDCK細胞に、野生型(WT)または変異型(D116E)GFP−コルタクチン融合を発現するプラスミドをトランスフェクトした。48時間後、細胞はMOI3.0でインフルエンザウイルスA/WSN/1933/H1N1サブタイプに感染しました。24時間後、GFP-コルタクチン、ウイルスNP、およびアクチンポリペプチドをウェスタンブロッティングにより検出した。UNI、感染していない。INF、感染。(B)コルタクチンおよびアクチンバンドの強度を定量し、コルタクチンの値をアクチンの値で正規化した。次いで、UNIサンプル中のコルタクチンの正規化量を100%考慮して、対応するINFサンプルにおけるその量を決定した。提示されたデータは±3つの生物学的複製のSEの手段である。**P = 0.001、二元配置分散分析を使用して計算。NS、重要ではありません。この図はChenら11から修正されたものである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ウイルスは宿主の要因と経路をその利益に合わせて調整することが確立されています。次に、宿主細胞はさまざまな戦略を採用することによってそれに抵抗します。それらの戦略の1つは、宿主細胞がウイルス感染に対する抗ウイルス戦略として使用するパンノプトーシスです。しかし、IAVのようなウイルスは、パンノプトーシスに対抗し、それを有利に利用するために独自の戦略を進化させてきました1,3,6。この相互作用には、カスパーゼによる様々な宿主およびウイルスタンパク質の切断が含まれる。基質タンパク質中のカスパーゼとその切断部位を特定することは、そのような相互作用のメカニズムと重要性を解明するために重要です。
この目的のために、標準的な生化学的および分子的方法を使用して、宿主コルタクチン、HDAC4、およびHDAC67、8、9、11のカスパーゼとその切断部位を特定しました。上記のプロトコルは、インフルエンザウイルス、他の哺乳類ウイルス、他の微生物、および毒素や化学物質などの外部刺激を含むこのような研究に使用できます。さらに、これらの方法は、適切なスキルを備えた標準的な分子生物学研究室で複製することができ、特別な機器やソフトウェアのトレーニングを必要としません。12ウェル細胞培養プレートフォーマットは、ウェスタンブロッティングおよびRT-qPCRによるダウンストリーム分析に十分なサンプル量を生成するために、これらの研究および同様の研究にうまく適合しました。それでも、必要に応じて、この形式はそれに応じてダウンスケールまたはアップスケールできます。カスパーゼ阻害剤を含む実験を初めて行う場合、パンカスパーゼ阻害剤(Z-VAD-FMK)をリソソームおよびプロテアソーム阻害剤と一緒に使用して、目的のタンパク質がカスパーゼを介した分解を受けるかどうかを評価することをお勧めします。さらに、NH4ClおよびMG132に加えて、それぞれバフィロマイシンAおよびエポキソマイシンなどの他のリソソームおよびプロテアソーム阻害剤を使用することができる。汎カスパーゼ阻害剤で陽性の結果が出た後、個々のカスパーゼの特異的阻害剤を使用するか、RNA干渉を使用することができます。前者の場合、標的細胞型への毒性および非特異的な結果を回避するために、有効阻害濃度を最適化することが重要です。
阻害剤は交差反応するため、カスパーゼの関与を確認するために、RNA干渉やCRISPRなどの遺伝的ツールを次に使用する必要があります。あるいは、全ての既知のカスパーゼを個別に標的とするRNA干渉またはCRISPRスクリーニングを実施することができる。すべての既知のカスパーゼに対するsiRNA、gRNA、およびRT-qPCRプライマーペアは、事前に設計されたとおりに、またはオンラインツールを使用して設計して調達できます。さらに、ポリペプチドの逐次的または協調的な切断を評価するために、2つ以上のカスパーゼを同時に枯渇させることができます(この戦略は、まだ発表されていない研究で最近使用されました)。RNA干渉は、ウイルスと宿主細胞の相互作用研究に理想的なツールであると考えられています。後者は、宿主細胞がウイルス感染に対して比較的生存可能であり、その操作の表現型を示すためのライフサイクルの完了のために、宿主遺伝子発現の制御された操作を必要とする。ただし、その後の感染に最適なノックダウンと生存率比を得るためには、細胞タイプごとに有効なsiRNA濃度とsiRNAとトランスフェクション試薬の組み合わせを最適化する必要があります。
推定カスパーゼ切断モチーフを見つけるために、CASBAH18、CaspDB19、CutDB 20、DegraBase 21、MEROPS 22、TopFIND23,24などの多くのデータベースが開発されています。HDAC6ポリペチド9上のこれらのモチーフを見つけるために視覚スクリーニングが行われたが、コルタクチン11についてはCaspDBが使用された(ただし、CaspDBのウェブサイトは最近アクセスできない)。これらのモチーフは、P1アスパラギン酸をグルタミン酸に変異させることでカスパーゼ切断部位として確認することに成功した。しかし、アスパラギン酸を最初に非極性アミノ酸様アラニンまたはバリンに変異させることは、一部のカスパーゼがP1グルタミン酸4の後に切断できるためであることが示唆される。この演習により、カスパーゼ切断部位が迅速に特定される可能性がありますが、標的ポリペプチドがアスパラギン酸に富み、推定標的モチーフが非標準である場合、数十の変異体を生成する必要があります。プラスミド(およびsiRNA)を細胞に送達するために、トランスフェクションを逆方向ではなく順方向にトランスフェクションすることができる。さらに、感染量と時間動態は、ポリペプチドの分解速度論を評価し、より小さなサイズの切断産物を同定するために、ウェスタンブロッティング用の4%〜20%グラジエントSDS-PAGEを使用して実行する必要があります。最後に、目的のタンパク質を直接カスパーゼ基質として確認するために、精製されたカスパーゼおよび標的タンパク質(WTまたは変異体)および任意の補因子を含むin vitro生化学的アッセイを開発することができた。
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Disclosures
著者には、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
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