Summary
인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 감염은 숙주 및 바이러스 단백질을 절단하는 카스파 제를 활성화시켜 프로 바이러스 및 항 바이러스 기능을 갖습니다. 억제제, RNA 간섭, 부위 지향 돌연변이 유발, 웨스턴 블로팅 및 RT-qPCR 기술을 사용하여 숙주 코르탁틴 및 히스톤 탈아세틸라제를 절단하는 감염된 포유류 세포의 카스파제를 식별했습니다.
Abstract
시스테인 프로테아제 계열인 Caspases는 미생물 감염을 포함한 다양한 자극에 반응하여 프로그램된 세포 사멸을 조정합니다. 처음에는 세포 사멸에 의해 발생하는 것으로 설명 된 프로그램 된 세포 사멸은 이제 세 가지 상호 연결된 경로, 즉 pyroptosis, 세포 사멸 및 괴사 증을 포함하는 것으로 알려져 있으며, 함께 하나의 과정 인 PANoptosis로 만들어졌습니다. 영향 바이러스(IAV) 감염은 다양한 카스파제의 활성화를 유도하여 포유류 세포에서 PANoptosis를 유도하고, 이는 차례로 다양한 숙주 및 바이러스 단백질을 절단하여 숙주 선천적 항바이러스 반응의 활성화 또는 길항성 숙주 단백질의 분해와 같은 과정을 유도합니다. 이와 관련하여, 숙주 코르탁틴, 히스톤 탈아세틸라제 4 (HDAC4), 및 히스톤 탈아세틸라제 6 (HDAC6)의 카스파제 3-매개 절단이 IAV 감염에 반응하여 동물 및 인간 상피 세포 모두에서 발견되었다. 이를 입증하기 위해 억제제, RNA 간섭 및 부위 지시 돌연변이 유발을 사용했으며, 이어서 절단에 대한 절단 또는 저항성 및 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6 폴리펩티드의 회복을 웨스턴 블롯팅으로 측정했습니다. 이러한 방법은 RT-qPCR과 함께 IAV 또는 기타 인간 및 동물 바이러스의 감염 중에 카스파제 매개 절단을 겪는 바이러스 단백질뿐만 아니라 숙주를 식별하는 간단하면서도 효과적인 전략을 형성합니다. 본 프로토콜은이 전략의 대표적인 결과를 자세히 설명하고이를 더 효과적으로 만드는 방법도 논의합니다.
Introduction
인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 Orthomyxoviridae 계열의 프로토 타입 구성원이며 전 세계적으로 전염병과 예측할 수없는 전염병을 일으키는 것으로 알려져 있습니다. IAV는 일반적으로 "독감"으로 알려진 인간 호흡기 질환, 인플루엔자를 유발합니다. 상기 독감은 숙주 전염증성 및 항염증성 선천성 면역 반응의 유도 및 인간 호흡기에서 상피 세포의 사멸을 초래하는 급성 질환이다. 두 과정 모두 프로그램 된 세포 사멸1이라는 현상에 의해 지배됩니다. 프로그램된 세포 사멸에 대한 신호 전달은 다양한 병원체 인식 수용체가 숙주 세포에서 들어오는 바이러스 입자를 감지하는 즉시 유도됩니다. 이것은 감염된 세포의 죽음을 프로그래밍하고 pyroptosis, 세포 사멸 및 괴사라고 불리는 세 가지 상호 연결된 경로에 의해 인접한 건강한 세포에 신호를 보냅니다 - 최근에는 하나의 과정 인 PANoptosis1로 만들어졌습니다.
PANoptosis는 유도에서 실행까지 많은 숙주 및 바이러스 단백질의 단백질 분해 처리를 포함합니다. 이러한 단백질 처리는 주로 카스파제 1,2라고 하는 시스테인 프로테아제 계열에 의해 주도됩니다. 최대 18 개의 카스파제 (카스파제 1에서 카스파제 18까지)가 알려져 있습니다3. 대부분의 카스파제는 프로 카스파제로 표현되며 바이러스 감염과 같은 자극에 반응하여자가 촉매 또는 다른 카스파 아제4에 의해 자체 단백질 분해 처리를 통해 활성화됩니다. IAV에 감염된 세포의 PANoptosis는 숙주 방어 메커니즘으로 생각되었지만 IAV는 복제를 촉진하기 위해이를 회피하고 이용하는 방법을 진화 시켰습니다 1,2,5,6. 그 중 하나는 본질적으로 항 바이러스이거나 IAV 수명주기의 단계 중 하나를 방해하는 카스파 제 매개 절단 또는 분해를 통해 숙주 인자를 길항하는 것입니다. 이를 위해, 숙주 인자, 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6는 IAV에 감염된 상피 세포 7,8,9에서 카스파제 매개 절단 또는 분해를 겪는 것으로 밝혀졌다. HDAC4 및 HDAC6는 항 IAV 인자 8,10이며, 코르 탁틴은 감염의 후기 단계, 잠재적으로 바이러스 조립 및 출아 11 동안 IAV 복제를 방해합니다.
또한, 다양한 카스파아제가 활성화되고, 이는 차례로 IAV 감염 동안 숙주 염증 반응을 활성화시키기 위해 여러 단백질을 절단한다 1,2. 또한, 핵 단백질 (NP), IAV 12,13,14의 이온 채널 M2 단백질 및 다른 바이러스 3,15,16의 다양한 단백질도 감염 중에 카스파 제 매개 절단을 겪어 바이러스 병인에 영향을 미친다. 따라서, 바이러스 발병기전의 분자적 기초를 이해하기 위해 IAV 및 다른 바이러스 감염 동안 숙주 및 바이러스 단백질의 카스파제 매개 절단 또는 분해를 지속적으로 연구할 필요가 있다. 본원에서, 상기 방법은 (1) 카스파제에 의한 이러한 단백질의 절단 또는 분해를 평가하고, (2) 이들 카스파제를 확인하고, (3) 절단 부위를 위치시키기 위해 제시된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
IAV 및 포유류 세포와 협력하기 위해 오타고 대학 기관 생물 안전 위원회로부터 규제 승인을 받았습니다. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 또는 인간 폐 폐포 상피 A549 세포 및 IAV H1N1 아형을 본 연구에 사용하였다. IAV는 다른 곳에서 설명한 바와 같이 닭고기 알에서 성장하였다17. 무균 및 무균 조건은 포유류 세포와 함께 작업하는 데 사용되었으며 생물 안전 레벨 2 (또는 물리적 격리 2) 시설 및 클래스 II 생물 안전 캐비닛은 IAV 하위 유형으로 작업하는 데 사용되었습니다.
1. 카스파제에 의한 IAV 감염 세포에서 단백질의 절단 또는 분해 평가
- 12-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 3 x 105 MDCK 또는 A549 세포를 시드한다.
참고: MDCK 세포를 사용하는 경우 관심 단백질에 대한 항체가 송곳니 종을 인식하는지 확인하십시오. - 웰을 쌍으로 시드, 즉 대조군 쌍 - 감염되지 않은 모의 샘플에 대한 하나의 웰 및 감염된 모의 샘플에 대한 하나의 웰 - 및 시험 쌍 - 감염되지 않은 억제제 A 샘플에 대한 하나의 웰 및 감염된 억제제 A 샘플에 대한 하나의 웰. 각 추가 억제제와 함께 쌍의 수를 늘립니다 (참고 문헌 7,8 참조).
- 세포를 5%CO2 분위기 하에 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.
- 다음날 세포를 IAV (H1N1 아형 또는 다른 아형)로 감염시킵니다.
- 이를 위해 0.5-3.0 플라크 형성 단위(pfu)/세포 7,11(MOI 계산 시 세포 수의 배가 계수)의 감염 다중도(MOI)로 400μL의 무혈청 최소 필수 배지(MEM)(재료 표 참조)에 바이러스 스톡을 희석하여 바이러스 접종물을 준비합니다.
참고: MDCK 세포를 감염시키려면 최종 농도 1μg/mL의 토실 페닐알라닐클로로메틸케톤(TPCK)-트립신으로 바이러스 접종물을 보충하십시오.
- 이를 위해 0.5-3.0 플라크 형성 단위(pfu)/세포 7,11(MOI 계산 시 세포 수의 배가 계수)의 감염 다중도(MOI)로 400μL의 무혈청 최소 필수 배지(MEM)(재료 표 참조)에 바이러스 스톡을 희석하여 바이러스 접종물을 준비합니다.
- 세포에서 기존 배양 배지를 제거하고(단계 1.3) 1mL/웰의 무혈청 MEM 2x로 세포를 세척합니다.
- 400 μL의 바이러스 접종물(단계 1.4.1)을 세포에 첨가하고, 이들을 5%CO2 분위기 하에 35°C에서 1시간 동안 배양한다.
- 그 동안 카스파제 억제제(예: Z-DEVD-FMK), 리소좀 억제제(예:NH4Cl) 또는 프로테아좀 억제제(예: MG132)( 재료 표 참조)를 무혈청 MEM7 (재료 표 참조)에서 각각 최종 농도 40μM, 20mM 또는 10μM로 희석합니다. 후자의 두 억제제는 대조군 역할을합니다. 무혈청 배지에서 억제제 중 하나를 재구성하는 데 사용되는 동일한 부피의 용매(물 이외의 경우)를 모의로 희석합니다.
- 바이러스 접종물을 제거하고 단계 1.5(1x)에서와 같이 세포를 세척한다.
- 무혈청 MEM, 1mL/웰, 모의 또는 억제제 보충을 세포에 추가하고 단계 1.6과 같이 세포를 배양합니다. 이 시점은 0 시간 감염으로 간주됩니다.
- 24시간 후 1mL 주사기 플런저(고무 면)로 긁어 세포를 수확하고 1.5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
- 실온에서 12,000 x g 의 튜브를 1-2분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상청액을 수집합니다.
참고: 이 상청액은 폐기되거나 방출된 바이러스 자손의 역가를 측정하기 위한 플라크 분석8 에 사용될 수 있습니다. - 단계 1.11에서와 같이 재원심분리하여 250μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포 펠릿을 세척합니다.
- 상청액을 제거하고 80-100 μL의 세포 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 % 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS), 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 1 % 트리톤 X-100 및 1x 프로테아제 억제제 칵테일, 재료 표 참조)을 첨가하여 세포를 용해시키고 vortexing합니다.
- 튜브를 98°C에서 10분 동안 가열하여 완전히 용해시키고 전체 세포 용해물을 준비합니다. 다음 날 단계 1.15-1.17을 수행하기 위해 용해물을 4°C에서 저장하되, 최상의 결과를 얻으려면 이 단계를 같은 날에 완료하십시오.
- BCA 분석 키트를 사용하여 각 샘플의 단백질 양을 추정합니다( 재료 표 참조).
- 표준 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)11과 분자량 마커11로 감염되지 않은 샘플과 감염된 샘플에서 동일한 양의 단백질을 분해합니다.
- 단백질을 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮깁니다( 재료 표 참조).
참고 : PVDF 멤브레인은 일부 웨스턴 블롯 이미 저에서 높은 배경을 제공 할 수 있습니다. 호환성을 확인하십시오. - 다른 곳에서도 설명된 방법을 사용하여 관심있는 단백질을 검출하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행한다(11).
- 모의 처리 및 억제제 처리 감염된 샘플 레인의 단백질 수준을 비교합니다.
참고: 단백질 수준이 카스파제 억제제로 처리된 감염된 샘플 레인에서 회복되면 단백질은 카스파제에 의해 절단되거나 분해됩니다. 그렇지 않으면 리소좀 또는 프로테아좀에 의해 분해됩니다. - 동일한 실험의 최소 3회 반복에서 각 레인의 밴드 강도를 측정하고 해당 로딩 제어 밴드로 정규화하여 단백질 회수율을 정량화합니다.
- 최신 이미저 및 관련 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 웨스턴 블롯을 이미지화하고 단백질 회수율을 정량화합니다.
2. RNA 간섭에 의한 IAV 감염 세포에서 단백질의 카스파제 매개 절단 또는 분해 확인
- 개 또는 인간 카스파아제 3, 카스파아제 6, 및 카스파아제 7 (사형집행인 카스파제1) 및 비표적화 대조군 siRNA를 표적화하는 사전 설계된 소간섭 RNA (siRNA)를 설계 또는 수득한다( 재료 표 참조).
- 각각의 siRNA를 역형질감염 8,11에 의해 MDCK 또는 A549 세포에 전달한다.
- 이를 위해 100 μL의 적절한 배지(예: OptiMEM, 재료 표 참조)에 100nM의 대조군 siRNA 또는 카스파아제 siRNA 또는 권장 부피의 형질감염 시약(재료 표 참조)을 별도의 튜브에 희석하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 각 희석액을 이중으로 준비하십시오.
참고: 이 복제본에는 RT-qPCR 또는 웨스턴 블로팅(카스파제에 대한 항체가 사용 가능한 경우)에 의한 카스파아제 발현의 녹다운을 분석하기 위한 하나의 복제와 웨스턴 블로팅에 의한 관심 단백질의 회복을 평가하기 위한 다른 하나의 복제가 포함됩니다. - 각 siRNA 용액 100μL와 형질주입 시약 용액 100μL를 혼합하고(단계 2.3) 실온에서 20-45분 동안 배양하여 siRNA-형질주입 시약 복합체를 형성한다.
- 그 동안 800μL의 완전한 성장 배지에 1 x 10 5 MDCK 또는 A549 세포를 분할하여 추가하고, 200μL의 siRNA-형질주입 시약 복합체와 혼합하고(단계2.5 ), 현탁액 1mL를 12웰 배양 플레이트의 웰에 추가합니다. 이러한 희석은 대조군 siRNA 또는 카스파아제 siRNA의 최종 농도를 10nM로 만든다.
- 세포를 5% CO2 분위기 하에 37°C에서72 시간 동안 인큐베이션한다.
- 단계 1.10에서와 같이 하나의 복제물로부터 세포를 수확하고, 표준 방법및 프로토콜 8,11을 사용하여 각각 RT-qPCR 또는 웨스턴 블로팅에 의해 카스파아제 3, 카스파아제 6 및 카스파아제 7의 발현의 녹다운을 검증하거나 확인하기 위해 이들을 처리한다.
- 다른 복제물의 세포를 단계 1.4-1.9(억제제 없음)에 설명된 대로 IAV로 감염시킨다.
- 24시간 후, 세포를 수확, 처리 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고, 단계 1.10-1.20에 기재된 바와 같이 단백질 회수를 측정 및 정량화한다.
3. 폴리펩티드에서 카스파아제 절단 부위(들)를 찾기 위한 부위-지시된 돌연변이유발
- 관심 있는 유전자 코딩 단백질을 포유동물 발현 플라스미드11 에 복제하거나 연구실 또는 상용 공급원으로부터 수득한다( 재료 표 참조).
참고: 유전자가 에피토프 태그로 클로닝되거나 GFP 융합체로서 클로닝되어 외분비적으로 발현된 폴리펩티드를 웨스턴 블롯팅 동안 내인성으로 발현된 폴리펩티드와 구별하는 것이 바람직하다. - 카스파아제 기질 데이터베이스(4) 또는 단백질 정렬 도구를 사용하여, 폴리펩티드 상에서 컨센서스 카스파아제 절단 모티프, XXXD 및 DXXD를 위치시킨다. 거의 모든 카스파아제 절단 모티프는 절단 부위(P1)3,4에서 아스파르트산을 소유합니다.
- 표준 방법 및 프로토콜을 사용하여 DNA 시퀀싱11 에 이어 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 추정 P1 아스파르트산을 글루탐산 또는 비극성 아미노산(알라닌, 발린)으로 돌연변이시킵니다.
- 야생형 (WT) 및 돌연변이체 플라스미드 DNA를 역형질감염에 의해 MDCK 또는 A549 세포에 전달한다11.
- 이를 위해, 2 μg의 플라스미드 DNA 또는 형질주입 시약의 권장 부피를 100 μL의 적절한 배지(단계 2.3 및 재료 표 참조)에 별도의 튜브에 희석하고, 실온에서 5분 동안 배양한다.
- 각 플라스미드 DNA 용액 100μL와 형질주입 시약 용액 100μL를 혼합하고 실온에서 20-45분 동안 배양하여 DNA-형질주입 시약 복합체를 형성한다.
- 그 동안 3 x 105 MDCK 또는 A549 세포를 분할하여 800μL의 완전한 성장 배지에 추가하고, 200μL의 DNA-형질주입 시약 복합체와 혼합하고, 1mL 현탁액을 12웰 배양 플레이트의 웰에 추가합니다.
- 세포를 5%CO2 분위기 하에 37°C에서 인큐베이션한다.
- 48 시간 후, 단계 1.4-1.9에 설명 된대로 세포를 IAV로 감염시킵니다 (억제제를 추가하지 않음).
- 24시간 후, 세포를 수확, 처리하고, 웨스턴 블롯팅에 의해 분석한다 (적용가능한 경우, 에피토프 태그 또는 GFP에 대한 항체를 사용함). 그런 다음 단계 1.10-1.20에 설명된 대로 단백질 회수율을 측정하고 정량합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
카스파 아제 3 억제제로 치료
숙주 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6 폴리펩티드는 개 (MDCK) 및 인간 (A549, NHBE) 세포 7,8,9 모두에서 IAV 감염에 반응하여 분해되는 것으로 밝혀졌다. 상기 접근법을 사용함으로써, IAV-유도된 숙주 카스파제, 특히 카스파아제 3이 이들의 분해 7,8,9를 유발한다는 것이 밝혀졌다. 코르탁틴은 감염 용량- 및 시간-의존적 방식 및 숙주 세포- 및 IAV 균주-비의존적 방식으로 분해되었다7. HDAC48 및 HDAC69에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다. 흥미롭게도, 모든 3 숙주 단백질의 분해는 카스파제 매개 절단14를 겪는 것으로 알려진 바이러스 NP 7,8,9의 절단과 일치했다. 따라서, 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6도 카스파제 매개 절단 및 후속 분해를 겪는다는 가설이 세워졌다. 이를 시험하기 위해 먼저 IAV에 감염된 세포를 카스파제 3 억제제로 처리하고, 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6 폴리펩타이드의 구조를 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 모든 3개의 폴리펩티드 (뿐만 아니라 바이러스 NP)는 카스파제 3 억제제 처리 7,8,9 후에 IAV 감염-유도된 분해로부터 회복되었다. 코르탁틴에 대한 대표적인 데이터(7)는 도 1A에 나타내었다. 이 회수는 단백질 밴드의 강도를 측정하고 해당 액틴 (로딩 컨트롤) 밴드의 값으로 코르 탁틴 밴드의 값을 정규화하여 정량화되었습니다. 이어서, 상응하는 감염되지 않은 샘플에서 코르 탁틴의 정규화 된 값을 감염된 샘플에서의 그 값을 결정하기 위해 100 %로 간주되었다. 이러한 정량 방법은 카스파제 3 억제제-처리된 감염된 세포에서의 코르탁틴 폴리펩티드의 회수율을 미처리감염 세포7에서의 20.7%로부터 78.8%로서 차지하였다(도 1B).
카스파아제 3 발현의 RNA 간섭 매개 녹다운
다음으로, 유전 도구 인 RNA 간섭 (RNAi)을 사용하고, 웨스턴 블롯 (Western bloting)을 사용하여 코르 탁틴11 및 HDAC48의 IAV 감염 유도 분해에서 카스파 제의 역할을 확인했다. 카스파아제 3-고갈된 세포(도 2C)11에서, 코르탁틴(도 2A)11 및 HDAC48 폴리펩티드 둘 다 IAV 감염-유도된 분해로부터 회복되었다. 그러나, 카스파아제 6- 또는 카스파아제 7-고갈된 세포(도 2C)11에서, 코르탁틴 폴리펩티드 수준의 유의한 회복은 관찰되지 않았다(도 2A)11. 구체적으로, 상기 언급된 바와 같이 상응하는 비감염된 세포에서의 그의 수준을 정량화하고 비교하였을 때, 고갈된 카스파제 3 발현을 갖는 감염된 세포의 코르탁틴 폴리펩티드 수준은 정상 카스파제 3 발현을 갖는 감염된 세포의 28.6%에서 83%로 회복되었다(도 2B)11.
코르탁틴 및 HDAC6 폴리펩티드의 카스파제 절단 모티프
마지막으로, 코르탁틴 및 HDAC6 폴리펩티드의 아미노산 서열을 스크리닝하고, 추정 카스파아제 절단 모티프에서, P1 위치의 아스파르트산을 글루탐산 9,11로 돌연변이시켰다. 이 접근법은 코르탁틴 폴리펩티드11 중의 아스파르트산 116 및 HDAC6 폴리펩티드9 중의 아스파르트산 1088을 카스파아제 절단 부위로서 확인하였다. 두 아스파르트산 잔기의 글루탐산으로의 돌연변이는 코르탁틴(그림 3A)11 및 HDAC69 폴리펩티드를 IAV 감염으로 인한 분해에 내성으로 만들었습니다. 구체적으로, 상기 언급된 바와 같이 상응하는 비감염 세포에서의 그의 수준을 정량화하고 비교했을 때, 감염된 세포에서 플라스미드 발현 돌연변이 코르탁틴 폴리펩티드의 수준은 77.9%인 반면, 감염된 세포에서 플라스미드 발현 야생형 코르탁틴 폴리펩티드의 수준은 23.6%였다(그림 3B)11.
그림 1: 코르탁틴 폴리펩티드는 IAV 감염 세포 에서 카스파아제 3 매개 분해를 겪습니다. (A) MDCK 세포를 0.5의 MOI에서 인플루엔자 바이러스 A/뉴칼레도니아/20/1999/H1N1 균주에 감염시킨 후, 모의 또는 카스파아제 3 억제제(Cas3-I, 40μM)로 처리하였다. 24시간 후, 코르탁틴, 바이러스 NP 및 액틴 폴리펩티드를 웨스턴 블롯팅에 의해 총 세포 용해물에서 검출하였다. UNI, 감염되지 않은; INF, 감염되었습니다. 화살표는 전체 길이 및 절단 된 NP를 가리 킵니다. (B) 코르탁틴과 액틴 밴드의 강도를 정량화하였다. 이어서, 코르탁틴의 값은 액틴의 값으로 정규화되었다. UNI 샘플에서 코르탁틴의 정규화된 양은 해당 INF 샘플에서 그의 양을 결정하기 위해 100%로 간주되었습니다. 제시된 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 SE ± 평균이다. P = 0.0006, 이원 분산 분석을 사용하여 계산. NS, 중요하지 않습니다. 이 수치는 Chen et al.7에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 카스파아제 3 발현의 녹다운은 IAV 감염 세포에서 코르탁틴 폴리펩티드 분해를 구출했습니다. (A) A549 세포를 10 nM의 대조군 (Ctrl), 카스파아제 3 (Cas3), 카스파제 6 (Cas6), 또는 카스파제 7 (Cas7) siRNA로 복제하여 형질감염시켰다. 72시간 후, 하나의 반복에서 세포를 수확하고 처리하여 총 RNA를 추출했습니다. 다른 복제물의 세포는 MOI 3.0에서 인플루엔자 바이러스 A/WSN/1933/H1N1 아형에 감염되었습니다. 24시간 후, 코르탁틴, 바이러스 NP, 및 액틴 폴리펩티드를 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하였다. UNI, 감염되지 않은; INF, 감염되었습니다. (B) 코르탁틴과 액틴 밴드의 강도를 정량화하고, 코르탁틴의 값을 액틴의 값으로 정규화하였다. 그런 다음 UNI 샘플에서 정규화된 코르탁틴 양을 100% 고려하여 해당 INF 샘플에서 그의 양을 결정했습니다. 제시된 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 SE ± 평균이다. P < 0.0001, ***P = 0.0007, ***P = 0.0002, 이원 분산 분석을 사용하여 계산됨. NS, 중요하지 않습니다. (c) 위에서 추출한 총 RNA를 cDNA로 전환시킨 후, 이를 주형으로 사용하여 RT-qPCR에 의해 카스파아제 3, 카스파아제 6, 카스파아제 7 및 액틴 mRNA 수준을 검출하였다. 액틴 mRNA 수준을 기준으로 사용하였고, 대조군 siRNA (Ctrl) 및 각각의 카스파아제 siRNA (Cas) 형질감염된 세포에서 각 카스파아제의 mRNA 수준을 표준 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 계산하였다. P < 0.0001, 이원 분산 분석을 사용하여 계산됨. 이 수치는 Chen et al.11에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 글루탐산에 대한 아스파르트산 116의 돌연변이는 코르탁틴 폴리펩티드를 IAV 감염-유도된 분해에 내성으로 만들었다 . (a) MDCK 세포를 야생형 (WT) 또는 돌연변이된 (D116E) GFP-코르탁틴 융합체를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포는 3.0의 MOI에서 인플루엔자 바이러스 A/WSN/1933/H1N1 아형에 감염되었습니다. 24시간 후, GFP-코르탁틴, 바이러스 NP 및 액틴 폴리펩티드를 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하였다. UNI, 감염되지 않은; INF, 감염되었습니다. (B) 코르탁틴과 액틴 밴드의 강도를 정량화하고, 코르탁틴의 값을 액틴의 값으로 정규화하였다. 그런 다음 UNI 샘플에서 정규화된 코르탁틴 양을 100% 고려하여 해당 INF 샘플에서 그 양을 결정했습니다. 제시된 데이터는 3개의 생물학적 복제물의 SE ± 평균이다. **P = 0.001, 이원 분산 분석을 사용하여 계산됨. NS, 중요하지 않습니다. 이 수치는 Chen et al.11에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
바이러스는 숙주 요인과 경로를 자신의 이익에 맞게 조정한다는 것이 입증되었습니다. 차례로, 숙주 세포는 다양한 전략을 사용함으로써 그것에 저항합니다. 이러한 전략 중 하나는 숙주 세포가 바이러스 감염에 대한 항바이러스 전략으로 사용하는 PANoptosis입니다. 그러나 IAV와 같은 바이러스는 PANoptosis에 대응하고이를 유리하게 악용하기 위해 자체 전략을 발전시켰습니다1,3,6. 이 상호 작용은 카스파제에 의한 다양한 숙주 및 바이러스 단백질의 절단을 포함합니다. 기질 단백질에서 이러한 카스파제와 절단 부위를 식별하는 것은 이러한 상호 작용의 메커니즘과 중요성을 설명하는 데 중요합니다.
이를 위해, 표준 생화학적 및 분자적 방법을 사용하여 숙주 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6 7,8,9,11에서 카스파제 및 이들의 절단 부위를 확인하였다. 위에서 설명한 프로토콜은 인플루엔자 바이러스, 기타 포유류 바이러스, 기타 미생물 및 독소 및 화학 물질과 같은 외부 자극과 관련된 연구에 사용할 수 있습니다. 또한 이러한 방법은 관련 기술을 갖춘 표준 분자 생물학 실험실에서 복제 할 수 있으며 전문 장비 및 소프트웨어 교육이 필요하지 않습니다. 12웰 세포 배양 플레이트 형식은 웨스턴 블로팅 및 RT-qPCR에 의한 다운스트림 분석을 위한 충분한 샘플 양을 생성하기 위해 이러한 연구 및 유사한 연구에 성공적으로 적용되었습니다. 그럼에도 불구하고 필요에 따라 이 형식을 축소하거나 확장할 수 있습니다. 처음으로 카스파제 억제제와 관련된 실험을 수행할 때 관심 단백질이 카스파제 매개 분해를 겪는지 여부를 평가하기 위해 리소좀 및 프로테아좀 억제제와 함께 범-카스파제 억제제(Z-VAD-FMK)를 사용하는 것이 좋습니다. 또한,NH4Cl및 MG132 이외에, 각각 바필로마이신 A 및 에폭소미신과 같은 다른 리소좀 및 프로테아좀 억제제가 사용될 수 있다. 범 카스파 아제 억제제로 양성 결과를 얻은 후, 개별 카스파제의 특정 억제제를 사용하거나 RNA 간섭을 사용할 수 있습니다. 전자의 경우, 표적 세포 유형 및 비특이적 결과에 대한 독성을 피하기 위해 효과적인 억제 농도를 최적화하는 것이 중요하다.
RNA 간섭이나 CRISPR과 같은 유전 도구는 억제제가 교차 반응하기 때문에 카스파제의 관련성을 확인하기 위해 다음에 사용해야합니다. 대안적으로, 모든 공지된 카스파제를 개별적으로 표적화하는 RNA 간섭 또는 CRISPR 스크린이 수행될 수 있다. 모든 공지된 카스파제에 대한 siRNA, gRNA 및 RT-qPCR 프라이머 쌍은 사전 설계된 대로 조달하거나 온라인 도구를 사용하여 설계할 수 있습니다. 또한, 2 개 이상의 카스파제를 동시에 고갈시켜 폴리펩티드의 순차적 또는 협력적 절단을 평가할 수 있다(이 전략은 최근 아직 발표되지 않은 연구에서 사용되었다). RNA 간섭은 바이러스-숙주 세포 상호작용 연구에 이상적인 도구로 여겨집니다. 후자는 숙주 유전자 발현의 제어 된 조작을 필요로하므로 숙주 세포가 바이러스 감염에 대해 상대적으로 생존 가능하고 그 조작의 표현형을 표시하기 위해 수명주기가 완료됩니다. 그러나, 후속 감염에 대한 최적의 녹다운 및 생존율을 위해 각 세포 유형에 대해 효과적인 siRNA 농도 및 siRNA-형질감염 시약 조합을 최적화하는 것이 필요하다.
추정되는 카스파아제 절단 모티프를 찾기 위해, CASBAH18, CaspDB19, CutDB 20, DegraBase 21, MEROPS 22 및 TopFIND23,24와 같은 많은 데이터베이스가 개발되었다. HDAC6 polypetide9에서 이러한 모티프를 찾기 위해 육안 스크리닝이 수행되었지만 cortactin11의 경우 CaspDB가 사용되었습니다 (최근 CaspDB 웹 사이트에 액세스 할 수 없었지만). 이러한 모티프는 P1 아스파르트산을 글루탐산으로 돌연변이시킴으로써 카스파아제 절단 부위로 성공적으로 확인되었습니다. 그러나 아스파르트 산을 비극성 아미노산 유사 알라닌 또는 발린으로 먼저 돌연변이시키는 것은 일부 카스파제가 P1 글루탐산4 이후에 절단 될 수 있기 때문에 제안됩니다. 이 운동은 카스파아제 절단 부위(들)의 즉시 식별을 초래할 수 있지만, 표적 폴리펩티드가 아스파르트산이 풍부하고 추정되는 표적 모티프가 비정준인 경우 수십 개의 돌연변이를 생성해야 할 수 있다. 플라스미드 (및 siRNA)를 세포에 전달하기 위해, 역방향이 아닌 정방향으로, 형질 감염이 수행 될 수있다. 또한, 감염 용량 및 시간 동역학은 폴리펩티드의 분해 동역학을 평가하고 임의의 더 작은 크기의 절단 생성물을 확인하기 위해 웨스턴 블로팅을 위한 4%-20% 구배 SDS-PAGE를 사용하여 수행되어야 한다. 마지막으로, 관심 단백질을 직접 카스파아제 기질로 확인하기 위해 정제된 카스파제 및 표적 단백질(WT 또는 돌연변이) 및 모든 보조 인자를 포함하는 시험관 내 생화학 분석을 개발할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice and Phyllis Paykel Trust (뉴질랜드), HS and J.C. Anderson Trust (더니든), 미생물학 및 면역학과 및 생물 의학 학교 (University of Otago).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
References
- Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
- Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
- Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
- Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
- Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
- Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
- Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
- Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
- Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
- Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
- Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
- Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
- Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
- Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
- Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
- Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
- Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
- Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).
- Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
- Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).
