O presente protocolo descreve a bioengenharia de vesículas de membrana externa como uma plataforma de vacina "Plug-and-Display", incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.
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Artigo de método
Uma plataforma de vacina de nanopartículas "plug-and-display" baseada em vesículas de membrana externa exibindo o domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nanopartículas biomiméticas obtidas de bactérias ou vírus têm atraído um interesse substancial na pesquisa e desenvolvimento de vacinas. As vesículas da membrana externa (OMVs) são secretadas principalmente por bactérias gram-negativas durante o crescimento médio, com um diâmetro nanométrico e atividade auto-adjuvante, o que pode ser ideal para a administração da vacina. Os OMVs têm funcionado como um sistema de entrega multifacetado para proteínas, ácidos nucleicos e pequenas moléculas. Para aproveitar ao máximo as características biológicas das OMVs, as OMVs derivadas de Escherichia coli de bioengenharia foram utilizadas como transportadoras e o domínio de ligação ao receptor (RBD) do SARS-CoV-2 como antígeno para construir uma plataforma de vacina "Plug-and-Display". Os domínios SpyCatcher (SC) e SpyTag (ST) em Streptococcus pyogenes foram aplicados para conjugar OMVs e RBD. O gene da citolisina A (ClyA) foi traduzido com o gene SC como uma proteína de fusão após a transfecção do plasmídeo, deixando um sítio reativo na superfície das OMVs. Após a mistura do RBD-ST em um sistema tampão convencional durante a noite, formou-se ligação covalente entre as OMVs e o RBD. Assim, uma vacina OMV multivalente exibindo foi alcançada. Ao substituir por diversos antígenos, a plataforma de vacina OMVs pode exibir eficientemente uma variedade de antígenos heterogêneos, prevenindo assim potencialmente rapidamente epidemias de doenças infecciosas. Este protocolo descreve um método preciso para a construção da plataforma de vacina OMV, incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.
Introdução
Como potencial plataforma vacinal, as vesículas de membrana externa (OMVs) têm atraído cada vez mais atenção nos últimos anos 1,2. As OMVs, principalmente secretadas naturalmente por bactérias gram-negativas3, são partículas esféricas em nanoescala compostas por uma bicamada lipídica, geralmente no tamanho de 20-300 nm4. As OMVs contêm vários componentes bacterianos parentais, incluindo antígenos bacterianos e padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), que servem como potencializadores imunológicos sólidos5. Beneficiando-se de seu....
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Protocolo
1. Construção do plasmídeo
- Inserir a sequência SpyCatcher codificadora de DNA (Arquivo Suplementar 1) em um plasmídeo pThioHisA-ClyA resistente à ampicilina (ver Tabela de Materiais) entre os sítios BamH I e Sal I para construir o plasmídeo pThioHisA ClyA-SC seguindo um relatóriopublicado anteriormente 20.
- Ligue o gene de fusão sintetizado SpyTag-RBD-Histag (Arquivo Suplementar 1) em um plasmídeo pcDNA3.1 (ver Tabela de Materiais) entre os sítios BamH I e EcoR I para construir o plasmídeo pcDNA3.1 RBD-ST seguindo um relatório public....
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Resultados
O fluxograma desse protocolo é mostrado na Figura 1. Este protocolo poderia ser uma abordagem geral para a utilização de OMVs como uma plataforma de vacinas; basta escolher os sistemas de expressão apropriados com base no tipo de antígenos.
A Figura 2 fornece um esquema de projeto de plasmídeos viável. O gene SC está conectado com o gene ClyA através de um ligador flexível, enquanto ST se conecta ao terminal 5' do gene RBD com um gene.......
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Discussão
Para criar uma plataforma de vacina de nanopartículas "Plug-and-Display", a ClyA fundida por SC foi expressa em cepas BL21(DE3), que é um dos modelos mais utilizados para a produção de proteínas recombinantes devido às suas vantagens na expressão proteica24, de modo que haveria fragmento de SC suficiente exibido na superfície das OMVs durante o processo de proliferação de bactérias. Ao mesmo tempo, um antígeno-alvo fundido ST foi preparado para o acoplamento químico entre os antígenos e OMVs. As v.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) e o Projeto da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 31670936, 82041045).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ampicilina sódica | Sangon Biotech | A610028 | |
| Contador de células automatizado | Kit | BioTech | |
| cwbio | cw0014s | ||
| Sistema de Imagem de Toque ChemiDoc | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Aparelho de eletroforese | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| pAb de cabra para camundongo IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| Centrífuga de congelamento de alta velocidade | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Tecnologia de sinalização celular | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | ||
| Isopropil beta-D-tiogalactopiranosídeo | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Leite em pó desnatado | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 meio de cultura de células | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmídeo | Wuhan genecreat tecnologia | ||
| Tampão fosfato salina | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polietilenonimina Policiências Lineares | 23966-1 | ||
| Escada de proteína Prestained | Thermo | 26616 | |
| plasmídeo pThioHisA ClyA-SC | Wuhan genecreat tecnologia | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | ||
| sistemas de bancada Quixstand (coluna de fibra oca de 100 kD) | Buffer de carregamento GE healthcare | ||
| SDS-PAGE (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Cloreto de sódio | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (solução de quimioluminescência aprimorada) | Thermo | 34577 | |
| Instrumento de suspensão | misturador | Hula da Life Technology | |
| Hitachi | HT7800 | ||
| de LP0042B | oxóide triptona | ||
| Beckman coulter | XPN-100 | ||
| Espectrofotômetro ultravioleta | Hitachi | U-3900 | |
| Extrato de levedura | Sangon Biotech | A610961 |
Referências
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. ....
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Reimpressões e permissões
