Summary
Apresenta-se aqui um protocolo para a preparação e calibração tampão de extratos celulares de cepas knockout de exonuclease V de Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD e ΔrecB). Esta é uma abordagem rápida, fácil e direta para a expressão em sistemas de síntese de proteínas livres de células usando modelos lineares de DNA.
Abstract
A síntese de proteínas livres de células (CFPS) tornou-se recentemente muito popular no campo da biologia sintética devido às suas inúmeras vantagens. O uso de modelos lineares de DNA para CFPS permitirá que a tecnologia atinja todo o seu potencial, diminuindo o tempo experimental, eliminando as etapas de clonagem, transformação e extração de plasmídeos. O DNA linear pode ser rápida e facilmente amplificado por PCR para obter altas concentrações do molde, evitando potencial toxicidade de expressão in vivo. No entanto, os modelos lineares de DNA são rapidamente degradados por exonucleases que estão naturalmente presentes nos extratos celulares. Existem várias estratégias que têm sido propostas para enfrentar este problema, tais como a adição de inibidores de nuclease ou modificação química de extremidades lineares de DNA para proteção. Todas essas estratégias custam tempo e recursos extras e ainda não obtiveram níveis quase plasmídicos de expressão proteica. Um protocolo detalhado para uma estratégia alternativa é apresentado aqui para o uso de modelos de DNA linear para CFPS. Usando extratos celulares de células nocauteadoras deficientes em exonuclease, os modelos lineares de DNA permanecem intactos sem a necessidade de modificações finais. Apresentamos as etapas de preparação do lisado celular da cepa Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lise sonicação e calibração tampão para Mg-glutamato (Mg-glu) e K-glutamato (K-glu) especificamente para DNA linear. Este método é capaz de atingir níveis de expressão de proteínas comparáveis aos do DNA plasmídico em E. coli CFPS.
Introduction
Os sistemas de síntese proteica livre de células (CFPS) estão sendo cada vez mais utilizados como um método rápido, simples e eficiente para engenharia de biossensores, fabricação descentralizada e prototipagem de circuitos genéticos1. Devido ao seu grande potencial, os sistemas CFPS são utilizados regularmente no campo da biologia sintética. No entanto, até agora, os sistemas CFPS dependem de plasmídeos circulares que podem limitar a tecnologia de atingir todo o seu potencial. A preparação do DNA plasmídico depende de muitas etapas demoradas durante a clonagem e de grandes quantidades de isolamento de DNA. Por outro lado, a amplificação por PCR a partir de um plasmídeo, ou um molde de DNA sintetizado, pode ser usada para simplesmente preparar modelos de CFPS dentro de algumas horas 2,3. Portanto, a aplicação de DNA linear oferece uma solução promissora para a SFCP. No entanto, o DNA linear é rapidamente degradado pelas exonucleases naturalmente presentes nos extratos celulares4. Existem soluções que abordam esse problema, como o uso da proteína λ-fago GamS5 ou DNA contendo sítios Chi6 como agentes protetores, ou a proteção direta do DNA linear por modificação química de suas extremidades 2,7,8,9. Todos esses métodos requerem suplementações ao extrato celular, que são caros e demorados. Sabe-se há muito tempo que o complexo exonuclease V (RecBCD) degrada o DNA linear em lisados celulares4. Recentemente, mostramos que o DNA linear pode ser muito melhor protegido em lisados de células nocauteadas por genes exonuclease (recBCD)10.
Neste protocolo, as etapas para a preparação de lisados livres de células da cepa E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lise sonicação são descritas em detalhes. A lise sonicativa é uma técnica comum e acessível empregada por vários laboratórios11,12. Os extratos produzidos a partir desta estirpe não necessitam da adição de qualquer componente extra ou modificação do molde de ADN para suportar a expressão a partir de moldes de ADN lineares. O método baseia-se na etapa essencial de otimização de tampão para extratos celulares especificamente para a expressão linear de DNA de promotores nativos de E. coli. Demonstrou-se que essa otimização específica do tampão para a expressão linear do DNA é a chave para que os promotores nativos do σ70 produzam alta produção de proteínas sem suplementação de proteína GamS ou DNA Chi, evitando até mesmo a purificação dos produtos de PCR10. A concentração ótima de Mg-glu para a expressão linear do DNA foi semelhante à do DNA plasmídico. No entanto, a concentração ótima de K-glu mostrou uma diferença substancial entre o DNA linear e plasmídico, provavelmente devido a um mecanismo relacionado à transcrição10. A funcionalidade das proteínas expressas por esse método tem sido demonstrada para diversas aplicações, como a triagem rápida de interruptores de dedo do pé e a avaliação da atividade de variantes enzimáticas10.
Este protocolo fornece uma solução simples, eficiente e econômica para o uso de modelos lineares de DNA em sistemas livres de células de E. coli simplesmente usando extratos de células ΔrecBCD mutantes e calibração específica para DNA linear como modelo.
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Protocol
1. Preparação de meios e buffers
- Preparação de meio 2xYT+P (sólido e líquido)
- Preparar meios líquidos e sólidos, conforme descrito na Tabela 1, e, em seguida, esterilizar por autoclavagem.
NOTA: Este protocolo requer uma placa de ágar 2xYT+P contendo cloranfenicol (10 μg/mL). O volume do meio líquido é proporcional ao volume do lisado necessário. Aqui, um volume inicial de 5 L de mídia líquida 2xYT+P é usado. No entanto, o volume pode ser ajustado conforme necessário, sabendo que 1 L da cultura celular resulta em 2 a 3 mL do lisado celular final.
- Preparar meios líquidos e sólidos, conforme descrito na Tabela 1, e, em seguida, esterilizar por autoclavagem.
- Preparação de cloranfenicol (34 mg/mL)
- Pesar 0,34 g de cloranfenicol, adicionar etanol a 10 ml e dissolver por mistura. Aliquot 1 mL cada em vários tubos e armazenar a -20 °C para usar mais tarde.
- Preparação do buffer S30A
- Prepare o buffer S30A de acordo com a Tabela 2, visando 2 L desse buffer.
Observação : mais uma vez, o volume deste buffer é proporcional ao volume do lisado necessário. - Antes da autoclavagem, ajuste o pH do tampão para 7,7 usando ácido acético glacial.
- Autoclave o buffer.
- Manter este tampão a 4 °C após a autoclavagem.
- Antes de utilizar, adicione TDT (filtrada por um filtro de membrana de 0,22 μm) ao tampão S30A para atingir uma concentração final de 2 mM (2 ml de reserva, 1 M de TDT a 1 L de tampão S30A).
Observação : mais uma vez, o volume deste buffer é proporcional ao volume do lisado necessário.
- Prepare o buffer S30A de acordo com a Tabela 2, visando 2 L desse buffer.
- Preparação da solução energética
NOTA: Esta solução de energia é baseada no artigo13 de Sun et al. (concentração de estoque de 14x). A Tabela 3 recapitula os componentes necessários para a preparação do estoque de solução energética, com números de catálogo para todos os produtos químicos utilizados neste protocolo.- Preparar as soluções-mãe de acordo com o quadro 3 e mantê-las sobre gelo.
- Calibrar o pH conforme solicitado para os componentes indicados, seja com tampão Tris 2 M (60,57 g de base Tris em um volume de 250 mL de água estéril) ou KOH 15% (15 g de KOH em um volume de 100 mL de água estéril) conforme indicado na Tabela 3.
- Em um tubo de 15 mL, adicionar o volume de cada componente na ordem indicada na Tabela 3.
- Aliquotar a solução energética, 150 μL por tubo.
- Alíquotas de congelamento relâmpago em gelo seco e conservar a -80 °C.
- Preparação da solução de aminoácidos (AA)
NOTA: A solução de aminoácidos é preparada pelo kit RTS Amino Acid Sampler. Cada um dos 20 aminoácidos é fornecido neste kit como um volume de 1,5 mL a 168 mM, exceto a leucina, que está a 140 mM. Aqui, a solução de estoque preparada é 4x concentrada, em vez da solução de trabalho necessária. A concentração final da solução de aminoácidos é de 6 mM para todos os aminoácidos, exceto leucina, que está a 5 mM.- Descongelar os 20 tubos de aminoácidos por vórtice e incubar a 37 °C até estarem completamente dissolvidos.
NOTA: Cys não pode dissolver-se completamente. - Em um tubo de 50 mL, adicionar 12 mL de água estéril e 1,5 mL cada um dos aminoácidos na ordem indicada na Tabela 4.
- Vórtice até que a solução esteja bastante límpida, incubando a 37 °C, se necessário.
NOTA: Cys não pode dissolver-se completamente. - Alíquota 500 μL da solução de aminoácidos por tubo sobre gelo.
- Congelar rapidamente as alíquotas no gelo seco e conservar a -80 °C.
- Descongelar os 20 tubos de aminoácidos por vórtice e incubar a 37 °C até estarem completamente dissolvidos.
- Preparação de soluções para calibração de buffer
- Preparar a solução-mãe para Mg-glu (100 mM) e K-glu (3 M), conforme indicado no quadro 5. Efectuar uma diluição em série (em volume de 1 ml) destas existências para Mg-glu (0 a 20 mM) e K-glu (20 a 300 mM), conforme indicado no Ficheiro Suplementar 1 para as etapas de calibração.
NOTA: Estas concentrações de existências destinam-se à fase de calibração e poderão ter de ser alteradas aquando da instalação da experiência final. As concentrações mais elevadas das unidades populacionais testadas para este protocolo são 1 M e 4,5 M para Mg-glu e K-glu, respectivamente.
- Preparar a solução-mãe para Mg-glu (100 mM) e K-glu (3 M), conforme indicado no quadro 5. Efectuar uma diluição em série (em volume de 1 ml) destas existências para Mg-glu (0 a 20 mM) e K-glu (20 a 300 mM), conforme indicado no Ficheiro Suplementar 1 para as etapas de calibração.
- Preparação do estoque de solução PEG8000
- Preparar 50 ml de solução de PEG8000 a 40% (20 g de PEG8000 num volume de 50 ml de água estéril).
2. Cultura celular e preparação de lisado (experimento de 4 dias)
- Dia 1
- Estirpe BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (Tabela 6) do stock de glicerol de -80 °C para uma placa de ágar 2xYT+P que contém 10 μg/ml de cloranfenicol. Alternativamente, BL21 Rosetta2 ΔrecB (Tabela 6) também pode ser usado10.
- Incubar durante a noite a 37 °C.
- Dia 2
- Inocular uma única colônia da placa de ágar acima em 10 mL de 2xYT+P suplementado com 10 μg/mL de cloranfenicol.
- Incubar durante a noite a 37 °C com agitação a 200 rpm.
- Dia 3
- Faça uma subcultura diluindo a cultura noturna 100 vezes em 4 L de meio fresco de 2xYT+P contendo 10 μg/mL de cloranfenicol.
NOTA: Por exemplo, 40 mL da cultura noturna são adicionados em 3960 mL de meio fresco. Após diluição, o meio de 4 L é dividido em 4 balões (volume de 5 L), de modo a que cada balão contenha 1 L. - Incubar a 37 °C, 200 rpm por cerca de 3 a 4 h de crescimento para atingir um OD600 de 1,5-2,0. Diluir a cultura em 4x se medir OD600 > 0,8.
NOTA: O tempo exato de incubação pode variar de acordo com a cepa, o inóculo inicial, o material de laboratório e os instrumentos utilizados. As estirpes knockout ΔrecB/ΔrecBCD apresentam taxas de crescimento comparáveis às parentais BL21 Rosetta2 (Figura Suplementar 1). - Coloque a cultura no gelo.
- Girar as células a 5.000 x g durante 12 min a 4 °C e, em seguida, eliminar o sobrenadante por decantação.
- Ressuspeite os pellets celulares em 800 ml de S30A+TDT refrigerado.
NOTA: O volume de S30A+TDT é 5x inferior ao volume de cultura celular original. Por exemplo, para um volume inicial de 1 L da cultura celular, ressuscite os pellets celulares em 200 mL de S30A+TDT. Recomenda-se também realizar esta etapa em uma câmara fria a 4 °C, bem como manter todos os materiais no gelo. - Girar as células a 5.000 x g durante 12 min a 4 °C e, em seguida, eliminar o sobrenadante por decantação.
- Repita as etapas 2.3.5 e 2.3.6.
- Ressuspeite os pellets celulares em 160 ml de S30A+TDT refrigerados.
NOTA: Desta vez, o volume de S30A+TDT é 25x inferior ao volume de cultura celular original. Por exemplo, para um volume inicial de 1 L da cultura celular, ressuscite os pellets celulares em 40 mL de S30A+TDT. Novamente, recomenda-se realizar esta etapa em uma câmara fria a 4 ° C, bem como para manter os materiais no gelo. - Transfira as células para tubos de 50 mL refrigerados e pré-pesados.
- Girar as células a 2.000 x g durante 8 min a 4 °C e, em seguida, eliminar o sobrenadante por decantação.
- Gire as células a 2.000 x g durante 4 min a 4 °C e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante restante utilizando uma pipeta.
- Re-medir o peso do tubo para calcular o peso do pellet de célula.
- Mantenha os pellets de células a -80 °C.
- Faça uma subcultura diluindo a cultura noturna 100 vezes em 4 L de meio fresco de 2xYT+P contendo 10 μg/mL de cloranfenicol.
- Dia 4
- Pegue os pellets de células de -80 °C e descongele-os no gelo por 1-2 h.
- Ressuspender os pellets celulares em 0,9 ml de tampão S30A+TDT por grama do peso dos pellets. Pipetar lentamente para ressuspender as células, evitando a espuma superior, tanto quanto possível, se houver.
- Coloque alíquotas de 1 mL das células ressuspensas em microtubos de 1,5 mL e mantenha-as no gelo ou em um bloco frio pré-resfriado a 4 °C (é preferível usar blocos metálicos).
NOTA: Se a última alíquota for muito menor que 1 mL, é melhor descartá-la do que sonicar um volume abaixo do ideal. O volume ideal (1 mL) para sonicação foi determinado para esta configuração (tubo, sonicador e sonda), e pode variar para um diferente. - Sonicate cada tubo em um sonicator (sonda de 3 mm, frequência 20 kHz), com uma configuração de amplitude de 20% por três ciclos (sonicação de 30 s, pausa de 1 min).
NOTA: A energia total entregue ao longo dos três ciclos foi de ~266 Joules (~80-110 Joules por ciclo). Durante esta etapa, mantenha os tubos no bloco frio que é cercado por gelo. Alterne entre dois blocos frios para evitar o superaquecimento da sonda (o bloco frio de espera também é mantido frio no gelo). Ambos os blocos frios foram pré-resfriados na geladeira no dia anterior à sonicação. - Gire o lisado a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Recolher o sobrenadante (lisado celular) com uma pipeta e transferir para um tubo de 50 ml.
- Incubar o lisado celular a 37 °C a 200 rpm de agitação durante 80 min.
- Gire o lisado a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Recolher o sobrenadante e a alíquota de 30 μL cada em microtubos pré-refrigerados de 1,5 ml, mantendo todos os tubos no gelo.
- Congelar rapidamente as alíquotas de lisado no gelo seco e conservar a -80 °C.
3. Calibração de tampão livre de células para DNA linear
NOTA: O tampão livre de células foi calibrado para concentrações ótimas de Mg-glu e K-glu, conforme descrito em Sun et al.13. O Arquivo Suplementar 1 é necessário para as etapas de calibração. As reações foram ajustadas para um volume final de 10,5 μL cada. Os extractos foram calibrados utilizando 1 nM de ADN linear (ver secção 4 abaixo) ou plasmídico. Os experimentos podem ser realizados no mesmo dia em que os tampões são preparados, ou os tampões preparados podem ser congelados a -80 °C para realizar o experimento em outro dia. Para todas as etapas de calibração, cada componente foi descongelado no gelo antes de misturar e pipetar em uma placa de 384 poços.
- Prepare um Master Mix, de acordo com a guia 'Buffer Preparation' no arquivo Excel Arquivo Suplementar 1, contendo: (a) extrato celular (33% do volume total de reação), (b) DNA do repórter (como DNA linear e/ou plasmídico) até uma concentração final de 1 nM, (c) tampão livre de células (PEG8000, solução AA e solução energética) e (d) K-glu até uma concentração final de 80 mM.
- Para um volume de reação de 10,5 μL, pegue 1,05 μL (reação total de 10%) de diferentes concentrações de Mg-glu 10x concentrado (faixas de concentração final: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 e 20 mM) e adicione 9,45 μL (reação total de 90%) do Master Mix. Misture suavemente.
NOTA: Use tubos de oito tiras de PCR para preparar as diluições e misture com uma pipeta multicanal. Se necessário, pode ser utilizada uma gama diferente de concentrações de Mg-glu. - Pipete 10 μL das reações acima em uma microplaca de fundo quadrado de 384 poços, cubra-a usando um selo de placa adesiva e meça a expressão gênica como saída de fluorescência. Registrar dados de fluorescência com um leitor de placas (Ex: 485 nm; Em: 528 nm) em intervalos regulares (por exemplo, 5 min) por 8 h de incubação a 30 °C com agitação orbital contínua a 307 cpm.
NOTA: Se necessário, gire a microplaca de 384 poços (<2.500 x g, 1 min, temperatura ambiente) antes de iniciar a aquisição de dados. Medidas de end-point foram utilizadas para comparar a expressão de GFP nas diferentes composições de tampão. Os valores de fluorescência podem ser convertidos em unidades padronizadas para plotagem (veja abaixo). - Identifique a concentração de Mg-glu que resulta no maior valor de fluorescência no ponto final.
NOTA: Se não tiver a certeza sobre a concentração óptima de Mg-glu obtida, repita o passo 3.2 com intervalos de concentração mais diversificados. - Com a concentração otimizada de Mg-glu, prossiga para a calibração de K-glu para uma faixa de concentrações (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 e 240 mM), usando os mesmos volumes indicados na etapa 3.2. Execute o experimento e identifique o maior valor de fluorescência entre as concentrações de K-glu testadas. Isso indica a composição ideal do tampão para Mg-glu e K-glu para este lisado.
NOTA: Se não tiver certeza sobre a concentração ideal de K-glu obtida, repita a etapa com faixas de concentração mais diversas. - Uma vez estabelecidos os valores de Mg-glu e K-glu, prepare os tubos de estoque da composição otimizada do tampão de acordo com o volume do lote obtido. Utilize o separador «Buffer Preparation» no Ficheiro Suplementar 1 para calcular o número de tubos tampão necessários, alíquota de 38 μL por tubo, e armazenar a -80 °C.
4. Preparação linear do ADN
NOTA: Para a calibração do lisado, o plasmídeo P70a-deGFP é usado. Este plasmídeo foi mantido em E. coli KL740 cl857+ (Tabela 6) para miniprep usando o Plasmid Miniprep Kit, ou maxiprep usando o Plasmid Maxiprep Kit. Os fragmentos de DNA linear utilizados como modelos de expressão nas reações livres de células foram amplificados por PCR utilizando os primers e modelos listados na Tabela 7 e na Tabela 8.
- A PCR amplifica a partir do plasmídeo P70a-deGFP usando DNA polimerase com oligoprimers listados na Tabela 7. Configure as reações de PCR em um volume de 50 μL, de acordo com o protocolo do fabricante, usando o programa termociclador: [98 °C por 2 min; 40 ciclos x (98 °C por 30 s → 66 °C por 30 s → 72 °C por 60 s); 72 °C por 10 min; 4 °C por ∞].
- Digerir o DNA molde nas reações de PCR adicionando 1 μL de enzima de restrição de DpnI por reação de PCR de 50 μL e incubar a 37 °C por 1 h. Em seguida, purifique a reação de PCR usando um kit de limpeza de PCR e DNA e elute em água livre de nuclease.
- Verifique os produtos de PCR em um gel de agarose a 1% (1x TAE) antes do uso.
- Quantifique os produtos de PCR purificados (ou os preparativos de plasmídeos) usando Nanodrop (ND-1.000).
NOTA: Se utilizar uma DNA polimerase/tampão que seja diretamente compatível com a reação livre de células a jusante, a etapa de purificação (etapa 2) pode ser ignorada inteiramente e a concentração de DNA não purificado medida por um ensaio fluorométrico com corante de ligação ao DNA (ver Batista et al.10).
5. Execução experimental
NOTA: Além de utilizar o ficheiro suplementar 1 para calibrar o depósito regulador para cada lote de lisado preparado (acima), recomenda-se utilizar o separador «Preparação da reacção» no ficheiro para configurar as reacções subsequentes isentas de células. Como antes, o volume das reações é fixado em 10,5 μL por reação, dos quais apenas 10 μL são finalmente pipetados para a placa de 384 poços para aquisição de dados. Aqui, 5 nM de cada modelo são usados para expressão livre de células. É importante ser consistente ao pipetar as reações - use a mesma pipeta e o tipo de pontas. Dispense cuidadosamente para evitar bolhas no poço ou qualquer líquido que grude nas paredes do poço. Se necessário, gire a placa para baixo (<2.500 x g, 1 min, temperatura ambiente).
- Calcular os volumes a pipetar introduzindo as descrições e repetições da amostra necessárias por amostra no separador «Preparação da reacção» do processo suplementar 1.
NOTA: Se for necessário um volume de reação diferente de 10,5 μL, isso também poderá ser inserido no Arquivo Suplementar 1. O arquivo calculará o número de tubos de estoques reguladores previamente otimizados e os tubos de extração de células a serem descongelados no gelo. - Rotule um microtubo de 1,5 mL para a preparação do Master Mix Ótimo (separadamente para DNA linear e plasmídico), adicione os volumes corretos do Tampão e do Lisado e misture suavemente.
NOTA: Devido a diferenças nas concentrações óptimas de K-glu nos seus tampões, devem ser feitas cópias do separador "Preparação da Reacção" para utilização separada para ADN linear e plasmídico. - Pipete as amostras de DNA primeiro, seguidas por água livre de nuclease e, finalmente, o Optimal Master Mix (MM) da etapa 5.2. Misture a reação sem células suavemente com a pipeta antes de adicionar ao leitor de placas e evite bolhas.
NOTA: Use um tubo de oito tiras de PCR para misturar o volume de reação para uma replicação adicional. Por exemplo, se forem destinados triplicados técnicos, prepare uma mistura para quatro reações e deixe um volume morto no tubo para reduzir os erros de pipetagem ao adicionar as amostras à placa. - Configurar as reacções no leitor de placas (Ex 485 nm; Em 528 nm). As corridas cinéticas registraram dados de fluorescência em intervalos regulares (por exemplo, 5 min) por 8 h de incubação a 30 °C, com agitação orbital contínua a 307 cpm.
NOTA: As medidas do ponto final foram relatadas como o ponto de tempo de 8 h. Os valores de fluorescência coletados estão em unidades arbitrárias (u.a.), mas podem ser convertidos em unidades padronizadas para plotagem (veja abaixo).
6. Quantificação relativa do FITC e da GFP
NOTA: A expressão GFP é exportada pelo leitor de placas em unidades de fluorescência arbitrárias (u.a.). No entanto, recomenda-se o uso de unidades de medida padronizadas para comparar os valores de fluorescência entre diferentes configurações (lotes, equipamentos, usuários e laboratórios). Apresentamos aqui etapas detalhadas para converter os valores de fluorescência (u.a.) em valores equivalentes a FITC e eGFP (μM), usando curvas padrão de NIST-FITC e eGFP recombinante. Conservar a solução-mãe NIST-FITC a 4 °C e conservar a eGFP recombinante a -20 °C. Certifique-se de que a solução-mãe e as diluições em série estão protegidas da luz. Após a entrega, recomenda-se alíquota da eGFP recombinante em volumes menores para evitar múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento.
- Preparar uma solução de borato de sódio a 100 mM, pH 9,5, e conservar à temperatura ambiente ou a 4 °C.
- Preparar 12 diluições (70 μL cada) para a curva padrão, 2x por passo (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562, 0,781, 0,390, 0,195, 0,097, 0,048 e 0 μM) do padrão FITC rastreável pelo NIST a partir do estoque de 50 μM usando a solução de borato de sódio. Preparar a série de diluição em triplicado.
- Semelhante à etapa 6.2, prepare diluições seriadas (70 μL cada) da eGFP recombinante usando a solução de borato de sódio (1,2, 0,3, 0,075, 0,0188, 0,0047, 0,0012, 0,0003, 0,00007 e 0 μM). Para o cálculo da molaridade, considere o tamanho total da proteína (28 kDa) e a concentração da eGFP purificada (1 g/L). Preparar a série de diluição em triplicado.
- Adicionar 20 μL de cada diluição (nove poços cada = três séries de diluições x três repetições técnicas) em uma microplaca de fundo quadrado de 384 poços, coberta por um selo de placa adesiva, e incubar em um leitor de placas para medição.
NOTA: Aqui, as configurações utilizadas foram Excitação: 485/20, Emissão: 528/20, com ganho 50. No entanto, combinações adicionais de comprimento de onda/ganho também podem ser usadas para calibrar outras moléculas fluorescentes e/ou configurações de ganho. Para calcular o fator de conversão, as mesmas configurações de comprimento de onda e ganho são necessárias para adquirir os dados de fluorescência GFP dos experimentos livres de células e os dados de curva padrão. - Use a faixa de sinal linear (aqui, por exemplo, [FITC] ≤ 0,781 μM) para ajustar a inclinação [y = machado e R2] para cada condição.
NOTA: A gama pode diferir para diferentes máquinas e soluções padrão utilizadas. - Salve os dados para calibração de FITC e eGFP para calcular medições relativas para o laboratório seguindo o exemplo na Tabela 9. Divida os valores obtidos em unidades arbitrárias de fluorescência (u.a.) pelo valor "a" da inclinação da curva (y = ax) para estimar a produção de GFP em termos de FITC ou eGFP.
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Representative Results
Resultados representativos são mostrados aqui após a calibração do lisado para os níveis ideais de Mg-glutamato e K-glutamato separadamente para DNA linear e plasmidial (Figura 1). A concentração ótima de Mg-glutamato é semelhante entre os extratos Δ recB e ΔrecBCD a 8 mM (Figura 1B). No entanto, a concentração ótima de K-glutamato para o DNA plasmídico é de 140 mM, enquanto a concentração ótima de K-glutamato para o DNA linear para o mesmo extrato é de 20 mM (Figura 1C). Em uma análise comparativa da expressão de GFP em extratos de células WT e ΔrecBCD, observou-se que a composição tampão dos extratos deve ser especificamente calibrada para a expressão ótima do DNA linear e plasmídico usado em extratos eliminados da exonuclease V.
Após as etapas de calibração, os níveis de expressões de GFP foram comparados a partir do DNA linear e plasmidial (5 nM) no extrato WT e ΔrecBCD (Figura 1D). A expressão de GFP a partir de DNA linear atingiu 102% e 138% da expressão de DNA plasmídico em extratos de cepas ΔrecB e ΔrecBCD , respectivamente. Juntos, esses resultados mostram que a expressão do DNA linear, usando um promotor nativo de E. coli σ70, pode atingir o mesmo nível que o da expressão plasmídica quando o lisado celular é preparado a partir de tais mutantes e o tampão livre de células é especificamente calibrado para o DNA linear.
Figura 1: Otimização diferencial do tampão para DNA linear e plasmídico em extratos ΔrecB/ΔrecBCD . (A) Um amplificador de DNA linear de 1361 pb foi amplificado a partir do plasmídeo p70a-deGFP e usado como modelo de expressão gênica para calibração de tampão. (B) Calibração do tampão mg-glutamato com 1 nM de cada tipo de DNA utilizando diferentes concentrações de 0 a 20 mM (com K-glutamato fixado a 80 mM). As caixas quadradas indicam os pontos de concentração escolhidos. P = DNA plasmídico, L = DNA linear. (C) Após a seleção da concentração ideal de Mg-glutamato para cada lisato, o K-glutamato foi titulado de 20 a 240 mM. As caixas quadradas indicam os pontos de concentração escolhidos. P = DNA plasmídico, L = DNA linear. Os dados mostrados nos mapas de calor (B) e (C) são de um único experimento. (D) Após a calibração do tampão, foram realizadas reações livres de células com 5 nM de cada tipo de DNA. O extrato BL21 Rosetta2 não suporta a expressão linear de DNA, enquanto extratos diferencialmente otimizados de cepas ΔrecB e ΔrecBCD exibem expressão linear de DNA (verde) semelhante aos níveis de DNA plasmidial (azul). Os dados do endpoint mostrados são DP médios ± para três repetições feitas no mesmo dia e coletadas após 8 h de incubação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação visual do protocolo. Fluxo de trabalho para preparação de lisado celular e otimização de lisado para DNA linear como um molde na síntese de CFPS. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Lista de componentes para preparação de meios líquidos e sólidos 2xYT+P. A quantidade (em gramas) de cada componente é especificada para 1 L de meio. Aumente a escala proporcionalmente conforme necessário. A mídia deve ser autoclavada antes do uso. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Lista de componentes para preparação do buffer S30A+TDT. A quantidade (em gramas) de cada componente é especificada para 1 L de tampão S30A. Aumente a escala proporcionalmente conforme necessário. O tampão S30A deve ser autoclavado e, em seguida, refrigerado (4 °C) antes da utilização. O tampão TDT deve ser preparado e filtrado separadamente, conforme indicado (em tubo de 15 ml) e armazenado em -20 °C. Logo antes de usar o buffer S30A, adicione 2 mL de TDT (de 1 M de estoque) a 1 L de buffer S30A. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Quadro 3: Lista de componentes para a preparação de soluções energéticas. A quantidade (em gramas) ou o volume de cada componente é especificado (na coluna G) para a preparação de um volume especificado (na coluna H) de soluções-mãe para a concentração indicada (na coluna F). O pH de cada componente deve ser ajustado, se necessário, conforme indicado (nas colunas I e J). O estoque de solução energética de 14x é preparado misturando o volume listado de cada componente (na coluna K) na ordem listada. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Quadro 4: Lista de componentes para a preparação da solução-mãe de aminoácidos. Para a preparação da solução de estoque de aminoácidos 4x, todos os aminoácidos devem ser misturados na ordem listada. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 5. Lista de componentes para preparação de soluções de calibração de lisato. A quantidade (em gramas) de soluções-mãe de Mg-glutamato e K-glutamato é especificada para preparar 50 ml da concentração indicada de cada tampão. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 6: Lista das cepas bacterianas utilizadas neste protocolo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 7: Lista de primers utilizados neste protocolo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 8: Plasmídeo utilizado neste protocolo para calibração de lisado e como molde para amplificação linear de DNA por PCR. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 9: Conversão de FITC e eGFP. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
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Figura 1 suplementar. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui, mostramos que o lisado celular preparado a partir de E. coli BL21 Rosetta2 com um knockout genômico para o operon recB ou recBCD suporta alta expressão proteica a partir de modelos lineares de DNA. Este protocolo elabora um procedimento de calibração passo-a-passo de lisado específico para modelos lineares de DNA (Figura 2), que é uma etapa crítica que leva à alta expressão de promotores σ70 em DNA linear, atingindo níveis quase plasmídicos para concentrações de DNA equimolar. Este protocolo destaca a importância da calibração do tampão de acordo com o tipo de DNA (linear ou plasmídeo) a ser utilizado na aplicação final.
O protocolo pode ajudar a evitar a clonagem de plasmídeos, o que proporciona ganhos significativos em tempo e custo. Fragmentos de DNA linear podem ser sintetizados por provedores comerciais e/ou amplificados por PCR em laboratório. O mesmo processo usando DNA plasmídico levaria pelo menos 1 semana a mais, levando em conta a clonagem, a verificação de sequência e as etapas de preparação do DNA10. Recomenda-se o preparo de grandes volumes do extrato celular e modelos lineares de DNA para minimizar a variabilidade lote a lote entre os experimentos14,15.
Esse método tem se mostrado robusto e utilizado em laboratórios10. Os resultados desses extratos têm sido consistentes em todas as replicações biológicas, diferentes lotes de extrato, bem como em diferentes origens de cepas10. A robustez do protocolo também foi testada em diferentes parâmetros experimentais: métodos de lise celular, temperaturas, modelos de DNA e diferentes concentrações de DNA. O método já foi utilizado para triagem rápida e caracterização de construtos genéticos para duas aplicações relevantes: caracterização da biblioteca de interruptores de dedo do pé e triagem da atividade enzimática10.
Embora altos níveis de expressão tenham sido obtidos neste estudo a partir de DNA linear em extratos de ΔrecB/ΔrecBCD da cepa parental altamente produtiva E. coli BL21 Rosetta2, a metodologia exigiria engenharia genômica para uma nova cepa de interesse. Em contraste, a suplementação com agentes protetores para DNA linear, como GamS5 ou Chi DNA6, é mais fácil de aplicar para uma nova cepa, mas mais cara e mais demorada.
O protocolo fornecido aqui facilitará o uso de modelos lineares de DNA em sistemas livres de células e acelerará os ciclos de projeto-construção-teste para a comunidade de biologia sintética. A expressão livre de células mais fácil a partir de modelos lineares de DNA em extratos ΔrecB/ΔrecBCD pode ser implantada para a produção de pequenas moléculas de interesse, biossimilares e outras aplicações sob demanda no local de atendimento.
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Disclosures
Nenhum
Acknowledgments
ACB e JLF reconhecem o apoio financeiro pela subvenção ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF e JB reconhecem o apoio financeiro da bolsa ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). A MSA e a JLF reconhecem o apoio financeiro da subvenção ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). O JB reconhece o apoio do ERC ao iniciar o "COMPUCELL" (número de concessão 657579). O Centre de Biochimie Structurale reconhece o apoio da Infraestrutura Francesa de Biologia Estrutural Integrada (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK reconhece o apoio financeiro do departamento MICA da INRAe, Université Paris-Saclay, DIM-RFSI da região de Ile-de-France (IdF) e ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Este trabalho foi apoiado por financiamento através do Prémio Consolidador do Conselho Europeu de Investigação (865973 ao CLB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5?-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
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