Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Detectie van homologe recombinatietussenproducten via nabijheidsligatie en kwantitatieve PCR in saccharomyces cerevisiae

Published: September 11, 2022 doi: 10.3791/64240
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, 2Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, 3Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

Summary

De D-loop capture (DLC) en D-loop extension (DLE) assays maken gebruik van het principe van proximity ligatie samen met kwantitatieve PCR om D-loopvorming, D-loop extensie en productvorming te kwantificeren op de plaats van een induceerbare dubbelstrengs breuk in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

DNA-schade, waaronder DNA-dubbelstrengsbreuken en dwarsverbanden tussen strengen, opgelopen tijdens de S- en G2-fasen van de celcyclus, kan worden hersteld door homologe recombinatie (HR). Daarnaast vertegenwoordigt HR een belangrijk mechanisme voor replicatievorkredding na stilstand of instorting. De regulering van de vele omkeerbare en onomkeerbare stappen van dit complexe pad bevordert de trouw ervan. De fysische analyse van de recombinatie-intermediairs gevormd tijdens HR maakt de karakterisering van deze controles door verschillende nucleoproteïnefactoren en hun interactoren mogelijk. Hoewel er gevestigde methoden zijn om specifieke gebeurtenissen en tussenproducten in het recombinatiepad te testen, is de detectie van D-lusvorming en -uitbreiding, twee kritieke stappen in dit pad, tot voor kort een uitdaging gebleken. Hier worden efficiënte methoden beschreven voor het detecteren van belangrijke gebeurtenissen in de HR-route, namelijk DNA-dubbelstrengs breukvorming, D-lusvorming, D-lusuitbreiding en de vorming van producten via break-induced replication (BIR) in Saccharomyces cerevisiae . Deze testen detecteren hun relevante recombinatietussenproducten en producten met een hoge gevoeligheid en zijn onafhankelijk van cellulaire levensvatbaarheid. De detectie van D-loops, D-loop extensie en het BIR-product is gebaseerd op nabijheidsligatie. Samen maken deze testen de studie van de kinetiek van HR op populatieniveau mogelijk om de functies van HR-eiwitten en regulatoren nauwkeurig aan te pakken bij belangrijke stappen in het traject.

Introduction

Homologe recombinatie (HR) is een high-fidelity mechanisme voor reparatie van DNA dubbelstrengsbreuken (DSB's), interstrengs dwarsverbindingen en ssDNA-hiaten, evenals een route voor DNA-schadetolerantie. HR verschilt van foutgevoelige routes voor DNA-schadeherstel / -tolerantie, zoals niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en translesiesynthese, omdat het een intact, homoloog duplex-DNA als donor gebruikt om de reparatiegebeurtenis te templaten. Bovendien zijn veel van de belangrijkste tussenpersonen in het HR-traject omkeerbaar, waardoor de individuele trajectstappen uitstekend kunnen worden gereguleerd. Tijdens de S-, G2- en M-fasen van de celcyclus concurreert HR met NHEJ voor de reparatie van de tweezijdige DSB's1. Bovendien is HR essentieel voor DNA-replicatie voor het herstel van replicatie-geassocieerde DNA-schade, inclusief ssDNA-hiaten en eenzijdige DSB's, en als een mechanisme van DNA-laesie bypass2.

Een kritisch tussenproduct in de HR-route is de verplaatsingslus of D-lus (figuur 1). Na eindresectie laadt het centrale recombinase in de reactie, Rad51, op het nieuw gereseceerde ssDNA van het gebroken molecuul en vormt een spiraalvormig filament2. Rad51 voert vervolgens een homologieonderzoek uit om een geschikte homologe donor te identificeren, meestal de zusterchromatide in somatische cellen. De D-lus wordt gevormd wanneer het Rad51-ssDNA-filament een homoloog duplex-DNA binnendringt, wat leidt tot de Watson-Crick-basisparing van de gebroken streng met de complementaire streng van de donor, waardoor de tegenovergestelde donorstreng wordt verplaatst. Verlenging van het 3'-uiteinde van de gebroken streng door een DNA-polymerase vervangt de basen die verloren zijn gegaan tijdens de DNA-schadegebeurtenis en bevordert de resolutie van het uitgebreide D-lustussenproduct in een dsDNA-product via de synthese-afhankelijke strenggloeiing (SDSA), de dubbele Holliday-junctie (dHJ) of de break-induced replication (BIR) HR-subroutes.

Assays die de tussenproducten in de HR-route fysiek monitoren, maken de analyse van de genetische vereisten voor elke stap mogelijk (d.w.z. pathway-analyse). DSB-vorming, eindresectie, dHJ's, BIR-replicatiebubbels en HR-producten worden gemakkelijk waargenomen door Southern blotting 3,4,5,6,7. Toch rapporteert Southern blotting niet over ontluikende en uitgebreide D-lussen, en dus is een alternatieve methode nodig om deze gewrichtsmoleculen betrouwbaar te meten 4,8,9. Een veelgebruikte strategie om ontluikende D-lusvorming te analyseren is chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) van Rad51 in combinatie met kwantitatieve PCR (qPCR)10,11. Rad51 associatie met dsDNA zoals gemeten door ChIP-qPCR is echter onafhankelijk van sequentie homologie en de Rad51 accessoirefactor Rad5410,11. Daarentegen is een merkbaar signaal met behulp van de hier gepresenteerde methode van D-loop-analyse, de D-loop capture (DLC) -test genoemd, afhankelijk van DSB-vorming, sequentie homologie, Rad51 en de Rad51-accessoire-eiwitten Rad52 en Rad548. De bevinding dat Saccharomyces cerevisiae Rad51-bevorderde D-lusvorming afhankelijk is van Rad54 in vivo, komt overeen met talrijke in vitro reconstitutie-experimenten die aangeven dat Rad54 nodig is voor homologieonderzoek en D-lusvorming door ontluikende gist Rad51 8,12,13,14,15.

De huidige benaderingen voor het meten van D-loop-uitbreiding, voornamelijk via semi-kwantitatieve PCR, zijn eveneens problematisch. Een typische PCR-gebaseerde test om D-loop extensie te detecteren versterkt een unieke sequentie, resulterend uit recombinatie tussen een breukplaats en een ectopische donor en de daaropvolgende recombinatie-geassocieerde DNA-synthese, via een primer stroomopwaarts van het gebied van homologie op de gebroken streng en een andere primer stroomafwaarts van het gebied van homologie op de donorstreng. Met behulp van deze methode vereist de detectie van recombinatie-geassocieerde DNA-synthese de niet-essentiële Pol δ processiviteitsfactor Pol3216. Deze bevinding is in strijd met de constatering dat POL32-deletie slechts een mild effect heeft op de genconversie in vivo17. Bovendien slagen deze PCR-gebaseerde assays er niet in om D-loop-uitbreiding en BIR-productvorming tijdelijk op te lossen, wat suggereert dat het signaal het resultaat is van dsDNA-producten in plaats van ssDNA-tussenproducten 17,18,19. De D-loop extension (DLE) assay is onlangs ontwikkeld om deze discrepanties aan te pakken. De DLE-test kwantificeert recombinatie-geassocieerde DNA-synthese op een plaats ~ 400 basenparen (bp) stroomafwaarts van de initiële 3 'binnendringende eind9. Volgens deze methode is D-loop-extensie onafhankelijk van Pol32 en detecteerbaar binnen 4 uur na DSB-inductie, terwijl BIR-producten voor het eerst worden waargenomen na 6 uur. Inderdaad, een recente publicatie van de Haber en Malkova laboratoria merkte op dat het gebruik van deze methode van bereiding van genomisch DNA enkelvoud resulteert in ssDNA-conservering 9,20.

Hier worden de DLC- en DLE-assays in detail beschreven. Deze testen zijn gebaseerd op nabijheidsligatie om ontluikende en verlengde D-lussen in S. cerevisiae te detecteren (figuur 2)8,9. BIR-producten kunnen worden gekwantificeerd met behulp van hetzelfde testsysteem. Voor beide testen wordt DSB-vorming op een HO-endonuclease-cutplaats op de URA3-locus op chromosoom (Chr.) V geïnduceerd door de expressie van het HO-endonuclease onder controle van een galactose-induceerbare promotor. Rad51-gemedieerde DNA-strenginvasie leidt tot ontluikende D-lusvorming op de plaats van een ectopische donor op de LYS2-locus op Chr. II. Omdat de rechterkant van de DSB homologie aan de donor mist, is reparatie via SDSA en dHJ-vorming niet haalbaar. Initiële reparatie van de DSB door BIR is mogelijk, maar de vorming van levensvatbare producten wordt geremd door de aanwezigheid van het centromeer21. Dit opzettelijke ontwerp voorkomt productieve DSB-reparatie, waardoor de hervatting van de groei door cellen met gerepareerde DBS'en wordt vermeden, die anders de cultuur zouden kunnen inhalen tijdens de analyse van de tijdskoers.

In de DLC-test behoudt psoralen crosslinking van de twee strengen van het heteroduplex DNA binnen de D-loop het recombinatiemiddel. Na herstel van de restrictie-enzymplaats op de gebroken (gereseceerde) streng en de spijsvertering, maakt de crosslinking het mogelijk om de unieke sequenties stroomopwaarts van de homologe gebroken en donor-DNA's te binden. Met behulp van qPCR wordt het niveau van chimere DNA-molecuul in elk monster gekwantificeerd. In de DLE-test is crosslinking niet vereist, en restrictie-enzymplaatsherstel en -vertering gevolgd door intramoleculaire ligatie verbinden in plaats daarvan het 5'-uiteinde van het gebroken molecuul met het nieuw verlengde 3'-uiteinde. Nogmaals, qPCR wordt gebruikt om de relatieve hoeveelheden van dit chimere product in elk monster te kwantificeren. Bij afwezigheid van herstel van de restrictie-enzymplaats rapporteert de DLE-test over de relatieve niveaus van het BIR (dsDNA) -product dat wordt gevormd na D-loop-uitbreiding.

Representatieve resultaten voor elke test met behulp van een wildtype stam worden getoond, en lezers worden verwezen naar Piazza et al.8 en Piazza et al.9 voor het gebruik van deze assays voor de analyse van recombinatiemutanten 8,9. De bedoeling van deze bijdrage is om andere laboratoria in staat te stellen de DLC- en DLE-assays te adopteren, en ondersteuning hiervoor is op aanvraag beschikbaar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Pre-groei, DSB-inductie en monsterverzameling

OPMERKING: Suppletie van alle media met 0,01% adenine wordt aanbevolen voor Ade-stammen.

  1. Strooi de juiste haploïde stammen (zie tabel 1) uit op gist pepton dextrose adenine (YPDA) (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose, 2% agar, 0,001% adenine) en groei gedurende 2 dagen bij 30 °C.
  2. Gebruik een enkele kolonie om 5 ml YPDA in een glazen kweekbuis van 15 ml te enten. Kweek culturen tot verzadiging bij 30 °C met schudden of rotatie voor beluchting.
  3. DLC-test: Bereid de 5x psoralen stockoplossing (0,5 mg / ml trioxsalen in 200-proof ethanol) in een zuurkast door psoralen op te lossen in een conische buis van 50 ml gewikkeld in aluminiumfolie 's nachts bij kamertemperatuur met continu schudden of inversie. Sluit de schroefdop af met een transparante film om verdamping te voorkomen. Bereid niet meer dan 7 ml 5x psoralen stockoplossing per 50 ml conische buis om een goede oplossing van de psoralen te garanderen.
  4. Gebruik de volgende dag 5 ml van de YPDA-kweek om 50-100 ml YEP-lactaat (1% gistextract, 2% pepton, 2% w / w lactaat, 0,001% adenine) in een fles van de juiste grootte te enten (ontluikende gist groeit optimaal in een kolf die ten minste 5x het volume van de cultuur is) tot een OD600 van ~ 0,03.
  5. Laat de cultuur groeien gedurende ~16 uur bij 30 °C met schudden bij 220 tpm. Meet na ~ 16 uur de OD600 van de cultuur en deze moet ~ 0,5-0,8 zijn. Gebruik geen onder- of overwoekerde culturen.
  6. Verzamel voor elk tijdstip het juiste volume cellen in een conische buis en plaats het op ijs. Meestal is dit 1 x 108 cellen (ongeveer 7,5 ml cultuur bij OD600 1,0 voor een haploïde wildtype stam) voor de DLC-test en 5 x 107 cellen (ongeveer 2,5 ml cultuur bij OD600 1,0) voor de DLE-test.
  7. Om de nauwkeurigheid van de OD600-waarden te garanderen, bereidt u 1:5-verdunningen voor culturen met een OD600≥0.2 om de OD-waarde op 0,2 of lager te houden. Voor wilde stammen liggen de optimale tijdspunten voor DLC-analyse tussen 2 uur en 6 uur en de optimale tijdspunten voor DLE-analyse tussen 4 uur en 8 uur (zie figuur 3 en figuur 4).
  8. DLC-test
    1. Bereid vóór elk tijdstip voldoende 1x psoralenoplossing (0,1 mg/ml trioxsalen, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% ethanol) in een zuurkast voor alle monsters in een conische buis van 50 ml gewikkeld in folie. Vertrek bij RT.
    2. Centrifugeer de monsters bij 2.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de pellet in 2,5 ml 1x psoralenoplossing in een zuurkast en breng over in een petrischaal van 60 mm x 15 mm. U kunt de pellet ook resuspenteren in 2,5 ml TE1-oplossing (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) voor een controle zonder verknoping.
    3. Kruis de monsters. Voor een UV-crosslinker die geschikt is voor langgolvige (365 nm) lampen, plaatst u de petrischalen 1-2 cm onder de UV-lichtbron met het deksel verwijderd bovenop een plastic of plexiglas plaat die is voorgekoeld op −20 ° C. Voor een UV-lichtbak plaatst u de petrischalen direct bovenop de UV-lichtbron. Stel de monsters gedurende 10 minuten bloot met zacht schudden.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de UV-lichtbron bovenop een orbitale schudder in te stellen op ~ 50 rpm.
    4. Breng het monster in een zuurkast over in een nieuwe buis van 15 ml. Spoel de petrischaal af met 2,5 ml TE1-oplossing en voeg dit toe aan het buisje. Centrifugeer de monsters bij 2.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant op de juiste manier weg en bewaar de pellet bij −20° C. Monsters kunnen maximaal 1 week worden bewaard voordat u naar de volgende stap gaat.
  9. DLE-test
    1. Centrifugeer de monsters bij 2.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Was de celpellet in 2,5 ml koude TE1-oplossing voordat u de spin herhaalt en bewaar de pellets bij −20 °C. Monsters kunnen maximaal 1 week worden bewaard voordat ze naar de volgende stap gaan.
  10. Verzamel voor monstername op 0 uur de monsters voorafgaand aan de toevoeging van 20% galactose. Induceer voor volgende tijdspunten DSB-vorming door 20% galactose aan de culturen toe te voegen tot een uiteindelijke concentratie van 2%. Verzamel de resterende monsters zoals hierboven beschreven, pellet en vries in ten opzichte van de tijd na de inductie van DSB (d.w.z. het monster van 4 uur wordt 4 uur na de toevoeging van 20% galactose verzameld).

2. Cel sferoplasting, lysis en herstel van de beperkingsplaats

  1. Ontdooi de monsters op ijs. Verwarm een droog bad voor op 30 °C.
  2. Resuspensie van de monsters in 1 ml sferoplastingbuffer (0,4 M sorbitol, 0,4 M KCl, 40 mM natriumfosfaatbuffer pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) en breng over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  3. Voeg 3,5 μL zymolyase-oplossing toe (2% glucose, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml zymolyase 100T; 17,5 μg/ml zymolyase eindconcentratie). Meng zachtjes door te tikken of in te keren. Incubeer bij 30 °C gedurende 15 minuten en plaats het vervolgens op ijs. Verkrijg tijdens de incubatie van 15 minuten vloeibare stikstof of droogijs.
  4. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 2.500 x g bij 4 °C en plaats de monsters op ijs. Was de monsters 3x in 1 ml sferoplastingbuffer. Centrifugeer de monsters gedurende 3 minuten bij 2.500 x g bij 4 °C.
  5. Resuspendeer de monsters in 1 ml koude 1x restrictie-enzymbuffer (50 mM kaliumacetaat, 20 mM tris-acetaat, 10 mM magnesiumacetaat, 100 μg / ml BSA pH ~ 8,0 bij RT) en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 16.000 x g bij 4 °C. Leg de monsters op ijs. Herhaal de was 1x.
  6. Resuspendeer de monsters in 1 ml koude 1x restrictie enzymbuffer. Splits het monster (elk 0,5 ml) in twee microcentrifugebuizen van 1,5 ml. Centrifugeer de monsters gedurende 3 minuten bij 16.000 x g bij 4 °C.
  7. Resuspender één buis van elk monster in 180 μL 1,4x restrictie-enzymbuffer met hybridiserende oligo's (zie tabel 2) en één buis in 180 μL 1,4x restrictie-enzymbuffer zonder oligo's te hybridiseren. Elk hybridiserend oligo wordt geresuspendeerd in 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) en gebruikt bij een eindconcentratie van 7 nM. De 1x TE vervangt de hybridiserende oligo's in de 1,4x restrictie-enzymbuffer zonder oligo's te hybridiseren.
    OPMERKING: De hybridiserende oligo's moeten bij −20 °C in kleine aliquots bij de werkende verdunning worden bewaard. De concentratie van de hybridiserende oligo's kan optimalisatie vereisen; zie Discussie.
  8. Vries de monsters in vloeibare stikstof of droogijs/ethanol en bewaar bij −80 °C. Monsters kunnen in dit stadium enkele maanden worden bewaard.

3. Restrictie-enzym digestie en intramoleculaire ligatie

  1. Ontdooi de monsters op ijs. Verwarm één droog bad voor op 65 °C en een ander op 37 °C.
  2. Pipetteer 36 μL van het monster in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis op ijs. Breng het resterende monster onmiddellijk terug naar −80 °C voor opslag.
  3. Voeg 4 μL 1% SDS (0,1% eindconcentratie) toe en meng door zachtjes op de zijkant van de buis te tikken. Incubeer bij 65 °C gedurende 15 minuten met zachtjes tikken om de 5 minuten. Plaats monsters op ijs onmiddellijk na de incubatie.
    OPMERKING: Deze SDS-behandeling bevordert de denaturatie van DNA-geassocieerde eiwitten, oplosbaarheid van de nucleaire envelop en chromatinetoegankelijkheid voorafgaand aan de restrictie-enzymvertering en intramoleculaire ligatiestappen.
  4. Voeg 4,5 μL van 10% Triton X-100 (1% eindconcentratie) toe en meng door te pipetteren. Voeg 20-50 U restrictie-enzym (EcoRI-HF of HindIII-HF) toe aan elk monster en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur met zachte agitatie om de 20-30 min. Verwarm gedurende deze tijd een droog bad voor op 55 °C en stel een waterbad in op 16 °C.
  5. Voeg 8,6 μL 10% SDS (1,5% eindconcentratie) toe aan elk monster en meng door te pipetteren en te tappen. Incubeer bij 55 °C gedurende 10 min. Voeg 80 μL 10% Triton X-100 (6% eindconcentratie) toe aan elk monster en meng door te pipetteren.
  6. Voeg 660 μL 1x ligatiebuffer zonder ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2,5 μg/ml BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA ligase (8 U/monster) toe aan elk monster en meng door zachte inversie. Incubeer bij 16 °C gedurende 1,5 uur met inversie om de 30 minuten. Plaats de monsters direct na de incubatie op ijs.

4. DNA-zuivering

  1. Verwarm één droog bad voor op 65 °C en een ander op 37 °C. Voeg 1 μL 10 mg/ml proteïnase K (bereid in 1x TE pH 8,0) toe aan elk monster (12,5 μg/ml eindconcentratie). Incubeer bij 65 °C gedurende 30 minuten en plaats de monsters onmiddellijk na de incubatie op ijs totdat ze zijn afgekoeld.
  2. Breng de monsters over in buizen van 2 ml. Werk in een zuurkast en voeg een gelijk volume (~ 800 μL) fenol / chloroform / isoamylalcohol (P / C / IA; pH 8,0) toe aan elk monster. Vortex de monsters voor ~ 30 s en centrifugeer de monsters gedurende 5-10 minuten bij 16.000 x g in een microcentrifuge.
  3. Verwijder voorzichtig 600 μL van de bovenste fase van elk monster in een nieuwe buis van 1,5 ml. Gooi de onderste fase en 2 ml buizen op de juiste manier weg.
  4. Precipiteer het DNA door een 1/10 volume van 3 M natriumacetaat pH 5,2 (~ 60 μL) aan elk monster toe te voegen, gevolgd door 1 volume isopropanol (~ 660 μL). Keer de monsters 5x-10x om en incubeer bij RT gedurende 30 minuten.
  5. Plaats de monsters gedurende 2 minuten op ijs en centrifugeer de monsters vervolgens bij 16.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C in een microcentrifuge. Breng de monsters terug naar ijs, giet het supernatant af en giet de buis af op een papieren handdoek.
  6. Was de DNA-pellet met 200 μL 70% ethanol. Centrifugeer bij 16.500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C, plaats de monsters terug op ijs, giet het supernatant af en verwijder de resterende alcohol met een pipet. Droog de monsters met de doppen van de buizen open bij 37 °C gedurende 15-20 minuten.
  7. Resuspendeer de DNA-pellets in 50 μL van 1x TE door vortexing. Incubeer bij RT gedurende 30 minuten, vortex en incubeer vervolgens bij 37 °C in een droog bad gedurende 30 minuten. Vortex de monsters opnieuw en plaats ze vervolgens op ijs. Monsters kunnen in dit stadium enkele maanden bij −20 °C worden bewaard, maar het is raadzaam om onmiddellijk over te gaan tot de decrosslinking (alleen DLC) en qPCR-stappen.

5. Psoralen crosslink reversal (alleen voor DLC-assay)

  1. Pipetteer 9 μL gezuiverd DNA in een PCR-buis op ijs. Voeg 1 μL van 1 M KOH (0,1 M eindconcentratie) toe. Incubeer de monsters bij 90 °C gedurende 30 minuten in een thermocycler.
  2. Voeg 19,73 μL natriumacetaatoplossing (0,1 M natriumacetaat, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0) toe. Monsters kunnen in dit stadium enkele maanden bij −20 °C worden bewaard, maar het is raadzaam om onmiddellijk over te gaan tot de qPCR-stap.

6. Kwantitatieve PCR, controles en analyse

  1. Stel met behulp van 2 μL gezuiverd DNA, met of zonder crosslinking, een 20 μL qPCR-reactie in volgens de instructies van de fabrikant. Stel elke reactie in tweevoud in. Voor zowel de DLC- als de DLE-assays zijn er vijf controlereacties en één DLC/DLE-kwantificeringsreactie, of in totaal zes reacties per monster, in tweevoud uitgevoerd. Aanvullende tabel S1 en aanvullende tabel S2 bieden een sjabloon voor het opzetten van deze reacties en analyses, en de sequenties van de qPCR-primers zijn vermeld in tabel 3.
  2. qPCR-fietsomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd voor elke qPCR-kit.
    1. Gebruik de volgende DLC qPCR-condities, afhankelijk van de gebruikte qPCR-kits: initiële denaturatie (95 °C gedurende 3 min); 50 versterkingsronden (95 °C gedurende 15 s, 61 °C gedurende 25 s, 72 °C gedurende 15 s met een enkele verwerving); smeltcurveanalyse (95 °C gedurende 5 s, 65 °C gedurende 1 min, 97 °C met continue acquisitie); en koeling (37 °C gedurende 30 s).
    2. Gebruik de volgende qPCR-voorwaarden voor de DLE-test: initiële denaturatie (95 °C gedurende 5 min); 50 versterkingsronden (95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 15 s met een enkele verwerving); smeltcurveanalyse (95 °C gedurende 5 s, 65 °C gedurende 1 min, 97 °C met continue acquisitie); en koeling (37 °C gedurende 30 s). Houd er rekening mee dat optimalisatie voor verschillende qPCR-machines/-kits nodig kan zijn.
  3. DLC-test
    1. Besturingselementen: Zie de lijst met qPCR-primers in tabel 3. Een kaart van de primerbindingsplaatsen is weergegeven in figuur S1. Voor aanvullende sequentiebestanden voor de relevante genomische kenmerken en amplicons, raadpleegt u de A plasmid Editor (ApE) -bestanden; Aanvullende reeksbestanden 1-5.
      1. Genomisch DNA bij ARG4: Gebruik olWDH1760/olWDH1761 om dsDNA op ARG4 te versterken. Gebruik deze reactie als een belastingscontrole en normaliseer alle andere reacties behalve de DLC-signaalreactie op deze controle.
      2. Intramoleculaire ligatie-efficiëntie bij DAP2: Gebruik het 1.904 bp-fragment gecreëerd door EcoRI-vertering voor intramoleculaire ligatie parallel aan de DLC-ligatie. Versterking over deze ligatie junction rapporteert over de intramoleculaire ligatie-efficiëntie en dient als een controle waarnaar het DLC-signaal wordt genormaliseerd.
      3. DSB-inductie: gebruik olWDH1766/olWDH1767 om een gebied te versterken dat de geïnduceerde DSB overspant.
      4. Psoralen crosslinking en resectie: Gebruik olWDH2019/olWDH2020 om het unieke PhiX-gebied stroomafwaarts van de EcoRI-herkenningssite te versterken. Gebruik zonder crosslink reversal de verhouding van de ssDNA (geen crosslinking) over ARG4 (crosslinked dsDNA) om de crosslinking efficiëntie te bepalen. Bij crosslink-omkering zal resectie leiden tot een progressieve afname van 1 tot 0,5 van het signaal ten opzichte van ARG4.
      5. EcoR I herkenningsplaatsherstel en -snijden: Gebruik olWDH1768/olWDH1764 om een gebied te versterken dat de gerestaureerde EcoRI-herkenningssite stroomopwaarts van de DSB op de gereseceerde streng omspant. olWDH1769/olWDH1763 versterken een gebied dat de EcoRI-restrictie-enzymlocatie bij DAP2 omspant. Voer EcoRI-splitsing uit op deze locatie om te gebruiken als intramoleculaire ligatiecontrole.
    2. DLC-signaal: Gebruik olWDH1764/olWDH1765 om het chimere DNA-molecuul te versterken dat is ontstaan door intramoleculaire ligatie van de gereseceerde (binnendringende) streng en de donor.
    3. Analyse: Bereken de gemiddelde en standaarddeviatie van de Cp-waarden voor elk van de dubbele reacties. Gebruik de ARG4 genomische DNA qPCR Cp-waarden als referentie om alle andere controle-qPCRs te normaliseren. Normaliseer het DLC-signaal naar de intramoleculaire ligatiecontrole bij DAP2. Zie figuur 3 voor typische DLC-signaalwaarden bij 2 uur.
  4. DLE-test
    1. Besturingselementen: Zie de lijst met qPCR-primers in tabel 3. Een kaart van de primerbindingsplaatsen is weergegeven in figuur S1. Voor aanvullende sequentiebestanden voor de relevante genomische kenmerken en ampliconen, raadpleegt u de A plasmid Editor (ApE) -bestanden (Supplementary Sequence Files 1-5).
      1. Genomisch DNA bij ARG4: Zie rubriek 6.3.1.1.
      2. Intramoleculaire ligatie-efficiëntie bij YLR050C: Gebruik de Hind III-verteringom een fragment van 765 bp te creëren dat intramoleculaire ligatie parallel aan de DLE-ligatie zal ondergaan. Versterking over deze ligatie junction rapporteert over de intramoleculaire ligatie-efficiëntie en dient als een controle waarnaar het DLE-signaal wordt genormaliseerd.
      3. DSB-inductie: Zie punt 6.3.1.3.
      4. Hinde III-herstel en -snijden van de herkenningsplaats: gebruik olWDH2010 /olWDH2012 en olWDH2009/2011 om een gebied te versterken dat de Hind III-restrictie-enzymsites overspant op de gebroken streng waar het respectievelijk is gereseceerd en uitgebreid.
    2. DLE-signaal: Gebruik olWDH2009/olWDH2010 om het chimere DNA-molecuul te versterken dat is ontstaan door intramoleculaire ligatie van het gereseceerde uiteinde van de binnendringende streng stroomopwaarts van de DSB naar het nieuw verlengde uiteinde stroomafwaarts van de DSB.
    3. Analyse: Bereken de gemiddelde en standaarddeviatie van de Cp-waarden voor elk van de dubbele reacties. Gebruik de ARG4 genomische DNA qPCR Cp-waarden als referentie om alle andere controle-qPCRs te normaliseren. Normaliseer het DLE-signaal naar de intramoleculaire ligatiecontrole bij YLR050C. Typische DLE-signaalwaarden na 6 uur worden gerapporteerd in figuur 4 en eerdere publicaties9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DLC-test
De DLC-test detecteert zowel ontluikende als uitgebreide D-loops gevormd door de invasie van een site-specifieke DSB in een enkele donor (figuur 2). Psoralen crosslinking verbindt fysiek de gebroken streng en de donor via het heteroduplex DNA binnen de D-lus. Herstel van de restrictie-enzymplaats met een lang, hybridiserend oligo op de gereseceerde streng van de breuk maakt restrictie-enzymsplitsing mogelijk, gevolgd door ligatie van de gebroken streng naar de proximale donor om een chimeer product te vormen dat wordt gekwantificeerd door qPCR. Met name is het DLC-signaal afhankelijk van de psoralen crosslinking, het hybridiserende oligo, de centrale recombinase, Rad51 en de Rad51-accessoirefactoren Rad52 en Rad548. Deletie van de DNA-helicases/topoisomerases Sgs1-Top3-Rmi1, Mph1 en Srs2 leidt tot een verhoogd DLC-signaal.

Figuur 3 toont de representatieve resultaten voor de standaard wildtype stam bij 2 h post-DSB inductie in drievoud met en zonder hybridiserend oligo. Een monster dat ontbreekt in een belangrijke stap, psoralen crosslinking, wordt ook in tweevoud weergegeven.

Zoals te zien is in figuur 3, is psoralen crosslinking een cruciale stap. Er is praktisch geen detecteerbaar signaal zonder het8. Crosslinking-efficiëntie wordt gemeten op basis van de verhouding tussen ssDNA en dsDNA-versterking. In tegenstelling tot dsDNA ervaart ssDNA minimale psoralen crosslinking, en dus duidt een hoog signaal op succesvolle crosslinking. De efficiëntie van crosslinking varieert afhankelijk van de tijd tussen het verzamelen van monsters en de voorbereiding op qPCR (figuur 3, linkerbenedenpaneel). Hoe meer tijd tussen monsterverzameling en voorbereiding, hoe minder signaal zal worden waargenomen voor de crosslinking efficiëntie qPCR-regeling. Significante intersample variatie in het signaal waargenomen voor de crosslinking efficiëntie qPCR controle is een reden tot bezorgdheid, en het tijdsverloop moet worden weggegooid.

Arg4 Cp-waarden zijn vergelijkbaar tussen de met- en zonder-hybridiserende oligomonsters (figuur 3, deelvenster linksboven). Een lage Cp-waarde geeft aan dat er meer versterkt DNA aanwezig is. Dit verklaart waarom de ARG4 Cp-waarden voor de niet-crosslinking-monsters aanzienlijk lager zijn: crosslinking interfereert met qPCR-versterking. Dit verschil tussen de met- en zonder-crosslinking monsters is van toepassing op alle qPCRs behalve de EcoRI cleavage qPCR-controle, die ssDNA / niet-crosslinked dsDNA zal versterken. Alle qPCR-besturingselementen, maar niet het DLC-signaal, worden genormaliseerd naar het ARG4 qPCR-signaal.

Voor alle monsters ligt de intramoleculaire ligatie qPCR-controle binnen het juiste bereik (figuur 3, bovenste middenpaneel) en is er robuuste DSB-inductie, zoals blijkt uit het lage signaal voor de qPCR-controle die over de HO-endonucleaseherkenningsplaats versterkt (figuur 3, paneel rechtsboven). In de met-hybridiserende oligomonsters wordt efficiënt EcoRI-snijden waargenomen en deze qPCR-regeling geeft een laag signaal (figuur 3, onderste middenpaneel). Omgekeerd geven de niet-hybridiserende oligo met-crosslinking monsters een hoog signaal, vergelijkbaar met wat wordt aangetoond voor de crosslinking efficiëntie qPCR-regeling, omdat in dit geval ongesneden ssDNA wordt versterkt en genormaliseerd naar het ARG4 qPCR-signaal (dsDNA).

In tegenstelling tot de andere qPCRs wordt het qPCR-signaal voor de DLC-test genormaliseerd naar de intramoleculaire ligatie qPCR-controle, omdat het chimere molecuul gekwantificeerd door de DLC qPCR afhankelijk is van ligatie. Het mediane DLC-signaal bij 2 h met hybridiserend oligo is 0,030 ± 0,0055 (figuur 3, rechterbenedenpaneel), in overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten voor deze test8. Zoals verwacht is dit signaal afhankelijk van zowel het hybridiserende oligo als de psoralen crosslinking.

DLE-test
De DLE-test maakt de nauwkeurige monitoring van D-loop-uitbreiding mogelijk als reactie op een locatiespecifieke DSB (figuur 2). Eerder werd aangetoond dat het DLE-signaal afhankelijk is van Rad51, de centrale recombinatie in de reactie, die strenginvasie bemiddelt en dus nodig is voor recombinatie-geassocieerde DNA-synthese9. Bovendien is het DLE-signaal afhankelijk van de katalytische subeenheid van Pol δ, Pol3 (DR, AP, WDH, ongepubliceerde gegevens) maar niet van de niet-essentiële processiviteitsfactor Pol32. In tegenstelling tot het DLC-signaal, dat eerst detecteerbaar wordt na 2 uur na DSB-inductie, neemt het DLE-signaal eerst merkbaar toe bij 4 uur post-DSB-inductie, stijgt het dramatisch tussen 4 uur en 6 uur en begint het daarna te plateau, waarbij een groot deel van de toename van het signaal tussen 6 uur en 8 uur toe te schrijven is aan BIR-productvorming8, 9.

Aangezien het chimere ligatieproduct dat in de DLE-test wordt gekwantificeerd enkelstrengs is, is de celsferoplasting- en lysisstap van cruciaal belang. Een verminderd DLE-signaal kan het gevolg zijn van problemen met deze stap, waardoor nucleasen kunnen vrijkomen en kunnen leiden tot degradatie van het doel-ssDNA.

Figuur 4 toont representatieve resultaten voor de standaard wildtype stam bij 6 h post-DSB inductie in drievoud met en zonder hybridiserende oligo's. Het wildtypemonster zonder hybridiserende oligo's vertegenwoordigt alleen het dsDNA BIR-product, terwijl het with-oligo-signaal is afgeleid van zowel het ssDNA van de verlengde D-lus als het dsDNA BIR-product. Een derde monster is opgenomen als voorbeeld van een mislukt experiment.

Arg4 De CP-waarden waren vergelijkbaar tussen de met- en zonder-hybridiserende oligos-monsters (figuur 4, deelvenster linksboven). Arg4 Cp-waarden waren merkbaar lager voor het mislukte monster, wat aangeeft dat dit monster meer genomisch DNA heeft dan de succesvolle monsters. De qPCR-signalen voor de qPCR-besturingen, maar niet het DLE-signaal, werden genormaliseerd naar het ARG4 qPCR-signaal. De intramoleculaire ligatie qPCR-controle onthulde een aanvaardbaar signaal voor de met- en zonder-hybridiserende oligos-monsters (tussen ~ 0,15-0,35), maar een aanzienlijk lager signaal voor het mislukte monster (figuur 4, bovenste middenpaneel). In dit mislukte monster heeft de hoge hoeveelheid genomisch DNA aangegeven door de ARG4 qPCR-controle waarschijnlijk de intramoleculaire ligatie doen mislukken, omdat een hoge concentratie genomisch DNA zal leiden tot intermoleculaire ligatie.

In alle drie de monsters was er sprake van robuuste DSB-inductie (figuur 4, paneel rechtsboven). Hinde III-splitsing op zowel de gereseceerde als de verlengde strengen hangt af van de aanwezigheid van de hybridiserende oligo's. Op de verlengde streng is het bovendien afhankelijk van D-loop-extensie. Er was dus een significant verschil in versterking over de HindIII-splitsingsplaats op de gereseceerde streng tussen de met- en zonder-oligomonsters (figuur 4, paneel linksonder) en een kleiner verschil in versterking over de HindIII-herkenningsplaats op de verlengde streng tussen deze monsters (figuur 4, onderste-middelste paneel).

Omdat het DLE-signaal afhankelijk is van intramoleculaire ligatie, wordt het genormaliseerd naar de intramoleculaire ligatie qPCR-controle. Het mediane DLE-signaal bij 6 h met hybridiserende oligo's was 0,53 ± 0,17 (figuur 4, rechterbenedenpaneel), in overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten voor deze test9. Het DLE-signaal voor het wildtypemonster zonder hybridiserende oligo's was op dezelfde manier compatibel met deze eerdere publicatie. Het DLE-signaal was lager dan verwacht voor het mislukte monster, waarschijnlijk als gevolg van de hierboven genoemde problemen met die steekproef.

Crosslink omkering
Psoralen geïntercaleerd tussen ApT/TpA-basenparen in dsDNA kan covalent verbonden raken door zijn furaan- en pyroneringen met een of beide tegengestelde thyminebasen bij UV-bestraling, wat resulteert in (overwegend furaan) mono-adducten of interstrengs di-adducten (d.w.z. crosslinks), respectievelijk22. Deze modificaties zullen naar verwachting de progressie van het DNA-polymerase blokkeren, waardoor de DNA-synthesereactie die integraal deel uitmaakt van kwantitatieve PCR wordt geremd. Bijgevolg kunnen de meeste dsDNA-sjablonen niet worden versterkt (figuur 5A, B). Daarentegen maakt de afwezigheid van basenparen in ssDNA het minder vatbaar voor psoralen crosslinking. Het wordt dus gemakkelijker versterkt dan dsDNA, wat de relatieve kwantificering van ssDNA versus dsDNA en van dsDNA-amplicons van verschillende lengtes en ApT/TpA-gehalte vervormt (figuur 5A, B). Om deze beperkingen te overwinnen, werd een base- en warmtegekatalyseerde omkering van de psoralen crosslink reversal stap23 toegepast voorafgaand aan de kwantitatieve PCR. Deze methode laat alleen de kleine soort pyrone-side mono-adducten23,24. Het leidde tot een 80-voudig herstel van genomische dsDNA en intramoleculaire ligatiecontroleampliconen, wat aangeeft dat de overgrote meerderheid van de sjabloonmoleculen ten minste één furaanzijdig monoadduct of interstrengkruislink had (figuur 5B, C). De vergelijking van de Cp-waarden van de dsDNA-genomische DNA-controle voor en na crosslink-omkering geeft een schatting van de crosslinking-efficiëntie, die in het hier getoonde bereik zou moeten liggen. Naast korte amplicons kan deze procedure sjablonen tot 3 kb lang herstellen (figuur S2). Er werd geen verandering waargenomen voor de ssDNA-amplicon, consistent met een gebrek aan psoralen crosslinking naar ssDNA (figuur 5B-D). Het toont ook aan dat de crosslink-omkeringsprocedure DNA 23 niet detecteerbaarbeschadigt. Het herstel van de DLC chimera amplicon, die een crosslinked dsDNA segment bevat dat geligeerd is naar een niet-crosslinked ds-ssDNA segment (50 bp en 118 bp/nt; Figuur 5A) was gemiddeld ten opzichte van dsDNA- en ssDNA-amplicons, met een 8-voudige verbetering van het herstel (figuur 5B,C). Crosslink-omkering had geen invloed op de relatieve niveaus van de twee dsDNA-ampliconen, waarbij de intramoleculaire ligatiecontrole in het bereik van 0,2-0,25 bleef ten opzichte van de genomische DNA-controle (figuur 5E). Het veranderde echter de relatieve hoeveelheid van het ssDNA-amplicon ten opzichte van de dsDNA-genomische DNA-controle van een 40-voudig overschot naar het 0,5-voudige verwachte voor een ssDNA ten opzichte van een dsDNA-sjabloon (figuur 5D). Evenzo daalde het gedeeltelijk ssDNA DLC-signaal van 6,6 x 10−2 naar 6,6 x 10−3 ten opzichte van de dsDNA intramoleculaire ligatiecontroles (figuur 5F). Dit brengt ons ertoe om het aantal D-lus gewrichtsmoleculen bij een interchromosomale donor gedetecteerd door deze aanpak 4 uur na DSB-inductie te schatten op een gemiddelde van 1,3% van de totale gebroken moleculen in de celpopulatie. Dergelijke absolute schattingen konden niet worden gemaakt met psoralen-gebaseerde vervorming van dsDNA en ssDNA-versterking, wat de waarde van deze extra crosslink-omkeringsstap benadrukt.

Figure 1
Figuur 1: Homologe recombinatie- en resolutiesubroutes. Na DNA-schade die resulteert in een DSB met één of twee uiteinden (getoond) of een ssDNA-opening, onthult 5' tot 3' resectie van de DNA-uiteinden 3' ssDNA-overhangen waarop het Rad51-filament zich vormt, geholpen door zijn accessoire factoren. Rad51 zoekt vervolgens in het genoom naar een intact duplex-DNA (d.w.z. de donor) waarop de reparatiegebeurtenis kan worden gesjabloond. Dit proces culmineert in DNA-strenginvasie, waarbij de gebroken streng Watson-Crick-base paart met de complementaire streng van de dubbelstrengs DNA-donor, waardoor de tegenovergestelde streng wordt verplaatst en de ontluikende D-lus wordt gevormd. Deze D-lus kan worden omgekeerd om Rad51 homologie zoeken om een andere donor te selecteren of uitgebreid met een DNA-polymerase om de basen te vervangen die verloren zijn gegaan tijdens de DNA-schadegebeurtenis. Er zijn drie HR-subpaden beschikbaar om dit uitgebreide D-loop-tussenproduct in een product op te lossen. Ten eerste kan de verlengde D-lus worden verstoord door een helicase, waardoor het nieuw verlengde uiteinde van de breuk kan gloeien naar het tweede uiteinde in een proces dat synthese-afhankelijke strenggloeien (SDSA) wordt genoemd. Vul DNA-synthese en ligatie in en leiden vervolgens tot productvorming. Als alternatief kan het tweede uiteinde van de breuk gloeien naar de verplaatste donorstreng, waardoor een dubbele Holliday-junctie (dHJ) wordt gevormd. Nucleolytische resolutie van de dHJ resulteert in een crossover (CO) of niet-crossover (NCO), terwijl dHJ-oplossing (niet getoond) alleen resulteert in NCO-producten. Ten slotte resulteert het niet inschakelen van het tweede uiteinde van de DSB in break-induced replication (BIR), een mutageen proces waarbij duizenden basenparen van de donor op de gebroken streng worden gekopieerd. Dit proces kan zich uitstrekken tot aan de convergerende replicatievork of het einde van het chromosoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Het uitgangspunt van de D-loop capture (DLC), D-loop extension (DLE) en break-induced replication (BIR) productvormingstests. DSB-vorming wordt aangedreven door een locatiespecifiek endonuclease onder controle van de GAL1-promotor . DSB-inductie leidt tot de vorming van een ontluikende D-lus. In de DLC-test behoudt interstrengcrosslinking van het DNA deze structuur, die vervolgens wordt geëxtraheerd. Herstel van de restrictie-enzymplaats wordt bereikt via hybridisatie met een lang oligonucleotide en vervolgens wordt het DNA verteerd en geligeerd om een product te vormen dat kan worden gekwantificeerd door kwantitatieve PCR (qPCR). De DLE-test verschilt in die zin dat het DNA niet verknoopt is, en in plaats daarvan vormt het intramoleculaire ligatieproduct zich tussen de twee uiteinden van het ssDNA aan één kant van de breuk, waarbij het 3'-uiteinde is verlengd door een DNA-polymerase. qPCR wordt opnieuw gebruikt om de vorming van het chimere ligatieproduct te kwantificeren. De detectie van D-loop extensie via de DLE-assay vereist eveneens herstel van de enzymlocatie. Daarentegen wordt het dubbelstrengs BIR-product gedetecteerd met behulp van de DLE-testprimers zonder de hybridiserende oligonucleotiden. R geeft aan dat een restrictie-enzymplaats bevoegd is voor enzymsplitsing; (R) een restrictie-enzymplaats aangeeft die niet kan worden gesneden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve resultaten van DLC-testanalyse van D-loops bij 2 h post-DSB-inductie. Monsters werden verzameld, voorbereid en geanalyseerd door qPCR zoals beschreven in dit protocol. Blauwe symbolen vertegenwoordigen resultaten voor de standaard wildtype stam met hybridiserende oligo's voor n = 3. Groene symbolen vertegenwoordigen resultaten voor de wildtypestam zonder oligo's te hybridiseren voor n = 3. De dikke rode lijn geeft de mediaan weer. De paarse symbolen vertegenwoordigen monsters zonder psoralen crosslinking maar met hybridiserende oligo's voor n = 2. Symbolen geven aan dat de monsters zijn afgeleid van dezelfde cultuur. Interexperimentele verschillen in crosslinking-efficiëntie kunnen variabiliteit introduceren in bepaalde qPCR-controles, maar zijn niet problematisch zolang er geen variabiliteit tussen de monsters is in deze qPCR-controles binnen een experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve resultaten van DLE-testanalyse 6 uur post-DSB-inductie. Monsters werden verzameld, voorbereid en geanalyseerd door qPCR zoals beschreven in dit protocol. Blauwe symbolen vertegenwoordigen resultaten voor de standaard wildtype stam met hybridiserende oligo's voor n = 3. Groene symbolen vertegenwoordigen resultaten voor de wildtypestam zonder oligo's te hybridiseren voor n = 3. De dikke rode lijn geeft de mediaan weer. Merk op dat de met- en zonder-hybridiserende oligosmonsters zijn afgeleid van dezelfde culturen. De paarse diamant vertegenwoordigt een mislukt monster zonder oligo's te hybridiseren voor n = 1. Symbolen geven aan dat de monsters zijn afgeleid van dezelfde cultuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve resultaten van psoralen crosslink reversal. (A) Psoralen-DNA mono-adducten (*) en inter-streng crosslinks (X) komen specifiek voor op dsDNA en voorkomen de amplificatie ervan door DNA-polymerasen, in tegenstelling tot ssDNA-sjablonen. Dit verschil introduceert een bias in de kwantificering van dsDNA- en ssDNA-bevattende sjablonen door qPCR. Deze bias kan worden overwonnen bij het omkeren van de psoralen crosslink. (B) Representatieve Cp-waarden van dsDNA (genomisch, ligatie), ssDNA en gemengde ds-ssDNA (DLC) amplicons verkregen 4 uur post-DSB-inductie. Gegevens vertegenwoordigen individuele waarden en de mediaan van vier biologische replicaties. (C) Versterkingsherstel bij crosslink-omkering, berekend op basis van de Cp-waarden in (B). (D) De ssDNA-versterking ten opzichte van de genomische dsDNA-controle met en zonder psoralen crosslink-omkering. Bij omkering versterkt het ssDNA-amplicon bij de verwachte 0,5 van de genomische dsDNA-controle. (E) De intramoleculaire ligatiecontrole dsDNA ten opzichte van de genomische dsDNA-controle met en zonder psoralen crosslink-omkering. (F) Het DLC-signaal ten opzichte van de dsDNA-ligatieregeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Huidig DLC/DLE-testsysteem en de voorgestelde wijzigingen. Boven: Huidige DLC/DLE assay break site en donor worden getoond. Onder: Geplande wijzigingen aan de DLC/DLE assay break site en donor. (I) De 117 bp HO endonuclease cut site is geel aangegeven. Om verstorende effecten te voorkomen tijdens het monitoren van D-loop verstoring, zal de linkerkant van de HOcs (74 bp) in de donor worden geïntroduceerd, zodat recombinatie tussen de twee een perfect op elkaar afgestemde D-lus creëert zonder een 3 'flap. (II) Om het systeem herstelbaar en dus fysiologischer te maken, zal DNA homoloog aan de donor (aangegeven in groenblauw en lila) in de rechterkant van de HOcs worden ingebracht. (III) Invasie en uitbreiding door de streng rechts van de HOcs zullen worden gevolgd met behulp van sequenties die uniek zijn voor die kant van de breuk (aangegeven in oranje). (IV) Extra gelijkmatig verdeelde restrictie-enzymlocaties en -sequenties die uniek zijn voor de donor, zullen het mogelijk maken om D-loop-extensie (via invasie vanaf de linkerkant van de HOcs) op verder weg gelegen locaties te volgen. In dit gemodificeerde systeem kan synthese-afhankelijke strenggloeiing (SDSA) of dubbele Holliday junction (dHJ) vorming optreden op de locaties weergegeven in groenblauw of lila. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Kaart van de qPCR-primers die worden gebruikt in de DLC- en DLE-assays. Kaart van de genomische loci die worden gebruikt voor analyse in de DLC- en DLE-assays, hun relevante kenmerken en de geschatte primerbindingsplaatsen (zie tabel 3 voor een lijst met qPCR-primers). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Kwalitatieve beoordeling van crosslink-omkering bij grote amplicons. Genomisch DNA werd bereid uit crosslinked of niet-crosslinked monsters, waar aangegeven, zoals beschreven in het protocol, secties 1-5. Niet-kwantitatieve PCR werd gebruikt om het 3 kbp-segment te versterken dat het gebied van homologie beslaat dat wordt gedeeld tussen de breukplaats en de donor. Merk op dat, vanwege de verschillen in amplificatie-efficiëntie tussen crosslinked en niet-crosslinked DNA en de beperkte hoeveelheid monster, het niet mogelijk was om het input-DNA te standaardiseren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel 1: S. cerevisiae stam gebruikt voor DLC- en DLE-testanalyse. Genotype van de haploïde ontluikende giststam die in deze studie wordt gebruikt. De soort is op aanvraag verkrijgbaar. Aanvullende stammen die beschikbaar zijn voor DLC/DLE-assayanalyse zijn te vinden in Piazza et al.8 en Piazza et al.9. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Hybridiserende oligonucleotiden die worden gebruikt voor DLC- en DLE-testanalyse. De sequenties van de lange, hybridiserende oligonucleotiden die worden gebruikt in de DLC- en DLE-assays. Aanvullende SDS-PAGE-zuivering van de hybridiserende oligonucleotiden door de aangepaste oligonucleotideleverancier wordt aanbevolen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: qPCR-primers die worden gebruikt voor DLC- en DLE-testanalyse. De qPCR primer paren voor de DLC en de DLE assays en beschrijvingen van hun doeleinden. Merk op dat olWDH1764, olWDH2009 en olWDH2010 worden gebruikt in twee qPCRs. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S1: Sjabloon voor DLC-assay qPCR-installatie en -analyse. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Sjabloon voor DLE-assay qPCR-installatie en -analyse. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende reeksbestanden 1-5. Aanvullende sequentiebestanden voor de relevante genomische kenmerken en ampliconen. De sequentiebestanden zijn in de ApE-bestandsindeling; ApE is een vrij beschikbare software voor het bekijken en bewerken van DNA-sequenties. ApE-bestanden zijn ook compatibel met alle belangrijke sequentiebewerkingssoftware. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De gepresenteerde assays maken de detectie mogelijk van ontluikende en uitgebreide D-loops (DLC assay), D-loop extension (DLE assay) en BIR productvorming (DLE assay zonder hybridiserende oligonucleotiden) met behulp van proximity ligatie en qPCR. ChIP-qPCR van Rad51 naar locaties ver van de DSB is eerder gebruikt als een proxy voor Rad51-gemedieerde homologie zoeken en D-loop vorming. Dit ChIP-qPCR-signaal is echter onafhankelijk van de sequentie homologie tussen de breukplaats en een potentiële donor, evenals de Rad51-geassocieerde factor Rad54, en vertegenwoordigt dus eerder een voorbijgaande associatie tussen het Rad51-ssDNA-filament en dsDNA dan een D-lus intermediair10,11. Daarentegen is het DLC-signaal afhankelijk van DSB-vorming, Rad51, Rad52, Rad54 en gedeelde sequentie homologie tussen de DSB en de donorplaats getest8. Bovendien worden verhoogde DLC-signalen waargenomen in afwezigheid van de Mph1- en Srs2-helicases en het Sgs1-Top3-Rmi1 helicase-topoisomerase-complex, in overeenstemming met eerdere rapporten dat deze drie factoren Rad51 / Rad54-gemaakte ontluikende D-loops in vitro 8,25,26,27 kunnen demonteren. De DLE-test vertegenwoordigt op dezelfde manier een verbetering ten opzichte van eerdere methoden om recombinatie-geassocieerde DNA-synthese te volgen, omdat het onderscheid kan maken tussen D-loop-extensie en BIR-productvorming19.

Zoals hierboven besproken, zijn de qPCR-controles, inclusief die voor het genomische DNA, DSB-inductie, psoralen cross-linking, intramoleculaire ligatie en oligonucleotidehybridisatie, van cruciaal belang voor het succes en de reproduceerbaarheid van deze testen. Ruwe genomische DNA qPCR-waarden moeten ongeveer gelijkwaardig zijn voor alle monsters. Lage Cp-waarden voor de ARG4-genomische DNA-controle duiden op overtollig DNA en het aantal verzamelde cellen moet worden aangepast. Hoge Cp-waarden voor deze controle wijzen op onvoldoende DNA-herstel of besmetting met reagentia die qPCR verstoren. Na sferoplasting kan cellyse worden waargenomen met behulp van een standaard lichtmicroscoop en gelijke hoeveelheden monster en steriel water. Als er onvoldoende lysis wordt waargenomen bij het toevoegen van water, moet de zymolyase-oplossing opnieuw worden gemaakt of moet de incubatie bij 30 °C worden verlengd. Monster kan ook verloren gaan of verontreinigingen worden geïntroduceerd tijdens DNA-zuivering door P / C / IA-extractie. Voor het efficiënt herstel van DNA moet men ervoor zorgen dat de pH van de P/C/IA is aangepast naar ~8,0 en dat de onderste fase niet wordt verstoord tijdens het verwijderen van de bovenste fase. Ten slotte kan inefficiënte resuspensie van de DNA-pellet in 1x TE resulteren in lage Cp-waarden. Een langere incubatie bij 37 °C en vortexing zal de resuspensie van de DNA-pellet verbeteren.

Naast de genomische DNA-genomische DNA-controle, moeten de DSB-inductie- en restrictie-enzymsplitsingscontrolereacties ook vergelijkbaar zijn in alle monsters. HO-endonuclease of restrictie-enzymsnijden op de plaats van de DSB- of restrictie-enzymherkenningsplaats voorkomt amplificatie in deze regio; daarom zijn de typische genormaliseerde qPCR-waarden voor deze controles bijna nul en duidt een hoge qPCR-waarde op onvoldoende splitsing. Als een hoog signaal op de plaats van de DSB wordt waargenomen, moet de galactose-oplossing opnieuw worden gemaakt. Voor mutanten met een bekend celcyclusdefect moet DSB-inductie worden gekwantificeerd door gelijke hoeveelheden cultuur gekweekt volgens het protocol (zie rubriek 1) te bottelen op YPDA- en YPA-media aangevuld met galactose. Kolonies die groeien op media die galactose bevatten, vertegenwoordigen gist waarin eindverbinding een onzuivere HOcs creëerde. Als er aanzienlijk meer end-joining events zijn in een mutant van belang ten opzichte van het wildtype, moet een correctie worden toegepast om dit verschil in DSB-inductie te compenseren, wat het DLC/DLE-signaal zal beïnvloeden.

Drie primerparen (olWDH1764/olWDH1768, olWDH2010/olWDH2012 en olWDH2009/olWDH2011) beoordelen het herstel van de herstellocatie van restrictie-enzymen door de hybridiserende oligo's en snijden door de EcoRI-HF en HindIII-HF restrictie-enzymen. Bovendien zijn de intramoleculaire ligatiecontroles ook afhankelijk van een adequate restrictie-enzymvertering. Een monster met een lage intramoleculaire ligatie-efficiëntie en een hoog signaal voor een van deze drie primerparen heeft dus onvoldoende restrictie-enzymsnijden. In volgende preparaten moet aanvullend restrictie-enzym worden verstrekt en de werkzaamheid van het restrictie-enzym moet worden beoordeeld op genomisch DNA. Het olWDH1769/olWDH1763 primerpaar vertegenwoordigt een extra controle voor de DLC-test, die EcoRI-splitsing meet bij DAP2, waar ook intramoleculaire ligatie-efficiëntie wordt gemeten. Een monster met een adequaat intramoleculair ligatiesignaal maar een hoog signaal voor een van deze drie primerparen heeft onvoldoende herstel van de enzymplaats door de hybridiserende oligo's. Om dit probleem aan te pakken, moeten dubbele monsters worden verzameld en moet de concentratie van de getroffen hybridiserende oligo('s) worden gevarieerd. Typische qPCR-waarden verkregen voor deze reacties met en zonder hybridiserende oligo's zijn te vinden in figuur 3 en figuur 4 en in Piazza et al.8 en Piazza et al.9.

Voor zowel de DLC- als de DLE-test wordt een intramoleculaire ligatie-efficiëntie van 0,15-0,35 zoals genormaliseerd naar de genomische DNA-controle als normaal beschouwd. Aangezien de detectie van ontluikende en verlengde D-lussen en het BIR-product afhankelijk is van efficiënte ligatie, moeten monsters met lage ligatiesignalen worden weggegooid. De 10x ligatiebuffer zonder ATP mag niet langer dan 6 maanden bij 4 °C worden bewaard. Het verzamelen van te veel cellen kan leiden tot intermoleculaire ligatie, wat zal resulteren in een lage intramoleculaire ligatie-efficiëntie en DLC / DLE-signaal.

Hoewel deze controles voor de DLC- en DLE-assays rapporteren over bijna alle gevoelige stappen, is het nog steeds mogelijk om niet-fysiologische waarden voor het DLC- of DLE-signaal te verkrijgen wanneer deze controles zich binnen het juiste bereik bevinden. Een laag DLC- of DLE-signaal kan het gevolg zijn van fouten in de celsferoplastingstap, die extreem gevoelig is. Men moet slechts enkele monsters parallel verwerken en ze te allen tijde op 4 °C bewaren. Een hoog/laag DLC/DLE-signaal kan ook het gevolg zijn van het verzamelen van te veel/weinig cellen op elk tijdstip. Dit probleem kan worden verholpen door meerdere OD600s cellen te verzamelen op elk tijdstip voor elk monster.

Er zijn verschillende technische en conceptuele beperkingen aan de DLC- en DLE-assays in hun huidige vorm. Ten eerste is de psoralen-gemedieerde interstreng crosslinkdichtheid ~ 1 op 500 bp8. Daarom kan een verhoogd DLC-signaal erop wijzen dat er meer D-loops in de populatie zijn, dat de gemiddelde lengte van de D-loops in de populatie is toegenomen (ervan uitgaande dat D-loops kleiner kunnen zijn dan 500 bp), of beide. Bovendien neemt de kans dat een D-lus wordt vastgelegd door de DLC-assay af met afnemende D-looplengte. Aangezien zeer korte D-loops een aanzienlijk deel van de totale D-luspopulatie in bepaalde mutantenachtergronden kunnen uitmaken, moet deze beperking van de test in aanmerking worden genomen bij het interpreteren van de resultaten. Ten tweede vereist de DLC-test DNA-crosslinking, terwijl de DLE-test dat niet doet. Voorheen betekende dit voor een bepaald experiment dat DLC- en DLE-monsters afzonderlijk moesten worden verzameld en geanalyseerd. De methode in figuur 5 bereikt een robuuste crosslink-omkering, waardoor het minder nodig is om meerdere monsters uit dezelfde cultuur te verzamelen. De introductie van een tweede EcoRI-restrictie-enzymlocatie op de gebroken streng, stroomafwaarts van de Hind III-herkenningslocatie, zal sequentiële DLC- en DLE-analyse mogelijk maken.

Naast deze technische beperkingen staat het DLC- en DLE-testsysteem momenteel het herstel van levensvatbare HR-producten niet toe omdat de rechterkant van de induceerbare DSB homologie aan de donor mist. Om de kinetiek en het mechanisme van tweede-eindbetrokkenheid en synthese beter te begrijpen, kan het systeem zodanig worden aangepast dat reparatie met behulp van een proximaal of distal gebied van homologie gedeeld tussen het tweede uiteinde van de breuk en de donor haalbaar is (figuur 6). Vooruitkijkend kan het inzichtelijk zijn om de DLC- en DLE-assays te combineren met andere technologieën, zoals ChIP-qPCR, high-throughput chromosome conformation capture (Hi-C) en in vivo D-loop mapping, om een uitgebreide analyse van de kinetiek en regulatie van de stappen in de HR-route te bereiken, inclusief breukvorming, eindresectie, Rad51-filamentvorming, ontluikende D-loopvorming, D-loop uitbreiding, D-loop omkering, second end engagement, second end synthese en resolutie28.

Samenvattend maken de DLC- en DLE-assays de kwantificering mogelijk van ontluikende en uitgebreide D-loops, D-loop-uitbreiding en BIR-productvorming met behulp van het principe van nabijheidsligatie. Deze assays vertegenwoordigen grote vooruitgang in het veld, omdat ze de eerste zijn die de semi-kwantitatieve meting van D-lusvorming en -uitbreiding onafhankelijk van cellulaire levensvatbaarheid mogelijk maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het werk in het Heyer laboratorium wordt ondersteund door subsidies GM58015 en GM137751 aan W.-D.H. Onderzoek in het Piazza laboratorium wordt ondersteund door de European Research Council (ERC-StG 3D-loop, grand agreement 851006). D.R. wordt ondersteund door T32CA108459 en de A.P. Giannini Foundation. We bedanken Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) voor het delen van zijn DLC / DLE-testresultaten en voor het aanvullend valideren van de wijzigingen in de assays die in dit protocol worden beschreven.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup Sigma-Aldrich L1375 For media preparation
Agar Fisher BP1423500 For media preparation
Bacto peptone BD Difco 211840 For media preparation
Bacto yeast extract BD Difco 212750 For media preparation
D-(+)-glucose BD Difco 0155-17-4 For media preparation
Trioxsalen Sigma-Aldrich T6137 For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T US Biological Z1004 For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF New England Biolabs R3101 Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF New England Biolabs R3104 Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 Sigma-Aldrich P2069 DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480 Roche 5015278001 qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white Roche 4729692001 96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix BioRad 1725271 qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001 qPCR kit used by the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
  4. Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
  5. Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
  6. Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
  7. Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
  8. Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
  9. Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
  10. Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
  11. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
  12. Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
  13. Wright, W. D., Heyer, W. -D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
  14. Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
  15. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
  16. Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
  17. Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
  18. Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
  19. Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
  20. Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
  21. Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
  22. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  23. Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
  24. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
  25. Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
  26. Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
  27. Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
  28. Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).

Tags

Genetica D-loop genoomstabiliteit gewrichtsmolecuul Rad51 break-induced replication
Detectie van homologe recombinatietussenproducten <em>via</em> nabijheidsligatie en kwantitatieve PCR in <em>saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A.,… More

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A., Heyer, W. D. Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (187), e64240, doi:10.3791/64240 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter