Summary
I saggi di acquisizione D-loop (DLC) e D-loop extension (DLE) utilizzano il principio della legatura di prossimità insieme alla PCR quantitativa per quantificare la formazione di D-loop, l'estensione del D-loop e la formazione del prodotto nel sito di una rottura inducibile a doppio filamento in Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
I danni al DNA, comprese le rotture a doppio filamento del DNA e i legami incrociati tra filamenti, subiti durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare possono essere riparati mediante ricombinazione omologa (HR). Inoltre, HR rappresenta un importante meccanismo di salvataggio della forcella di replica dopo lo stallo o il collasso. La regolazione dei molti passi reversibili e irreversibili di questo complesso percorso ne promuove la fedeltà. L'analisi fisica degli intermedi di ricombinazione formati durante la HR consente la caratterizzazione di questi controlli da parte di vari fattori nucleoproteici e dei loro interattori. Sebbene esistano metodi consolidati per analizzare eventi specifici e intermedi nel percorso di ricombinazione, il rilevamento della formazione e dell'estensione del D-loop, due passaggi critici in questo percorso, si è dimostrato difficile fino a poco tempo fa. Qui vengono descritti metodi efficienti per rilevare eventi chiave nel percorso HR, vale a dire la formazione di rottura a doppio filamento del DNA, la formazione del D-loop, l'estensione del D-loop e la formazione di prodotti tramite replicazione indotta da rottura (BIR) in Saccharomyces cerevisiae . Questi test rilevano i loro intermedi di ricombinazione rilevanti e prodotti ad alta sensibilità e sono indipendenti dalla vitalità cellulare. Il rilevamento di D-loop, estensione D-loop e il prodotto BIR si basa sulla legatura di prossimità. Insieme, questi saggi consentono lo studio della cinetica della FC a livello di popolazione per affrontare con precisione le funzioni delle proteine HR e dei regolatori in fasi significative del percorso.
Introduction
La ricombinazione omologa (HR) è un meccanismo ad alta fedeltà di riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA (DSB), dei legami incrociati tra filamenti e delle lacune del ssDNA, nonché un percorso per la tolleranza al danno del DNA. L'HR differisce dai percorsi soggetti a errori per la riparazione/tolleranza al danno al DNA, come la giunzione finale non omologa (NHEJ) e la sintesi translesionale, in quanto utilizza un DNA duplex intatto e omologo come donatore per modellare l'evento di riparazione. Inoltre, molti degli intermedi chiave nel percorso HR sono reversibili, consentendo una regolazione squisita delle singole fasi del percorso. Durante le fasi S, G2 e M del ciclo cellulare, HR compete con NHEJ per la riparazione dei DSB a due estremità1. Inoltre, la HR è essenziale per la replicazione del DNA per la riparazione dei danni al DNA associati alla replicazione, comprese le lacune del ssDNA e le DSB unilaterali, e come meccanismo di bypass della lesione del DNA2.
Un intermedio critico nel percorso HR è il ciclo di spostamento, o D-loop (Figura 1). Dopo la resezione finale, la ricombinasi centrale nella reazione, Rad51, si carica sul ssDNA appena resecato della molecola rotta, formando un filamento elicoidale2. Rad51 effettua quindi una ricerca di omologia per identificare un donatore omologo adatto, tipicamente il cromatide fratello nelle cellule somatiche. Il D-loop si forma quando il filamento Rad51-ssDNA invade un DNA duplex omologo, che porta all'accoppiamento di basi Watson-Crick del filamento rotto con il filamento complementare del donatore, spostando il filamento donatore opposto. L'estensione dell'estremità 3' del filamento rotto da parte di una DNA polimerasi sostituisce le basi che sono state perse durante l'evento di danno al DNA e promuove la risoluzione dell'intermedio esteso D-loop in un prodotto dsDNA attraverso la ricottura del filamento dipendente dalla sintesi (SDSA), la giunzione a doppio Holliday (dHJ) o le sottovie HR di replicazione indotta da rottura (BIR).
I saggi che monitorano fisicamente gli intermedi nel percorso HR consentono l'analisi dei requisiti genetici per ogni fase (ad esempio, analisi del percorso). La formazione di DSB, la resezione finale, i dHJ, le bolle di replicazione BIR e i prodotti HR sono facilmente osservabili dal Southern blotting 3,4,5,6,7. Tuttavia, il Southern blotting non riesce a riferire sui D-loop nascenti ed estesi e, quindi, è necessario un metodo alternativo per misurare in modo affidabile queste molecole articolari 4,8,9. Una strategia ampiamente utilizzata per analizzare la nascente formazione del D-loop è l'immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) di Rad51 accoppiata con PCR quantitativa (qPCR)10,11. Tuttavia, l'associazione di Rad51 con il dsDNA misurata da ChIP-qPCR è indipendente dall'omologia di sequenza e dal fattore accessorio Rad51 Rad5410,11. Al contrario, un segnale apprezzabile che utilizza il metodo di analisi D-loop qui presentato, chiamato saggio di acquisizione D-loop (DLC), dipende dalla formazione di DSB, dall'omologia di sequenza, da Rad51 e dalle proteine accessorie Rad51 Rad52 e Rad548. La scoperta che la formazione di D-loop promossa da Rad51 da Saccharomyces cerevisiae dipende da Rad54 in vivo è in accordo con numerosi esperimenti di ricostituzione in vitro che indicano che Rad54 è necessario per la ricerca di omologia e la formazione di D-loop da parte del lievito in erba Rad51 8,12,13,14,15.
Gli attuali approcci per misurare l'estensione del D-loop, principalmente attraverso la PCR semi-quantitativa, sono altrettanto problematici. Un tipico test basato sulla PCR per rilevare l'estensione del D-loop amplifica una sequenza unica, risultante dalla ricombinazione tra un sito di rottura e un donatore ectopico e dalla successiva sintesi del DNA associata alla ricombinazione, tramite un primer a monte della regione di omologia sul filamento rotto e un altro primer a valle della regione di omologia sul filamento donatore. Utilizzando questo metodo, la rilevazione della sintesi del DNA associata alla ricombinazione richiede il fattore di processività Pol3216 non essenziale δ Pol32. Questa scoperta è in conflitto con l'osservazione che la delezione di POL32 ha solo un lieve effetto sulla conversione genica in vivo17. Inoltre, questi test basati sulla PCR non riescono a risolvere temporalmente l'estensione del D-loop e la formazione del prodotto BIR, suggerendo che il segnale deriva da prodotti dsDNA piuttosto che da intermedi ssDNA17,18,19. Il test di estensione D-loop (DLE) è stato recentemente sviluppato per risolvere queste discrepanze. Il test DLE quantifica la sintesi del DNA associata alla ricombinazione in un sito ~ 400 coppie di basi (bp) a valle dell'iniziale 3' invasione fine9. Con questo metodo, l'estensione del D-loop è indipendente da Pol32 ed è rilevabile entro 4 ore dall'induzione post-DSB, mentre i prodotti BIR vengono osservati per la prima volta a 6 ore. Infatti, una recente pubblicazione dei laboratori Haber e Malkova ha osservato che l'uso di questo metodo di preparazione del DNA genomico porta singolarmente alla conservazione del ssDNA 9,20.
Qui, i test DLC e DLE sono descritti in dettaglio. Questi saggi si basano sulla legatura di prossimità per rilevare le anse D nascenti ed estese in S. cerevisiae (Figura 2)8,9. I prodotti BIR possono essere quantificati utilizzando lo stesso sistema di analisi. Per entrambi i test, la formazione di DSB in un sito di taglio dell'endonucleasi HO situato nel locus URA3 sul cromosoma (Chr.) V è indotta dall'espressione dell'endonucleasi HO sotto il controllo di un promotore inducibile dal galattosio. L'invasione del filamento di DNA mediata da Rad51 porta alla nascente formazione di D-loop nel sito di un donatore ectopico situato nel locus LYS2 su Chr. II. Poiché il lato destro del DSB manca di omologia con il donatore, la riparazione tramite SDSA e formazione di dHJ non è fattibile. La riparazione iniziale del DSB da parte di BIR è possibile, ma la formazione di prodotti vitali è inibita dalla presenza del centromero21. Questo disegno deliberato impedisce la riparazione produttiva del DSB, evitando così la ripresa della crescita da parte delle cellule con DBS riparati, che altrimenti potrebbero superare la coltura durante l'analisi del decorso temporale.
Nel test DLC, la reticolazione psoralenica dei due filamenti del DNA eteroduplex all'interno del D-loop preserva l'intermedio di ricombinazione. Dopo il ripristino del sito enzimatico di restrizione sul filamento rotto (resecato) e la digestione, la reticolazione consente la legatura delle sequenze uniche a monte del DNA omologo rotto e donatore. Utilizzando la qPCR, viene quantificato il livello di molecola di DNA chimerico presente in ciascun campione. Nel test DLE, la reticolazione non è richiesta e il ripristino del sito enzimatico di restrizione e la digestione seguiti dalla legatura intramolecolare collegano invece l'estremità 5' della molecola rotta all'estremità 3' appena estesa. Ancora una volta, la qPCR viene utilizzata per quantificare le quantità relative di questo prodotto chimerico in ciascun campione. In assenza di ripristino del sito enzimatico di restrizione, il test DLE riporta i livelli relativi del prodotto BIR (dsDNA) che si forma dopo l'estensione del D-loop.
Vengono mostrati i risultati rappresentativi per ciascun test che utilizza un ceppo wild type, e i lettori sono rimandati a Piazza et al.8 e Piazza et al.9 per l'uso di questi saggi per l'analisi dei mutanti di ricombinazione 8,9. L'intento di questo contributo è quello di consentire ad altri laboratori di adottare i saggi DLC e DLE, e il supporto per loro è disponibile su richiesta.
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Protocol
1. Pre-crescita, induzione DSB e raccolta di campioni
NOTA: L'integrazione di tutti i terreni con 0,01% di adenina è raccomandata per i ceppi di ade.
- Striare i ceppi aploidi appropriati (vedi Tabella 1) su peptone destrosio adenina (YPDA) ( 1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% glucosio, 2% agar, 0,001% adenina) e crescere per 2 giorni a 30 °C.
- Utilizzare una singola colonia per inoculare 5 ml di YPDA in un tubo di coltura di vetro da 15 ml. Coltivare colture fino alla saturazione a 30 °C con agitazione o rotazione per l'aerazione.
- Saggio DLC: preparare la soluzione madre di psoralene 5x (0,5 mg/ml di triossalene in etanolo 200-proof) in una cappa aspirante sciogliendo lo psoralene in un tubo conico da 50 mL avvolto in un foglio di alluminio durante la notte a temperatura ambiente con agitazione o inversione continua. Guarnire il tappo a vite con una pellicola trasparente per evitare l'evaporazione. Non preparare più di 7 mL di 5x soluzione madre di psoralene per tubo conico da 50 mL per garantire la corretta dissoluzione dello psoralene.
- Il giorno successivo, utilizzare 5 ml di coltura YPDA coltivata durante la notte per inoculare 50-100 ml di YEP-lattato (1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% p/p di lattato, 0,001% adenina) in un matraccio di dimensioni appropriate (il lievito in erba cresce in modo ottimale in un pallone che è almeno 5 volte il volume della coltura) a un OD600 di ~ 0,03.
- Coltivare la coltura per ~16 h a 30 °C agitando a 220 giri/min. Dopo ~ 16 h, misurare l'OD600 della coltura e dovrebbe essere ~ 0,5-0,8. Non utilizzare colture insufficienti o troppo cresciute.
- Per ogni punto temporale, raccogliere il volume appropriato di celle in un tubo conico e posizionarlo sul ghiaccio. Tipicamente, si tratta di 1 x 108 cellule (circa 7,5 ml di coltura a OD 600 1,0 per un ceppo aploide wild type) per il test DLC e 5 x 107 cellule (circa 2,5 ml di coltura a OD600 1,0) per il test DLE.
- Per garantire l'accuratezza dei valori OD 600, preparare diluizioni 1:5 per colture con OD600≥0,2 per mantenere la lettura OD a 0,2 o inferiore. Per i ceppi wild type, i punti temporali ottimali per l'analisi DLC sono compresi tra 2 h e 6 h, mentre i time point ottimali per l'analisi DLE sono compresi tra 4 h e 8 h (vedere Figura 3 e Figura 4).
- Saggio DLC
- Prima di ogni punto temporale, preparare una quantità sufficiente di 1x soluzione di psoralene (0,1 mg/mL di triossalen, 50 mM di Tris-HCl pH 8,0, 50 mM di EDTA pH 8,0, etanolo al 20%) in una cappa aspirante per tutti i campioni in un tubo conico da 50 mL avvolto in un foglio. Esci a RT.
- Centrifugare i campioni a 2.500 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet in 2,5 ml di soluzione di psoralene 1x in una cappa aspirante e trasferire in una capsula di Petri da 60 mm x 15 mm. In alternativa, risospendere il pellet in 2,5 mL di soluzione di TE1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) per un controllo senza reticolazione.
- Crosslink i campioni. Per un reticolante UV compatibile con lampadine a onde lunghe (365 nm), posizionare le piastre di Petri 1-2 cm sotto la sorgente di luce UV con il coperchio rimosso sopra una lastra di plastica o plexiglass pre-raffreddata a -20 ° C. Per una scatola di luce UV, posizionare le piastre di Petri direttamente sopra la sorgente di luce UV. Esporre i campioni per 10 minuti agitando delicatamente.
NOTA: Si consiglia di impostare la sorgente di luce UV su uno shaker orbitale impostato a ~ 50 giri / min. - In una cappa aspirante, trasferire il campione in una nuova provetta da 15 ml. Risciacquare la capsula di Petri con 2,5 mL di soluzione di TE1 e aggiungerla al tubetto. Centrifugare i campioni a 2.500 x g per 5 minuti a 4 °C, smaltire correttamente il surnatante e conservare il pellet a -20 ° C. I campioni possono essere conservati fino a 1 settimana prima di passare alla fase successiva.
- Saggio DLE
- Centrifugare i campioni a 2.500 x g per 5 minuti a 4 °C. Lavare il pellet cellulare in 2,5 ml di soluzione fredda di TE1 prima di ripetere la centrifuga e conservare il pellet a -20 °C. I campioni possono essere conservati per un massimo di 1 settimana prima di passare alla fase successiva.
- Per la raccolta dei campioni a 0 ore, raccogliere i campioni prima dell'aggiunta del 20% di galattosio. Per i timepoint successivi, indurre la formazione di DSB aggiungendo il 20% di galattosio alle colture a una concentrazione finale del 2%. Raccogliere i campioni rimanenti come descritto sopra, pellet e congelare rispetto al tempo post-induzione DSB (cioè, il campione di 4 ore viene raccolto 4 ore dopo l'aggiunta del 20% di galattosio).
2. Sferoplastica cellulare, lisi e ripristino del sito di restrizione
- Scongelare i campioni sul ghiaccio. Preriscaldare un bagno asciutto a 30 °C.
- Risospendere i campioni in 1 mL di tampone sferoplastico (0,4 M sorbitolo, 0,4 M KCl, 40 mM tampone fosfato di sodio pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) e trasferire in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Aggiungere 3,5 μL di soluzione di zimolyasi (glucosio al 2%, 50 mM di Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/mL di zimolyasi 100T; concentrazione finale di 17,5 μg/mL di zimolyasi). Mescolare delicatamente picchiettando o capovolgendo. Incubare a 30 °C per 15 minuti, quindi mettere su ghiaccio. Durante i 15 minuti di incubazione, ottenere azoto liquido o ghiaccio secco.
- Centrifugare per 3 minuti a 2.500 x g a 4 °C e posizionare i campioni su ghiaccio. Lavare i campioni 3 volte in 1 mL di tampone sferoplastrico. Centrifugare i campioni per 3 minuti a 2.500 x g a 4 °C.
- Risospendere i campioni in 1 mL di tampone enzimatico di restrizione 1x freddo (50 mM acetato di potassio, 20 mM di tris-acetato, 10 mM di acetato di magnesio, 100 μg/mL BSA pH ~8,0 a RT) e centrifugare per 3 minuti a 16.000 x g a 4 °C. Posizionare i campioni sul ghiaccio. Ripetere il lavaggio 1x.
- Risospendere i campioni in 1 mL di tampone enzimatico di restrizione freddo 1x. Dividere il campione (0,5 ml ciascuno) in due provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Centrifugare i campioni per 3 minuti a 16.000 x g a 4 °C.
- Risospendere una provetta da ciascun campione in 180 μL di tampone enzimatico di restrizione 1,4x con oligo ibridanti (vedere Tabella 2) e una provetta in 180 μL di tampone enzimatico di restrizione 1,4x senza oligo ibridanti. Ogni oligo ibridante viene risospeso in 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) e utilizzato ad una concentrazione finale di 7 nM. L'1x TE sostituisce gli oligo ibridanti nel tampone enzimatico di restrizione 1,4x senza oligo ibridanti.
NOTA: Gli oligo ibridanti devono essere conservati a −20 °C in piccole aliquote alla diluizione di lavoro. La concentrazione degli oligo ibridanti può richiedere un'ottimizzazione; vedi Discussione. - Congelare i campioni in azoto liquido o ghiaccio secco/etanolo e conservare a -80 °C. I campioni possono essere conservati in questa fase per diversi mesi.
3. Digerimento enzimatico di restrizione e legatura intramolecolare
- Scongelare i campioni sul ghiaccio. Preriscaldare un bagno secco a 65 °C e un altro a 37 °C.
- Pipet 36 μL del campione in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 mL su ghiaccio. Riportare immediatamente il campione rimanente a -80 °C per la conservazione.
- Aggiungere 4 μL di SDS all'1% (concentrazione finale allo 0,1%) e mescolare picchiettando delicatamente sul lato del tubo. Incubare a 65 °C per 15 minuti picchiettando delicatamente ogni 5 min. Posizionare i campioni sul ghiaccio immediatamente dopo l'incubazione.
NOTA: Questo trattamento SDS promuove la denaturazione delle proteine associate al DNA, la solubilizzazione dell'involucro nucleare e l'accessibilità della cromatina prima della digestione enzimatica di restrizione e delle fasi di legatura intramolecolare. - Aggiungere 4,5 μL di Triton X-100 al 10% (concentrazione finale all'1%) e mescolare mediante pipettaggio. Aggiungere 20-50 U di enzima di restrizione (EcoRI-HF o HindIII-HF) ad ogni campione e incubare a 37 °C per 1 ora agitando delicatamente ogni 20-30 minuti. Durante questo periodo, preriscaldare un bagno asciutto a 55 °C e preimpostare un bagno d'acqua a 16 °C.
- Aggiungere 8,6 μL di SDS al 10% (concentrazione finale dell'1,5%) a ciascun campione e miscelare mediante pipettaggio e maschiatura. Incubare a 55 °C per 10 min. Aggiungere 80 μL di Triton X-100 al 10% (concentrazione finale del 6%) a ciascun campione e miscelare mediante pipettaggio.
- Aggiungere 660 μL di tampone di legatura 1x senza ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2,5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA ligasi (8 U/campione) a ciascun campione e mescolare per leggera inversione. Incubare a 16 °C per 1,5 h con capovolgimento ogni 30 min. Posizionare i campioni sul ghiaccio immediatamente dopo l'incubazione.
4. Purificazione del DNA
- Preriscaldare un bagno secco a 65 °C e un altro a 37 °C. Aggiungere 1 μL di 10 mg/mL di proteinasi K (preparato in 1x TE pH 8,0) a ciascun campione (concentrazione finale di 12,5 μg/ml). Incubare a 65 °C per 30 minuti e porre i campioni su ghiaccio immediatamente dopo l'incubazione fino a quando non si sono raffreddati.
- Trasferire i campioni in provette da 2 ml. Lavorando in una cappa aspirante, aggiungere un volume uguale (~800 μL) di fenolo / cloroformio / alcool isoamilico (P / C / IA; pH 8,0) a ciascun campione. Vortice i campioni per ~ 30 s e centrifugare i campioni per 5-10 minuti a 16.000 x g in una microcentrifuga.
- Rimuovere con cautela 600 μL della fase superiore di ciascun campione in una nuova provetta da 1,5 ml. Smaltire correttamente la fase inferiore e i tubi da 2 ml.
- Precipitare il DNA aggiungendo un volume 1/10 di acetato di sodio 3 M pH 5,2 (~60 μL) a ciascun campione, seguito da 1 volume di isopropanolo (~660 μL). Capovolgere i campioni 5x-10x e incubare a RT per 30 minuti.
- Mettere i campioni su ghiaccio per 2 minuti, quindi centrifugarli a 16.500 x g per 15 minuti a 4 °C in una microcentrifuga. Riportare i campioni sul ghiaccio, versare il surnatante e scolare il tubo su un tovagliolo di carta.
- Lavare il pellet di DNA con 200 μL di etanolo al 70%. Centrifugare a 16.500 x g per 3 minuti a 4 °C, riporre i campioni sul ghiaccio, versare il surnatante e rimuovere l'alcol residuo con un pipet. Asciugare i campioni con i tappi delle provette aperte a 37 °C per 15-20 min.
- Risospendere i pellet di DNA in 50 μL di 1x TE mediante vortexing. Incubare a RT per 30 minuti, vortice, quindi incubare a 37 °C in un bagno asciutto per 30 minuti. Vortice di nuovo i campioni, quindi metterli sul ghiaccio. I campioni possono essere conservati in questa fase a -20 °C per diversi mesi, ma è consigliabile procedere immediatamente per le fasi di decrosslinking (solo DLC) e qPCR.
5. Inversione del reticolo psoralenico (solo per il test DLC)
- Pipet 9 μL di DNA purificato in una provetta PCR su ghiaccio. Aggiungere 1 μL di 1 M KOH (concentrazione finale 0,1 M). Incubare i campioni a 90 °C per 30 minuti in un termociclatore.
- Aggiungere 19,73 μL di soluzione di acetato di sodio (0,1 M acetato di sodio, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). I campioni possono essere conservati in questa fase a -20 °C per diversi mesi, ma è consigliabile procedere immediatamente alla fase qPCR.
6. PCR quantitativa, controlli e analisi
- Utilizzando 2 μL di DNA purificato, con o senza reticolazione, impostare una reazione qPCR da 20 μL secondo le istruzioni del produttore. Imposta ogni reazione in duplicato. Per entrambi i saggi DLC e DLE, ci sono cinque reazioni di controllo e una reazione di quantificazione DLC / DLE, o un totale di sei reazioni per campione, eseguite in duplicato. La Tabella Supplementare S1 e la Tabella Supplementare S2 forniscono un modello per impostare queste reazioni e analisi, e le sequenze dei primer qPCR sono elencate nella Tabella 3.
- Le condizioni di ciclo della qPCR devono essere ottimizzate per ogni kit qPCR.
- Utilizzare le seguenti condizioni DLC qPCR, a seconda dei kit qPCR utilizzati: denaturazione iniziale (95 °C per 3 min); 50 giri di amplificazione (95 °C per 15 s, 61 °C per 25 s, 72 °C per 15 s con una singola acquisizione); analisi della curva di fusione (95 °C per 5 s, 65 °C per 1 min, 97 °C con acquisizione continua); e raffreddamento (37 °C per 30 s).
- Utilizzare le seguenti condizioni qPCR per il test DLE: denaturazione iniziale (95 °C per 5 min); 50 giri di amplificazione (95 °C per 15 s, 60 °C per 30 s, 72 °C per 15 s con una singola acquisizione); analisi della curva di fusione (95 °C per 5 s, 65 °C per 1 min, 97 °C con acquisizione continua); e raffreddamento (37 °C per 30 s). Si noti che potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione per diverse macchine/kit qPCR.
- Saggio DLC
- Controlli: Vedere l'elenco dei primer qPCR nella Tabella 3. Una mappa dei siti di legame del primer è mostrata nella Figura S1. Per i file di sequenza supplementari per le caratteristiche genomiche e gli ampliconi rilevanti, controllare i file A plasmid Editor (ApE); File di sequenza supplementari 1-5.
- DNA genomico in ARG4: Utilizzare olWDH1760/olWDH1761 per amplificare il dsDNA situato in ARG4. Utilizzare questa reazione come controllo di caricamento e normalizzare tutte le altre reazioni ad eccezione della reazione del segnale DLC a questo controllo.
- Efficienza di legatura intramolecolare al DAP2: utilizzare il frammento da 1.904 bp creato dalla digestione EcoRI per la legatura intramolecolare in parallelo con la legatura DLC. L'amplificazione attraverso questa giunzione di legatura riporta l'efficienza della legatura intramolecolare e funge da controllo a cui viene normalizzato il segnale DLC.
- Induzione DSB: utilizzare olWDH1766/olWDH1767 per amplificare una regione che si estende sul DSB indotto.
- Crosslinking e resezione degli psoraleni: utilizzare olWDH2019/olWDH2020 per amplificare la regione PhiX unica a valle del sito di riconoscimento EcoRI. Senza inversione di crosslinking, utilizzare il rapporto tra ssDNA (nessuna reticolazione) su ARG4 (dsDNA reticolato) per determinare l'efficienza di reticolazione. Con l'inversione del reticolo, la resezione porterà ad una progressiva diminuzione da 1 a 0,5 del segnale relativo ad ARG4.
- EcoR Ripristino e taglio del sito di riconoscimento: utilizzare olWDH1768/olWDH1764 per amplificare una regione che si estende sul sito di riconoscimento EcoRI restaurato a monte del DSB sul filamento resecato. olWDH1769/olWDH1763 amplificano una regione che si estende sul sito dell'enzima di restrizione EcoRI al DAP2. Eseguire la scissione EcoRI in questo sito da utilizzare come controllo della legatura intramolecolare.
- Segnale DLC: utilizzare olWDH1764/olWDH1765 per amplificare la molecola di DNA chimerico creata dalla legatura intramolecolare del filamento resecato (invasore) e del donatore.
- Analisi: calcolare la deviazione media e standard dei valori Cp per ciascuna delle reazioni duplicate. Utilizzare i valori Cp del DNA genomico ARG4 qPCR come riferimento per normalizzare tutti gli altri qPCR di controllo. Normalizzare il segnale DLC al controllo della legatura intramolecolare al DAP2. Vedere la Figura 3 per i valori tipici del segnale DLC a 2 ore.
- Controlli: Vedere l'elenco dei primer qPCR nella Tabella 3. Una mappa dei siti di legame del primer è mostrata nella Figura S1. Per i file di sequenza supplementari per le caratteristiche genomiche e gli ampliconi rilevanti, controllare i file A plasmid Editor (ApE); File di sequenza supplementari 1-5.
- Saggio DLE
- Controlli: Vedere l'elenco dei primer qPCR nella Tabella 3. Una mappa dei siti di legame del primer è mostrata nella Figura S1. Per i file di sequenza supplementari per le caratteristiche genomiche e gli ampliconi rilevanti, controllare i file A plasmid Editor (ApE) (Supplementary Sequence Files 1-5).
- DNA genomico in ARG4: vedere paragrafo 6.3.1.1.
- Efficienza di legatura intramolecolare a YLR050C: utilizzare la digestione HindIII per creare un frammento di 765 bp che subirà la legatura intramolecolare in parallelo con la legatura DLE. L'amplificazione attraverso questa giunzione di legatura riporta l'efficienza della legatura intramolecolare e serve come controllo a cui il segnale DLE è normalizzato.
- Induzione DSB: vedere paragrafo 6.3.1.3.
- Cerva Ripristino e taglio del sito di riconoscimento III: utilizzare olWDH2010/olWDH2012 e olWDH2009/2011 per amplificare una regione che si estende sui siti dell'enzima di restrizione HindIII sul filamento rotto dove è stato resecato ed esteso, rispettivamente.
- Segnale DLE: Utilizzare olWDH2009/olWDH2010 per amplificare la molecola di DNA chimerico creata dalla legatura intramolecolare dell'estremità resecata del filamento invasore a monte del DSB fino all'estremità appena estesa a valle del DSB.
- Analisi: calcolare la deviazione media e standard dei valori Cp per ciascuna delle reazioni duplicate. Utilizzare i valori Cp del DNA genomico ARG4 qPCR come riferimento per normalizzare tutti gli altri qPCR di controllo. Normalizzare il segnale DLE al controllo della legatura intramolecolare a YLR050C. I valori tipici del segnale DLE a 6 ore sono riportati nella Figura 4 e nelle precedenti pubblicazioni9.
- Controlli: Vedere l'elenco dei primer qPCR nella Tabella 3. Una mappa dei siti di legame del primer è mostrata nella Figura S1. Per i file di sequenza supplementari per le caratteristiche genomiche e gli ampliconi rilevanti, controllare i file A plasmid Editor (ApE) (Supplementary Sequence Files 1-5).
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Representative Results
Saggio DLC
Il test DLC rileva sia i D-loop nascenti che quelli estesi formati dall'invasione di un DSB sito-specifico in un singolo donatore (Figura 2). La reticolazione degli psoraleni collega fisicamente il filamento rotto e il donatore attraverso il DNA eteroduplex all'interno del D-loop. Il ripristino del sito enzimatico di restrizione con un lungo oligo ibridante sul filamento resecato della rottura consente la scissione dell'enzima di restrizione, seguita dalla legatura del filamento rotto al donatore prossimale per formare un prodotto chimerico quantificato mediante qPCR. In particolare, il segnale DLC dipende dalla reticolazione degli psoraleni, dall'oligo ibridante, dalla ricombinasi centrale, Rad51 e dai fattori accessori Rad51 Rad52 e Rad548. La delezione delle elicasi/topoisomerasi del DNA Sgs1-Top3-Rmi1, Mph1 e Srs2 porta ad un aumento del segnale DLC.
La Figura 3 mostra i risultati rappresentativi per il ceppo wild type standard a 2 ore dopo l'induzione DSB in triplice copia con e senza oligo ibridante. Un campione privo di un passaggio chiave, la reticolazione degli psoraleni, è anche mostrato in duplicato.
Come mostrato nella Figura 3, la reticolazione degli psoraleni è un passaggio critico. Non c'è praticamente alcun segnale rilevabile senza di esso8. L'efficienza di reticolazione viene misurata in base al rapporto tra ssDNA e amplificazione del dsDNA. A differenza del dsDNA, l'ssDNA sperimenta una reticolazione minima degli psoraleni e, quindi, un segnale elevato indica una reticolazione riuscita. L'efficienza di reticolazione varia a seconda del tempo che intercorre tra la raccolta del campione e la preparazione per la qPCR (Figura 3, pannello in basso a sinistra). Maggiore è il tempo che intercorre tra la raccolta e la preparazione del campione, minore sarà il segnale osservato per il controllo qPCR dell'efficienza di reticolazione. Una significativa variazione intercampionaria nel segnale osservato per il controllo dell'efficienza di reticolazione qPCR è motivo di preoccupazione e il decorso temporale deve essere scartato.
ARG4 I valori Cp sono simili tra i campioni di oligo con e senza ibridazione (Figura 3, pannello in alto a sinistra). Un basso valore di Cp indica che è presente DNA più amplificabile. Questo spiega perché i valori di Cp ARG4 per i campioni senza reticolazione sono significativamente più bassi: la reticolazione interferisce con l'amplificazione qPCR. Questa differenza tra i campioni con e senza reticolazione si applica a tutti i qPCR tranne il controllo qPCR discissione EcoR I, che amplificherà ssDNA / dsDNA non reticolato. Tutti i controlli qPCR, ma non il segnale DLC, sono normalizzati al segnale QPCR ARG4 .
Per tutti i campioni, il controllo qPCR della legatura intramolecolare rientra nell'intervallo appropriato (Figura 3, pannello centrale in alto), e c'è una robusta induzione DSB, come evidenziato dal segnale basso per il controllo qPCR che si amplifica attraverso il sito di riconoscimento dell'endonucleasi HO (Figura 3, pannello in alto a destra). Nei campioni di oligo ibridanti, si osserva un taglio efficiente EcoRI e questo controllo qPCR fornisce un segnale basso (Figura 3, pannello centrale in basso). Al contrario, i campioni oligo with-crosslinking senza ibridazione danno un segnale elevato, simile a quello mostrato per il controllo qPCR dell'efficienza di reticolazione, poiché, in questo caso, l'ssDNA non tagliato viene amplificato e normalizzato al segnale ARG4 qPCR (dsDNA).
A differenza delle altre qPCR, il segnale qPCR per il test DLC è normalizzato al controllo qPCR della legatura intramolecolare, poiché la molecola chimerica quantificata dalla qPCR DLC dipende dalla legatura. Il segnale DLC mediano a 2 ore con oligo ibridante è 0,030 ± 0,0055 (Figura 3, pannello in basso a destra), in linea con i risultati precedentemente pubblicati per questo test8. Come previsto, questo segnale dipende sia dall'ibridazione oligo che dalla reticolazione degli psoraleni.
Saggio DLE
Il test DLE consente il monitoraggio accurato dell'estensione del D-loop in risposta a un DSB specifico del sito (Figura 2). È stato dimostrato in precedenza che il segnale DLE dipende da Rad51, la ricombinasi centrale nella reazione, che media l'invasione del filamento ed è, quindi, necessaria per la sintesi del DNA associata alla ricombinazione9. Inoltre, il segnale DLE dipende dalla subunità catalitica di Pol δ, Pol3 (DR, AP, WDH, dati non pubblicati) ma non dal fattore di processività non essenziale Pol32. In contrasto con il segnale DLC, che diventa rilevabile per la prima volta a 2 ore dopo l'induzione DSB, il segnale DLE aumenta notevolmente a 4 ore dopo l'induzione DSB, aumenta drammaticamente tra 4 h e 6 h e inizia a stabilizzarsi successivamente, con gran parte dell'aumento del segnale tra 6 h e 8 h attribuibile alla formazione del prodotto BIR8, 9.
Poiché il prodotto di legatura chimerica quantificato nel test DLE è a singolo filamento, la fase di sferoplasia e lisi cellulare è fondamentale. La diminuzione del segnale DLE può derivare da problemi con questo passaggio, che possono rilasciare nucleasi e portare alla degradazione del ssDNA bersaglio.
La Figura 4 mostra risultati rappresentativi per il ceppo wild type standard a 6 ore dopo l'induzione DSB in triplice copia con e senza oligo ibridanti. Il campione wild type senza oligo ibridanti rappresenta il solo prodotto dsDNA BIR, mentre il segnale with-oligo deriva sia dall'ssDNA del D-loop esteso che dal prodotto dsDNA BIR. Un terzo esempio è incluso come esempio di esperimento fallito.
ARG4 I valori di Cp erano simili tra i campioni di oligo con e senza ibridazione (Figura 4, pannello in alto a sinistra). ARG4 I valori di Cp erano notevolmente più bassi per il campione fallito, indicando che questo campione ha più DNA genomico rispetto ai campioni di successo. I segnali qPCR per i controlli qPCR, ma non il segnale DLE, sono stati normalizzati al segnale QPCR ARG4 . Il controllo qPCR della legatura intramolecolare ha rivelato un segnale accettabile per i campioni di oligos con e senza ibridazione (tra ~ 0,15-0,35) ma un segnale sostanzialmente inferiore per il campione fallito (Figura 4, pannello in alto al centro). In questo campione fallito, l'elevata quantità di DNA genomico indicata dal controllo ARG4 qPCR probabilmente ha causato il fallimento della legatura intramolecolare, poiché un'alta concentrazione di DNA genomico porterà alla legatura intermolecolare.
In tutti e tre i campioni, c'era una robusta induzione DSB (Figura 4, pannello in alto a destra). Cerva La scissione III su entrambi i fili resecati ed estesi dipende dalla presenza degli oligo ibridanti. Sul filo esteso, dipende inoltre dall'estensione del D-loop. Pertanto, c'era una differenza significativa nell'amplificazione attraverso il sito di scissione Hind III sul filamento resecato tra i campioni con e senza oligo (Figura 4, pannello in basso a sinistra) e una differenza minore nell'amplificazione attraverso il sito di riconoscimento HindIII sul filamento esteso tra questi campioni (Figura 4, pannello in basso al centro).
Poiché il segnale DLE dipende dalla legatura intramolecolare, viene normalizzato al controllo qPCR della legatura intramolecolare. Il segnale DLE mediano a 6 ore con oligo ibridanti era 0,53 ± 0,17 (Figura 4, pannello in basso a destra), coerente con i risultati precedentemente pubblicati per questo test9. Il segnale DLE per il campione wild type senza oligo ibridanti era analogamente compatibile con questa pubblicazione precedente. Il segnale DLE era inferiore al previsto per il campione fallito, probabilmente riflettendo i problemi con quel campione sopra menzionati.
Inversione dei collegamenti incrociati
Gli psoraleni intercalati tra coppie di basi ApT/TpA nel dsDNA possono diventare legati covalentemente attraverso i suoi anelli furanici e pironici a una o entrambe le basi opposte della timina dopo irradiazione UV, risultando in mono-addotti (prevalentemente furano) o di-addotti inter-filamento (cioè reticoli), rispettivamente22. Ci si aspetta che queste modifiche blocchino la progressione della DNA polimerasi, inibendo così la reazione di sintesi del DNA parte integrante della PCR quantitativa. Di conseguenza, la maggior parte dei modelli di dsDNA non può essere amplificata (Figura 5A,B). Al contrario, l'assenza di coppie di basi nel ssDNA lo rende meno incline al crosslinking degli psoraleni. È, quindi, amplificato più facilmente del dsDNA, che distorce la quantificazione relativa di ssDNA rispetto a dsDNA e di ampliconi dsDNA di diverse lunghezze e contenuto di ApT / TpA (Figura 5A, B). Per superare queste limitazioni, è stata applicata un'inversione catalizzata dalla base e dal calore della fase23 di inversione del reticolo psoralenico prima della PCR quantitativa. Questo metodo lascia solo le specie minori di monoaddotti lato pirone23,24. Ha portato a un recupero di 80 volte del dsDNA genomico e ampliconi di controllo della legatura intramolecolare, indicando che la grande maggioranza delle molecole modello aveva almeno un monoaddotto lato furano o reticolo incrociato tra filamenti (Figura 5B, C). Il confronto dei valori Cp del controllo genomico del DNA dsDNA prima e dopo l'inversione del crosslink fornisce una stima dell'efficienza di reticolazione, che dovrebbe essere nell'intervallo mostrato qui. Oltre agli ampliconi brevi, questa procedura può ripristinare modelli lunghi fino a 3 kb (Figura S2). Non è stato osservato alcun cambiamento per l'amplicone ssDNA, coerente con una mancanza di reticolazione degli psoraleni al ssDNA (Figura 5B-D). Mostra anche che la procedura di inversione del reticolo non danneggia in modo rilevabile il DNA23. Il recupero del DLC chimera amplicon, che contiene un segmento di dsDNA reticolato legato a un segmento ds-ssDNA non reticolato (50 bp e 118 bp/nt; Figura 5A) era intermedio a quello degli ampliconi di dsDNA e ssDNA, con un miglioramento di 8 volte nel recupero (Figura 5B,C). L'inversione del crosslink non ha influenzato i livelli relativi dei due ampliconi del dsDNA, con il controllo della legatura intramolecolare che è rimasto nell'intervallo 0,2-0,25 rispetto al controllo del DNA genomico (Figura 5E). Tuttavia, ha cambiato la quantità relativa dell'amplicone ssDNA rispetto al controllo del DNA genomico dsDNA da un eccesso di 40 volte a 0,5 volte previsto per un ssDNA rispetto a un modello di dsDNA (Figura 5D). Allo stesso modo, il segnale DLC parzialmente ssDNA è diminuito da 6,6 x 10−2 a 6,6 x 10−3 rispetto ai controlli di legatura intramolecolare del dsDNA (Figura 5F). Questo ci porta a stimare il numero di molecole articolari D-loop in un donatore intercromosomico rilevato da questo approccio 4 ore dopo l'induzione DSB per essere una media dell'1,3% del totale delle molecole rotte nella popolazione cellulare. Tali stime assolute non potrebbero essere fatte con la distorsione basata sugli psoraleni del dsDNA e l'amplificazione del ssDNA, il che evidenzia il valore di questa ulteriore fase di inversione della reticolazione.
Figura 1: Sottovie di ricombinazione e risoluzione omologa. A seguito di un danno al DNA che si traduce in un DSB a una o due estremità (mostrato) o in un gap di ssDNA, la resezione da 5' a 3' delle estremità del DNA rivela 3' sporgenze di ssDNA su cui si forma il filamento Rad51, aiutato dai suoi fattori accessori. Rad51 cerca quindi nel genoma un DNA duplex intatto (cioè il donatore) su cui modellare l'evento di riparazione. Questo processo culmina nell'invasione del filamento di DNA, in cui il filamento rotto della base di Watson-Crick si accoppia con il filamento complementare del donatore di DNA a doppio filamento, spostando il filamento opposto e formando il nascente D-loop. Questo D-loop può essere invertito per consentire la ricerca dell'omologia Rad51 per selezionare un donatore diverso o esteso da una DNA polimerasi per sostituire le basi perse durante l'evento di danno al DNA. Sono disponibili tre sottopercorsi HR per risolvere questo intermedio D-loop esteso in un prodotto. In primo luogo, il D-loop esteso può essere interrotto da un'elicasi, consentendo alla nuova estremità estesa della rottura di ricottura alla seconda estremità in un processo chiamato ricottura del filamento dipendente dalla sintesi (SDSA). La sintesi e la legatura del DNA di riempimento portano quindi alla formazione del prodotto. In alternativa, la seconda estremità della rottura può ricottura al filamento donatore spostato, formando una doppia giunzione Holliday (dHJ). La risoluzione nucleolitica del dHJ provoca un crossover (CO) o un non-crossover (NCO), mentre la dissoluzione del dHJ (non mostrata) risulta solo nei prodotti NCO. Infine, il mancato innesto della seconda estremità del DSB provoca la replicazione indotta da rottura (BIR), un processo mutageno in cui migliaia di coppie di basi vengono copiate dal donatore sul filamento rotto. Questo processo può estendersi fino alla forcella di replicazione convergente o alla fine del cromosoma. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Premessa dei saggi di formazione del prodotto D-loop capture (DLC), D-loop extension (DLE) e break-induced replication (BIR). La formazione di DSB è guidata da un'endonucleasi sito-specifica sotto il controllo del promotore GAL1 . L'induzione DSB porta alla formazione di un nascente D-loop. Nel test DLC, la reticolazione inter-filamento del DNA preserva questa struttura, che viene poi estratta. Il ripristino del sito enzimatico di restrizione si ottiene tramite ibridazione con un oligonucleotide lungo, quindi il DNA viene digerito e legato per formare un prodotto che può essere quantificato mediante PCR quantitativa (qPCR). Il test DLE differisce in quanto il DNA non è reticolato, e invece, il prodotto di legatura intramolecolare si forma tra le due estremità del ssDNA su un lato della rottura, l'estremità 3' è stata estesa da una DNA polimerasi. La qPCR viene nuovamente utilizzata per quantificare la formazione del prodotto di legatura chimerica. Anche il rilevamento dell'estensione del D-loop tramite il test DLE richiede il ripristino del sito enzimatico di restrizione. Al contrario, il prodotto BIR a doppio filamento viene rilevato utilizzando i primer del saggio DLE senza gli oligonucleotidi ibridanti. R indica che un sito enzimatico di restrizione è competente per la scissione enzimatica; (R) indica un sito enzimatico di restrizione che non può essere tagliato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi dell'analisi dei saggi DLC dei D-loop a 2 ore dopo l'induzione DSB. I campioni sono stati raccolti, preparati e analizzati mediante qPCR come descritto in questo protocollo. I simboli blu rappresentano i risultati per il ceppo wild type standard con oligo ibridanti per n = 3. I simboli verdi rappresentano i risultati per il ceppo wild type senza ibridare oligo per n = 3. La spessa linea rossa mostra la mediana. I simboli viola rappresentano campioni senza reticolazione psoralenica ma con oligo ibridanti per n = 2. I simboli indicano che i campioni derivano dalla stessa cultura. Le differenze intersperimentali nell'efficienza di reticolazione possono introdurre variabilità in alcuni controlli qPCR, ma non sono problematiche finché non vi è variabilità intercampionaria in questi controlli qPCR all'interno di un esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi dell'analisi del saggio DLE 6 ore dopo l'induzione DSB. I campioni sono stati raccolti, preparati e analizzati mediante qPCR come descritto in questo protocollo. I simboli blu rappresentano i risultati per il ceppo wild type standard con oligo ibridanti per n = 3. I simboli verdi rappresentano i risultati per il ceppo wild type senza ibridare oligo per n = 3. La spessa linea rossa mostra la mediana. Si noti che i campioni di oligos con e senza ibridazione derivano dalle stesse colture. Il diamante viola rappresenta un campione fallito senza ibridare oligo per n = 1. I simboli indicano che i campioni derivano dalla stessa cultura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi dell'inversione del reticolo psoralenico . (A) I monoaddotti psoralene-DNA (*) e i legami incrociati inter-filamento (X) si verificano specificamente sul dsDNA e ne impediscono l'amplificazione da parte delle DNA polimerasi, a differenza dei modelli di ssDNA. Questa differenza introduce una distorsione nella quantificazione dei modelli contenenti dsDNA e ssDNA mediante qPCR. Questa distorsione può essere superata dopo l'inversione del reticolo psoralenico. (B) Valori rappresentativi di Cp di dsDNA (genomica, legatura), ssDNA e ampliconi misti ds-ssDNA (DLC) ottenuti 4 ore dopo l'induzione DSB. I dati rappresentano i valori individuali e la mediana di quattro repliche biologiche. (C) Recupero dell'amplificazione in caso di inversione del reticolo, calcolato a partire dai valori Cp di cui alla lettera B). (D) L'amplificazione del ssDNA relativa al controllo genomico del dsDNA con e senza inversione del reticolo psoralenico. All'inversione, l'amplicone ssDNA si amplifica allo 0,5 previsto del controllo genomico del dsDNA. (E) Il controllo della legatura intramolecolare del dsDNA relativo al controllo genomico del dsDNA con e senza inversione del reticolo psoralenico. (F) Il segnale DLC relativo al controllo della legatura del dsDNA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Sistema di analisi DLC/DLE attuale e modifiche proposte. Sopra: vengono mostrati il sito di interruzione del test DLC / DLE corrente e il donatore. Sotto: Modifiche pianificate al sito di interruzione del test DLC/DLE e al donatore. (I) Il sito di taglio dell'endonucleasi HO a 117 bp è indicato in giallo. Per evitare effetti confondenti durante il monitoraggio dell'interruzione del D-loop, il lato sinistro degli HOcs (74 bp) verrà introdotto nel donatore, in modo tale che la ricombinazione tra i due crei un D-loop perfettamente abbinato privo di un lembo di 3'. (II) Per rendere il sistema riparabile e, quindi, più fisiologico, il DNA omologo al donatore (indicato in verde acqua e lilla) verrà inserito nella parte destra dell'HOcs. (III) L'invasione e l'estensione da parte del filo a destra degli HOcs saranno monitorate utilizzando sequenze uniche per quel lato della rottura (indicate in arancione). (IV) Ulteriori siti enzimatici di restrizione uniformemente distanziati e sequenze uniche per il donatore consentiranno di monitorare l'estensione del D-loop (tramite invasione dal lato sinistro degli HOcs) in siti più distanti. In questo sistema modificato, la ricottura del filamento dipendente dalla sintesi (SDSA) o la formazione della giunzione a doppia Holliday (dHJ) possono verificarsi nei siti mostrati in verde acqua o lilla. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Mappa dei primer qPCR utilizzati nei saggi DLC e DLE. Mappa dei loci genomici utilizzati per l'analisi nei saggi DLC e DLE, le loro caratteristiche rilevanti e i siti approssimativi di legame del primer (vedere Tabella 3 per un elenco dei primer qPCR). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Valutazione qualitativa dell'inversione del reticolo su ampi ampliconi. Il DNA genomico è stato preparato da campioni reticolati o non reticolati, dove indicato, come descritto nel protocollo, paragrafi 1-5. La PCR non quantitativa è stata utilizzata per amplificare il segmento di 3 kbp che copre la regione di omologia condivisa tra il sito di rottura e il donatore. Si noti che, a causa delle differenze nell'efficienza di amplificazione tra DNA reticolato e non reticolato e della quantità limitata di campione, non è stato possibile standardizzare il DNA di input. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella 1: ceppo di S. cerevisiae utilizzato per l'analisi dei dosaggi DLC e DLE. Genotipo del ceppo di lievito aploide utilizzato in questo studio. Il ceppo è disponibile su richiesta. Ulteriori ceppi disponibili per l'analisi del saggio DLC/DLE possono essere trovati in Piazza et al.8 e Piazza et al.9. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Oligonucleotidi ibridanti utilizzati per l'analisi dei saggi DLC e DLE. Le sequenze dei lunghi oligonucleotidi ibridanti utilizzati nei saggi DLC e DLE. Si raccomanda un'ulteriore purificazione SDS-PAGE degli oligonucleotidi ibridanti da parte del fornitore di oligonucleotidi personalizzato. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: primer qPCR utilizzati per l'analisi di dosaggi DLC e DLE. Le coppie di primer qPCR per i saggi DLC e DLE e le descrizioni dei loro scopi. Si noti che olWDH1764, olWDH2009 e olWDH2010 sono utilizzati in due qPCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare S1: Modello per l'impostazione e l'analisi del test DLC qPCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare S2: Modello per l'impostazione e l'analisi del test DLE qPCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.
File di sequenza supplementari 1-5. File di sequenza supplementari per le caratteristiche genomiche e gli ampliconi rilevanti. I file di sequenza sono nel formato di file ApE; ApE è un software disponibile gratuitamente per la visualizzazione e l'editing di sequenze di DNA. I file ApE sono anche compatibili con tutti i principali software di editing di sequenze. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
I saggi presentati consentono la rilevazione di D-loop nascenti ed estesi (saggio DLC), estensione D-loop (saggio DLE) e formazione del prodotto BIR (saggio DLE senza oligonucleotidi ibridanti) utilizzando la legatura di prossimità e la qPCR. ChIP-qPCR di Rad51 verso siti distanti dal DSB è stato precedentemente utilizzato come proxy per la ricerca di omologia mediata da Rad51 e la formazione di D-loop. Tuttavia, questo segnale ChIP-qPCR è indipendente dall'omologia di sequenza tra il sito di rottura e un potenziale donatore, così come dal fattore Rad54 associato a Rad51, ed è, quindi, più probabile che rappresenti un'associazione transitoria tra il filamento Rad51-ssDNA e il dsDNA piuttosto che un D-loop intermedio10,11. Al contrario, il segnale DLC dipende dalla formazione DSB, Rad51, Rad52, Rad54 e dall'omologia di sequenza condivisa tra il DSB e il sito donatore analizzato8. Inoltre, si osserva un aumento dei segnali DLC in assenza delle elicasi Mph1 e Srs2 e del complesso elicasi-topoisomerasi Sgs1-Top3-Rmi1, coerentemente con i precedenti rapporti secondo cui questi tre fattori possono disassemblare i D-loop nascenti fatti da Rad51/Rad54 in vitro 8,25,26,27. Il test DLE rappresenta allo stesso modo un miglioramento rispetto ai metodi precedenti per seguire la sintesi del DNA associata alla ricombinazione, in quanto può distinguere tra estensione del D-loop e formazione del prodotto BIR19.
Come discusso in precedenza, i controlli qPCR, inclusi quelli per il DNA genomico, l'induzione DSB, il cross-linking degli psoraleni, la legatura intramolecolare e l'ibridazione oligonucleotidica, sono fondamentali per il successo e la riproducibilità di questi test. I valori di qPCR del DNA genomico grezzo dovrebbero essere approssimativamente equivalenti tra i campioni. Bassi valori di Cp per il controllo del DNA genomico ARG4 indicano un eccesso di DNA e il numero di cellule raccolte deve essere regolato. Alti valori di Cp per questo controllo indicano un recupero insufficiente del DNA o contaminazione con reagenti che interferiscono con la qPCR. Dopo la sferoplasta, la lisi cellulare può essere osservata utilizzando un microscopio ottico standard e volumi uguali di campione e acqua sterile. Se si osserva una lisi insufficiente con l'aggiunta di acqua, la soluzione di zimolyasi deve essere rifatta o l'incubazione a 30 °C deve essere prolungata. Il campione può anche essere perso o i contaminanti introdotti durante la purificazione del DNA mediante estrazione P/C/IA. Per il recupero efficiente del DNA, si dovrebbe assicurarsi che il pH del P/C/IA sia stato regolato a ~8,0 e che la fase inferiore non venga disturbata durante la rimozione della fase superiore. Infine, una risospensione inefficiente del pellet di DNA in 1x TE può causare bassi valori di Cp. Un'incubazione più lunga a 37 °C e vortice miglioreranno la risospensione del pellet di DNA.
Oltre al controllo del DNA genomico del DNA, anche le reazioni di controllo della scissione dell'enzima di induzione e restrizione DSB dovrebbero essere simili tra i campioni. L'endonucleasi HO o il taglio dell'enzima di restrizione nel sito del DSB o del sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione impedisce l'amplificazione in questa regione; pertanto, i valori tipici normalizzati di qPCR per questi controlli sono vicini allo zero e un valore qPCR elevato indica una scissione insufficiente. Se si osserva un segnale elevato nel sito del DSB, la soluzione di galattosio deve essere ricostruita. Per i mutanti con un difetto noto del ciclo cellulare, l'induzione di DSB deve essere quantificata mediante placcatura di quantità uguali di coltura coltivata secondo il protocollo (vedere paragrafo 1) su terreni YPDA e YPA integrati con galattosio. Le colonie che crescono su terreni contenenti galattosio rappresentano lievito in cui l'unione finale ha creato un HOcs inscoppo. Se ci sono significativamente più eventi di end-join in un mutante di interesse rispetto al tipo wild, è necessario applicare una correzione per compensare questa differenza nell'induzione DSB, che influenzerà il segnale DLC/DLE.
Tre coppie di primer (olWDH1764/olWDH1768, olWDH2010/olWDH2012 e olWDH2009/olWDH2011) valutano il ripristino del sito enzimatico di restrizione da parte degli oligo ibridanti e il taglio da parte degli enzimi di restrizione EcoRI-HF e HindIII-HF. Inoltre, i controlli della legatura intramolecolare dipendono anche da un'adeguata digestione enzimatica di restrizione. Pertanto, un campione con bassa efficienza di legatura intramolecolare e un segnale elevato per una di queste tre coppie di primer ha un taglio enzimatico di restrizione insufficiente. Ulteriori enzimi di restrizione devono essere forniti nelle preparazioni successive e l'efficacia dell'enzima di restrizione deve essere valutata sul DNA genomico. La coppia di primer olWDH1769/olWDH1763 rappresenta un controllo aggiuntivo per il test DLC, che misura la scissione EcoRI al DAP2, dove viene misurata anche l'efficienza della legatura intramolecolare. Un campione con un adeguato segnale di legatura intramolecolare ma un segnale elevato per una di queste tre coppie di primer ha un ripristino inadeguato del sito enzimatico di restrizione da parte degli oligo ibridanti. Per risolvere questo problema, devono essere raccolti campioni duplicati e deve essere variata la concentrazione degli oligo ibridanti interessati. I valori tipici di qPCR ottenuti per queste reazioni con e senza oligo ibridanti possono essere trovati in Figura 3 e Figura 4 e in Piazza et al.8 e Piazza et al.9.
Sia per il DLC che per il test DLE, un'efficienza di legatura intramolecolare di 0,15-0,35 come normalizzata al controllo del DNA genomico è considerata normale. Poiché il rilevamento di D-loop nascenti ed estesi e del prodotto BIR dipende da una legatura efficiente, i campioni con segnali di legatura bassa devono essere scartati. Il tampone di legatura 10x privo di ATP deve essere conservato a 4 °C per non più di 6 mesi. La raccolta di troppe cellule può portare alla legatura intermolecolare, che si tradurrà in una bassa efficienza di legatura intramolecolare e nel segnale DLC / DLE.
Sebbene questi controlli per i saggi DLC e DLE riportino quasi tutti i passaggi sensibili, è ancora possibile ottenere valori non fisiologici per il segnale DLC o DLE quando questi controlli rientrano nell'intervallo appropriato. Un segnale DLC o DLE basso può derivare da errori nella fase di spheroplasting cellulare, che è estremamente sensibile. Si dovrebbero trattare solo pochi campioni in parallelo e mantenerli sempre a 4 °C. Un segnale DLC/DLE alto/basso può anche derivare dalla raccolta di troppe/poche celle in ogni punto temporale. Questo problema può essere risolto raccogliendo più OD600s di celle in ogni punto temporale per ogni campione.
Ci sono diverse limitazioni tecniche e concettuali ai test DLC e DLE nella loro forma attuale. In primo luogo, la densità di reticolazione inter-filamento mediata da psoraleni è ~ 1 in 500 bp8. Pertanto, un aumento del segnale DLC può indicare che ci sono più D-loop nella popolazione, che la lunghezza media dei D-loop nella popolazione è aumentata (supponendo che i D-loop possano essere inferiori a 500 bp), o entrambi. Inoltre, la probabilità che un D-loop venga catturato dal test DLC diminuisce con la diminuzione della lunghezza del D-loop. Dato che i D-loop molto brevi possono rappresentare una frazione significativa della popolazione totale di D-loop in determinati contesti mutanti, questa limitazione del saggio deve essere considerata quando si interpretano i risultati. In secondo luogo, il test DLC richiede il crosslinking del DNA, mentre il test DLE no. In precedenza, per un determinato esperimento, ciò significava che i campioni DLC e DLE dovevano essere raccolti e analizzati separatamente. Il metodo mostrato nella Figura 5 raggiunge una robusta inversione di reticolazione, alleviando la necessità di raccogliere più campioni dalla stessa coltura. L'introduzione di un secondo sito enzimatico di restrizione Eco RI sul filamento rotto, a valle del sito di riconoscimento HindIII, consentirà l'analisi sequenziale diDLC e DLE.
Oltre a queste limitazioni tecniche, il sistema di analisi DLC e DLE attualmente non consente il recupero di prodotti HR vitali perché il lato destro del DSB inducibile manca di omologia con il donatore. Per comprendere meglio la cinetica e il meccanismo di coinvolgimento e sintesi della seconda estremità, il sistema potrebbe essere modificato in modo tale che la riparazione utilizzando una regione prossimale o distale di omologia condivisa tra la seconda estremità della rottura e il donatore sia fattibile (Figura 6). Guardando al futuro, potrebbe rivelarsi utile combinare i saggi DLC e DLE con altre tecnologie, come ChIP-qPCR, acquisizione della conformazione cromosomica ad alto rendimento (Hi-C) e mappatura del D-loop in vivo , per ottenere un'analisi completa della cinetica e della regolazione delle fasi del percorso HR, compresa la formazione di rottura, la resezione finale, la formazione del filamento Rad51, la formazione del D-loop nascente, Estensione D-loop, inversione D-loop, secondo end engagement, seconda sintesi end e risoluzione28.
In sintesi, i saggi DLC e DLE consentono la quantificazione dei D-loop nascenti ed estesi, dell'estensione del D-loop e della formazione del prodotto BIR utilizzando il principio della legatura di prossimità. Questi saggi rappresentano importanti progressi nel campo, in quanto sono i primi a consentire la misurazione semi-quantitativa della formazione e dell'estensione del D-loop indipendentemente dalla vitalità cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro nel laboratorio Heyer è supportato da sovvenzioni GM58015 e GM137751 a W.-D.H. La ricerca nel laboratorio Piazza è sostenuta dal Consiglio europeo della ricerca (ERC-StG 3D-loop, grand agreement 851006). D.R. è sostenuto da T32CA108459 e dalla Fondazione A.P. Giannini. Ringraziamo Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) per aver condiviso i risultati del suo test DLC/DLE e per aver ulteriormente convalidato le modifiche ai test che sono dettagliate in questo protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
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