نقدم بروتوكولا مفصلا لزراعة أجنة الفئران والتصوير الذي يتيح تصوير وقت 3D + للخلايا السلفية القلبية. تتناول مجموعة أدوات الفيديو هذه المهارات الأساسية المطلوبة للتصوير المباشر الناجح الذي يصعب اكتسابه من المنشورات النصية فقط.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير الحي لأسلاف القلب المبكرة في جنين الفأر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتضمن الخطوات الأولى لنمو القلب تغييرات جذرية في سلوك الخلية والتمايز. بينما يسمح تحليل الأجنة الثابتة بدراسة مراحل نمو محددة بالتفصيل في لقطة ثابتة ، فإن التصوير الحي يلتقط الأحداث المورفولوجية الديناميكية ، مثل هجرة الخلايا وتغيرات الشكل والتمايز ، عن طريق تصوير الجنين أثناء تطوره. هذا يكمل التحليل الثابت ويوسع فهم كيفية تطور الأعضاء أثناء التطور الجنيني. على الرغم من مزاياه ، نادرا ما يستخدم التصوير المباشر في نماذج الماوس بسبب تحدياته التقنية. تكون أجنة الفئران المبكرة حساسة عند استزراعها خارج الجسم الحي وتتطلب معالجة فعالة. لتسهيل الاستخدام الأوسع للتصوير الحي في أبحاث نمو الفئران ، تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للفحص المجهري الحي ثنائي الفوتون الذي يسمح باكتساب أجنة الفئران على المدى الطويل. بالإضافة إلى البروتوكول ، يتم تقديم نصائح حول التعامل مع الأجنة وتحسين الثقافة. سيساعد هذا في فهم الأحداث الرئيسية في تكوين أعضاء الفئران المبكرة ، مما يعزز فهم بيولوجيا السلف القلبي الوعائي.
المقدمة
يتشكل القلب مبكرا أثناء التطور الجنيني لبدء ضخ العناصر الغذائية إلى الجنين بأكمله ، بينما يستمر في النمو1. في أجنة الفئران ، بعد يوم ونصف من بدء المعدة ، يتجمع عضو القلب البدائي في القطب الأمامي 2,3. بحلول مرحلة الخط المبكر (ES) ، يدخل السلف القلبي في epiblast عبر الخط البدائي إلى طبقة الأديم المتوسط الوليدة4،5،6 ويبدأ في الهجرة إلى القطب الأمامي ، حيث يتمايز لتشكيل أنبوب القلب البدائي. خلال هذه العملية ، يخضع أسلاف القلب الأوائل لإعادة ترتيب الخلايا ، وتحولات الشكل ، والتمايز ، بالإضافة إلى ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات CNIC ، من قبل مجتمع مدريد (المرجع PROEX 220/15) وتتوافق مع توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63EU والتوصية 2007/526 / EC بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض تجريبية وعلمية أخرى ، تم فرضها في القانون الإسباني بموجب Real Decreto 1201/2005.
يتضمن هذا البروتوكول استخدام ذكرين من خط الفأر الفلوري المعدل وراثيا للإبلاغ عن نشاط NOTCH Tg (CBF: H2BVenus ، +) 18. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول المواد والحيوانات والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. الأدوات وتخصيص الحامل
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدمنا البروتوكول لتصور تنشيط إشارات NOTCH في أسلاف القلب المبكرة على وشك التمايز إلى الخلايا البطانية أثناء تشكل أنبوب القلب البدائي. لذلك ، عبرنا الفئران من النوع البري C57BL / 6-N مع الفئران Tg (CBF: H2BVenus ، +)18 للحصول على أجنة تبلغ عن نشاط NOTCH من خلال بروتين الفلورسنت الأصفر فينوس. في E7.5 ، يوجد تألق فينوس في جميع أنحاء الأديم الظاهر العصبي ، مع وجود عدد قليل من النوى الإيجابية في الأديم المتوسط السطحي وخارج الجنين. بعد 4 ساعات ، تنشط الأسلاف البطانية كوكب الزهرة وتتجمع لتشكيل أنبوب ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ينتظم أسلاف القلب الأوائل في أنبوب قلب بدائي يبدأ في النبض بينما لا يزال يتشكل. يعد فهم كيفية حدوث هذه العملية أمرا أساسيا لتحديد مجموعة واسعة من عيوب القلب الخلقية لأحداث مورفوجينية محددة. لذلك ، يوفر التصوير الحي فرصة لدراسة التطور الجنيني الطبيعي والمعيب مع زيادة الدقة الزمنية. هذا مفيد بشكل خاص لدراسة الخلايا السلفية القلبية المبكرة أثناء انتقالها بسرعة من خلال سلوكيات التمايز والهجرة المتعددة7.
نظرا لأنه يمكننا دراسة المراحل الجنينية المختلفة في عينة واحدة ، يمكن ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
يعترف المؤلفون بالدكتور كينزو إيفانوفيتش لعمله السابق على هذه الطريقة ومجموعة الدكتور شيجينوري نوناكا (المعاهد الوطنية للعلوم الطبيعية ، اليابان) لتوفير الخبرة الأولية في تركيب الأجنة. تم دعم هذه الدراسة من قبل Grant PGC2018-096486-B-I00 من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية و Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 من برنامج EU Horizon 2020 إلى MT و Grant 1380918 من برنامج التشغيل FEDER Andalucía 2014-2020 إلى JND. تم دعم MS من خلال زمالة الدكتوراه في مؤسسة La Caixa (LCF / BQ / DE18 / 11670014) وزمالة سفر شركة علماء الأحياء (DEVTF181145). يتم دعم CNIC من قبل وزارة العلوم الإسبانية ومؤسسة ProCNIC.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| # 55 ملقط | دومون ; | 11295-51 | |
| 35 مم طبق مع غطاء زجاجي أسفل 14 مم قطر | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 مم طاولة ملزمة | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| أنابيب 50 مل | BD Falcon | 352070 | |
| ماء | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | مع L-Glutamine ، بدون جلوكوز ، بدون Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| الفئران المعدلة وراثيا الفلورية (Tg (CBF: H2BVenus ، +) ؛ | JAX | ||
| فلوروبريت DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM لتصوير الخلايا الحية |
| شحم سيليكون عالي الفراغ | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| حامل للأسلاك Perlen | Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 مجهر مستقيم | Zeiss & nbsp ؛ | ||
| مايتاي ديبسي بعيد الأحمر النبضي الليزر المضبوطة في 980 نانومتر | Spectra-Physics | ||
| غير الممسوحة ضوئيا كاشفات مجهزة بمجموعات المرشحات السماوي الأصفر (BP450-500 / BP520-560) والأخضر والأحمر (BP500-520 / BP570-610) والأصفر والأحمر (BP520-560 / BP645-710) | Zeiss & nbsp ؛ | ||
| Obj: 20x غمس الماء 1.0 NA ، مسافة عمل طويلة | Zeiss ؛ | ||
| ماصات P1000 و P200 زيت | |||
| البارافين | Nidacon | VNI0049 | |
| البنسلين الستربتومايسين | Invitrogen | 15070-063 | (يجب أن يكون التركيز النهائي 50 مو ؛ جم / مل البنسلين و 50 مو ؛ جم / مل ستربتومايسين) |
| أطباق بتري 35 مم × 10 مم | BD Falcon | 351008 | |
| أطراف | |||
| بولي ميثيل ميثاكريلات ؛ | أعيد استخدامها من معدات المختبرات | ||
| القديمة جنين زراعة مصل الفئران ، ذكور الفئران SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| مجموعة من غرامات 160 مم RS | PRO | 541-6933 | |
| الشعيرات الدموية الزجاجية القياسية 1.0 مم | Anima Lab | ؛ 1B100F-3 | |
| معقم 0.22 مو ؛ م حقنة مرشح | كورنينج | 431218 | |
| معقمة 5 مل حقنة | فيشر العلمية | 15809152 | |
| التنغستن إبر | |||
| بالموجات فوق الصوتية (سونيكاتور) | Bandelin | BASO_17021 |
المراجع
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113(2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medi....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
