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Article de méthode

Imagerie en direct des premiers progéniteurs cardiaques dans l’embryon de souris

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DOI :

10.3791/64273

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12 juillet 2022

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Regeneration Program, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Cardiovascular Development Group, Department of Experimental Biology, University of Jaén, Jaén, 3Fundación Medina, Granada

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole détaillé pour la culture et l’imagerie d’embryons de souris qui permet l’imagerie 3D + temps des cellules progénitrices cardiaques. Cette boîte à outils vidéo aborde les compétences clés requises pour réussir l’imagerie en direct autrement difficile à acquérir à partir de publications textuelles.

Résumé

Les premières étapes du développement cardiaque impliquent des changements drastiques dans le comportement et la différenciation cellulaire. Alors que l’analyse d’embryons fixes permet d’étudier en détail des stades de développement spécifiques dans un instantané fixe, l’imagerie en direct capture des événements morphogénétiques dynamiques, tels que la migration cellulaire, les changements de forme et la différenciation, en imageant l’embryon au fur et à mesure de son développement. Cela complète l’analyse fixe et élargit la compréhension de la façon dont les organes se développent au cours de l’embryogenèse. Malgré ses avantages, l’imagerie en direct est rarement utilisée dans les modèles murins en raison de ses défis techniques. Les embryons précoces de souris sont sensibles lorsqu’ils sont cultivés ex vivo et nécessitent une manipulation efficace. Pour faciliter une utilisation plus large de l’imagerie en direct dans la recherche sur le développement de la souris, cet article présente un protocole détaillé pour la microscopie vivante à deux photons qui permet l’acquisition à long terme dans les embryons de souris. En plus du protocole, des conseils sont fournis sur la manipulation des embryons et l’optimisation de la culture. Cela aidera à comprendre les événements clés de l’organogenèse précoce de la souris, améliorant ainsi la compréhension de la biologie des progéniteurs cardiovasculaires.

Introduction

Le cœur se forme tôt au cours de l’embryogenèse pour commencer à pomper les nutriments vers l’embryon entier, tandis qu’il continue à se développer1. Chez les embryons de souris, un jour et demi après le début de la gastrulation, un organe cardiaque rudimentaire s’assemble au pôle antérieur 2,3. Au stade Early Streak (ES), les progéniteurs cardiaques de l’épiblaste pénètrent à travers la traînée primitive jusqu’à la couche mésodermique naissante 4,5,6 et commencent à migrer vers le pôle antérieur, où ils se différencient pour former le tube cardiaque primitif. Tout au long de ce processus, les premiers progéniteurs cardiaques subissent des réarrangements cellulaires, des transformations de forme et une différenciation, en plus de la migration7 (Figure 1).

Les premiers progéniteurs cardiaques attirent les chercheurs depuis près d’un siècle en raison de leur capacité remarquable à différencier et à construire un organe fonctionnel simultanément. Au cours des deux dernières décennies, l’analyse clonale et les modèles d’élimination conditionnelle ont montré que le développement cardiaque précoce implique des sources cellulaires distinctes dans un processus hautement dynamique 8,9,10. Cependant, la structure 3D du tube cardiaque primitif et la nature dynamique de sa morphogenèse le rendent difficile à étudier (Figure 1), et nous sommes loin d’en comprendre toute la complexité11.

Pour étudier ces processus cellulaires dynamiques, les méthodes d’imagerie en direct offrent maintenant un détail sans précédent 7,12,13,14. Dans le modèle murin, les approches en direct ont été essentielles pour interroger les sujets de développement qui sont difficiles à aborder par l’analyse statique 7,13,15. Alors que la culture ex vivo à long terme et les configurations de microscope robustes progressent rapidement16,17, peu de chercheurs ont l’expertise nécessaire pour imager avec succès des embryons vivants. Bien que les publications papier fournissent suffisamment de détails techniques pour reproduire des expériences d’imagerie en direct, certaines compétences et astuces sont difficiles à saisir sans exemples visuels ou assistance entre pairs. Pour accélérer ce processus d’apprentissage et étendre l’utilisation de l’imagerie en direct parmi les laboratoires, nous avons assemblé un protocole vidéo (Figure 2) qui rassemble les compétences nécessaires pour effectuer une imagerie en direct sur des embryons de souris en phase gastrulée.

figure-introduction-1
Figure 1 : Différenciation précoce des cellules progénitrices cardiaques dans l’embryon de souris depuis le début de la gastrulation jusqu’au stade précédant la formation primitive du tube cardiaque. Les cellules progénitrices cardiaques pénètrent dans le mésoderme peu après le début de la gastrulation, migrant vers le côté opposé de l’embryon. Le stade morphologique et le stade embryonnaire du jour (E) sont écrits au-dessus des diagrammes. Les flèches pointillées représentent la trajectoire de migration des progéniteurs primitifs du tube cardiaque pendant la gastrulation. Ce chiffre a été adapté de11. Abréviations : ES = Early Streak; MS = Traînée moyenne; EHF = pli précoce de la tête. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Diagramme de flux de travail pour l’imagerie en direct des premiers progéniteurs cardiaques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale du CNIC, par la Communauté de Madrid (référence PROEX 220/15) et conformes à la directive européenne 2010/63UE et à la recommandation 2007/526/CE concernant la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales et à d’autres fins scientifiques, appliquées dans la loi espagnole en vertu du Real Decreto 1201/2005.

Ce protocole comprend l’utilisation de deux mâles de la lignée de souris transgéniques fluorescentes signalant l’activité de NOTCH Tg(CBF:H2BVenus,+)18. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les matériaux, les animaux et l’équipement utilisés dans ce protocole.

1. Personnalisation des outils et des supports

  1. Couper des morceaux de fil de tungstène de 1 cm de long et les affûter à un diamètre de 0,02 à 0,05 mm en utilisant l’une des méthodes simples disponibles, par exemple, en immergeant la pointe du fil dans une solution saturée de nitrite de sodium19.
  2. Préparez les capillaires en verre coudé.
    1. Placez le point médian d’un capillaire en verre standard de 1,0 mm sur un briquet Bunsen pendant 3 à 6 s, en tirant lentement des deux extrémités jusqu’à ce que le capillaire devienne mince et flexible. À ce stade, cassez le capillaire en deux et chauffez-le brièvement pour produire une courbure à 90° à 2 cm de la pointe.
  3. Scie un morceau de polyméthacrylate de méthyle mesurant environ 7 mm de long, 4 mm de large et 2 mm d’épaisseur (figure 3D).
    REMARQUE : Les feuilles de polyméthacrylate de méthyle peuvent être obtenues à partir d’équipement de laboratoire recyclé ou commandées neuves.
  4. Tenez le morceau de méthacrylate à l’aide d’un étau de banc. Ensuite, percez des trous de taille personnalisée transversalement sur toute la pièce (Figure 3D).
    REMARQUE: En règle générale, les embryons de souris E6.5 à E7.5 nécessitent l’utilisation de perceuses de 0,2 à 0,5 mm de diamètre.
    1. Faites pivoter la perceuse lentement tout en appliquant une pression faible mais constante. Si une perceuse se brise à l’intérieur du support, jetez la pièce, car le métal ne peut pas être retiré.
  5. Utilisez une lime fine pour lisser les bords du support et ajuster sa taille. De plus, créez une pente douce sur les bords du support pour faciliter le positionnement de l’embryon (Figure 3D).
  6. Placez le support fini dans un plat avec de l’eau distillée pour le rincer.
  7. Vérifiez le support sous le stéréomicroscope pour voir si les trous contiennent de la poussière de forage. Si de la poussière est présente, utilisez des aiguilles en tungstène pour l’enlever.
  8. Pour stériliser le support, placez-le dans un tube conique rempli d’eau distillée et sonicez-le pendant 20 minutes avec une puissance de sortie minimale de 20 W.

2. Préparation des médias

  1. Pour inactiver thermiquement le système du complément, laissez deux aliquotes de 500 μL de sérum de 20 rats commercial ou fait maison à 56 °C pendant30 min.
    NOTE: Pour un protocole détaillé sur la façon de préparer le sérum de rat, voir21.
  2. Dans une hotte de culture cellulaire, préparer deux aliquotes du milieu pour la culture des embryons au microscope. Pour chacun, mélanger 490 μL de DMEM pour l’imagerie de cellules vivantes, 500 μL de sérum de rat inactivé et 10 μL de pénicilline-streptomycine pour obtenir une concentration finale de 50 μg/mL de pénicilline et de 50 μg/mL de streptomycine22.
    NOTE: Le volume de milieu de culture dépend du temps et du nombre d’embryons à cultiver. En règle générale, une croissance optimale nécessite un minimum de 200 μL par embryon et par jour chez les embryons E7.0.
  3. À l’aide d’une seringue de 2 mL, filtrer le milieu à travers un filtre à membrane de 0,22 μm de la taille des pores dans un nouveau tube et le placer ouvert dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 7 % de CO2 pendant 1 h avant la culture embryonnaire23.
  4. Préparer le milieu de dissection en ajoutant à un flacon de 500 mL de DMEM complété par une bouteille de L-glutamine : 50 mL de sérum bovin fœtal, 10 mL de HEPES-NaOH 25 mM (pH 7,2) et 10 mL de pénicilline et de streptomycine (50 mg/mL).
  5. Ensuite, séparez-le en aliquotes de 50 mL, placez trois aliquotes dans un bain à 37 °C et conservez le reste à 4 °C jusqu’à 3 mois.

3. Dissection embryonnaire

  1. Euthanasier une souris enceinte E6.75-E7.5.
  2. Extrayez l’utérus et placez-le sur une lingette en papier sèche et propre. Ensuite, coupez l’utérus, en insérant la pointe de ciseaux fins du côté mésométrial et en faisant glisser la lame pour exposer les décidues et les transférer dans le milieu de dissection. Pour un protocole détaillé, voir24.
  3. Disséquer les embryons en gardant intact le cône ectoplacentaire (Figure 3A,B). Pour une méthode de dissection détaillée, voir25.
  4. Ensuite, décollez la membrane de Reichert, en laissant une partie sur la région extraembryonnaire (Figure 3B).
    REMARQUE: Des pinces fines sont essentielles pour cette étape. Les utilisateurs inexpérimentés peuvent disséquer des embryons sur des plats enrobés de gel d’agarose à 2 % pour éviter de plier les pointes des pinces contre la surface de la boîte (Figure 3C).
  5. Pour garder le milieu de dissection chaud, remplacez-le toutes les 10 minutes. De plus, disséquer les décidues par groupes de 3-4 tout en conservant le reste dans un milieu de dissection placé dans un bain à 37 °C. Placer immédiatement les embryons disséqués dans un milieu de culture.
  6. Sélectionnez les embryons présentant les caractéristiques de fluorescence souhaitées à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence et placez-les dans le tube contenant le milieu de culture dans l’incubateur de culture cellulaire.
  7. Si les embryons sont aux stades E6.5 à E7.0, fermez le couvercle et laissez les embryons récupérer pendant 2 heures avant l’imagerie.
    REMARQUE: Les embryons E6.5 à E7.0 sont sensibles. Ils peuvent également être placés directement sous le microscope, mais la préculture permet de sélectionner ceux qui se rétablissent le mieux de la dissection, ce qui augmente les chances de succès.

4. Préparation du microscope

  1. Allumez tous les composants du microscope, y compris les lasers, l’ordinateur et les logiciels. Allumez les régulateurs de température et réglez à 37 °C 3 h à l’avance pour assurer l’équilibre.
  2. Si vous utilisez un objectif de détection par immersion, nettoyez-le à l’aide d’une lingette jetable sans résidus. Trempez la pointe de l’objectif dans de l’eau bidistillée à l’aide d’un plat de 60 mm et laissez-la jusqu’au début de l’acquisition.
  3. Allumez le contrôleur de CO2 et réglez-le sur 7%.
  4. Placez une goutte de graisse de silicium sous vide poussé sur un plat de 35 mm avec un fond en verre (14 mm de diamètre), placez le support sur le dessus de la goutte et appuyez doucement pour l’immobiliser.
  5. Sous un stéréomicroscope, ajouter le milieu de culture pour remplir la partie en verre du plat. Ce faisant, dirigez le flux vers les trous du support pour éviter la formation de bulles d’air.
  6. Si les bulles restent, utilisez le capillaire en verre préparé à l’étape 1.2, relié à un tube en silicone avec un embout buccal, pour aspirer doucement les bulles.
    REMARQUE: L’extrémité coudée du capillaire facilitera l’accès par les trous.

5. Montage d’embryons

  1. Transférez 2-3 embryons qui ont été laissés à récupérer dans l’incubateur dans le plat avec le porteur. Laissez le reste dans l’incubateur comme sauvegarde.
  2. Placez les embryons dans les trous à l’aide d’une paire de pinces et d’une aiguille en tungstène effilée. Utilisez l’aiguille pour accrocher l’embryon par le cône ectoplacentaire et insérez-le dans un trou de taille correspondante. Pour immobiliser l’embryon, faites pivoter le cône de 90 à 120° afin que la membrane de Reichter adhère aux parois du trou (Figure 3C). Pour une autre description, voir26.
  3. Déplacez délicatement la capsule contenant les embryons et le support sur la plaque de microscope (Figure 3F,G).
    REMARQUE: S’il n’est pas déplacé régulièrement, l’embryon peut sortir du support.
  4. Abaisser l’objectif jusqu’à ce qu’un ménisque liquide se forme à l’interface moyen-objectif.
  5. Localisez l’embryon à l’aide de la lumière transmise sous la jumelle du microscope et placez l’embryon au point.
  6. Montez la chambre d’incubation et scellez-la autour de l’objectif à l’aide de ruban adhésif (Figure 3F).
  7. À l’aide d’une capture en direct au logiciel de contrôle du microscope, ajustez les niveaux de sortie laser et de gain.
    REMARQUE : Pour l’acquisition à deux photons de la protéine fluorescente verte (GFP) et des rapporteurs Tdtomato, une puissance laser de sortie de 30 % à 980 nm et un gain de 70 % sur des détecteurs non numérisés ont été utilisés dans ce protocole (Figure 3G).
  8. Pour éviter l’évaporation, recouvrez le milieu d’huile de paraffine en l’égoutter lentement sur l’objectif.
    REMARQUE: C’est le dernier point où des embryons supplémentaires peuvent être montés dans le support. Une fois recouvert d’huile de paraffine, il faudrait nettoyer le support et remplacer le milieu pour le faire. Pour d’autres méthodes de montage, voir27.

6. Acquisition d’images

  1. Configurez l’enregistrement accéléré. Définissez un intervalle de temps de 5 à 10 minutes avec un espace z de 3 à 5 μm entre les piles. Laissez un espace vide au-dessus de la pile z pour anticiper la croissance de l’embryon, un minimum de 50 μm, en ajoutant 30 μm pour chaque heure où l’acquisition ne sera pas supervisée.
  2. Si disponible, activez l’option Enregistrement automatique pour permettre la supervision de l’acquisition à partir d’un ordinateur personnel afin de permettre l’ajustement de la taille de la pile z, si nécessaire, pour l’adapter à la zone d’intérêt dans le focus.

figure-protocol-1
Figure 3 : Outils d’imagerie en direct et configuration. (A) Dissection d’embryons de souris avec une boîte enrobée d’agarose au stéréomicroscope. (B) Schéma des étapes de dissection des embryons de souris pour l’imagerie vivante. C) Positionnement de l’embryon dans le porteur. D) Conception et caractéristiques du porte-embryons. (F) Chambre d’incubateur autour de l’objectif d’immersion. (G) Schéma de la configuration finale pour l’acquisition en accéléré. Barre d’échelle = 500 μm (A). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Résultats

Nous avons utilisé le protocole pour visualiser l’activation de la signalisation NOTCH chez les progéniteurs cardiaques précoces sur le point de se différencier en cellules endothéliales au cours de la morphogenèse primitive du tube cardiaque. Pour cela, nous avons croisé des souris C57BL / 6-N de type sauvage avec des souris Tg (CBF: H2BVenus, +)18 pour obtenir des embryons signalant une activité NOTCH via la protéine fluorescente jaune Vénus. À E7.5, la fluorescence de Vénus est présente dans to...

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Discussion

Les premiers progéniteurs cardiaques s’organisent dans un tube cardiaque primitif qui commence à battre alors qu’il est encore en formation. Comprendre comment ce processus se déroule est essentiel pour identifier le large spectre des malformations cardiaques congénitales à des événements morphogénétiques spécifiques. Pour cela, l’imagerie en direct offre la possibilité d’étudier le développement embryonnaire normal et défectueux avec une résolution temporelle accrue. Ceci est particulièrement utile pour étudier les cell...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Kenzo Ivanovitch pour ses travaux antérieurs sur cette méthode et le groupe du Dr Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Japon) pour avoir fourni l’expertise initiale sur le montage d’embryons. Cette étude a été soutenue par la subvention PGC2018-096486-B-I00 du ministère espagnol de la Ciencia e Innovación et la subvention H2020-MSCA-ITN-2016-722427 du programme Horizon 2020 de l’UE à MT et la subvention 1380918 du programme opérationnel FEDER Andalucía 2014-2020 à JND. MS a été soutenu par une bourse de doctorat de la Fondation La Caixa (LCF / BQ / DE18 / 11670014) et la bourse de voyage de la Compagnie des biologistes (DEVTF181145). Le CNIC est soutenu par le ministère espagnol des Sciences et la Fondation ProCNIC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
#55 PinceDumont  ;11295-51
Plat de 35 mm avec fond de lamelle en verre 14 mm de diamètreMattekP35G-1.5-14-C
Table d’étau de 35 mm  ;GrandadoSKU 8798771617573 Tubes de
50 mLBD Falcon352070
Eau
DMEM - Dulbecco’s Modified EagleMedium Gibco11966025  ; avec L-Glutamine, sans glucose, sans Na Pyruvate
Sérum fœtalbovin Invitrogen10438-026
Souris transgéniques rapporteures fluorescentes (Tg(CBF :H2BVenus,+)  ;JAX
Fluorobrite DMEMThermoFisherA1896701DMEM pour l’imagerie de cellules vivantes
Graisse silicone sous vide pousséDow CorningZ273554-1EA
Support pour filsPerlen Pressenpwb1
LSM 780 Microscope droitZeiss  ;
Détecteur laser pulsé rouge lointain MaiTai Deepsee réglé à 980 nmDétecteurs Spectra-Physics
Non Descanned équipés des ensembles de filtres
jaune cyan (BP450-500/BP520-560), vert-rouge (BP500-520/BP570-610) et jaune-rouge (BP520-560/BP645-710)		Zeiss  ;
Obj : 20x trempage dans l’eau 1.0 NA, longue distance de travail
P1000 et P200
Huile de paraffineNidaconVNI0049
Pénicilline-streptomycineInvitrogen15070-063(la concentration finale doit être de 50 &mu ; g/mL de pénicilline et 50 &mu ; g/mL streptomycine)
Boîtes de Pétri 35 mm x 10 mmBD Falcon351008
Pointes
Polyméthacrylate de méthyle  ;Réutilisé à partir d’anciens équipements de laboratoire
Rat Culture de sérum, embryon, rats mâles SPRAGUE DAWLEY RjHan SDJanvier Labs9979
Set de fines de 160 mmRS PRO541-6933
Capillaires en verre standard de 1,0 mmAnima Lab  ; 1B100F-3
Stérile 0,22 &mu ; Filtre à seringue Corning431218
Seringue stérile de 5 mLFisher Scientific15809152
Aiguilles en tungstène
à ultrasons (sonicateur)BandelinBASO_17021
distilléePipettes de pipette Homogénéisateur

Références

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