L’amplification du signal tyramide lors de la coloration par immunofluorescence permet la détection sensible de RIPK3 et MLKL phosphorylés lors de la nécroptose induite par ZBP1 après une infection à HSV-1.
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Article de méthode
Amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL après infection à HSV-1 dans des cellules humaines
Dans cet article
Résumé
Résumé
La kinase RIPK3 (RIPK3) qui interagit avec le récepteur de la kinase et son substrat mixte de type domaine kinase (MLKL) sont des régulateurs essentiels de la nécroptose, une forme inflammatoire de mort cellulaire ayant d’importantes fonctions antivirales. L’autophosphorylation de RIPK3 induit la phosphorylation et l’activation de la protéine bourreau formant les pores de la nécroptose MLKL. Le trafic et l’oligomérisation du MLKL phosphorylé au niveau de la membrane cellulaire entraînent une lyse cellulaire, caractéristique de la mort cellulaire nécroptotique. Le capteur d’acide nucléique ZBP1 est activé en se liant à l’ARN double brin (ARN-Z) gaucher de forme Z après infection par des virus à ARN et à ADN. L’activation de ZBP1 limite l’infection virale en induisant la mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose, des cellules hôtes infectées. La microscopie par immunofluorescence permet de visualiser différentes étapes de signalisation en aval de la nécroptose médiée par ZBP1 sur une base cellulaire. Cependant, la sensibilité de la microscopie à fluorescence standard, utilisant actuellement des anticorps phospho-spécifiques disponibles dans le commerce contre RIPK3 et MLKL humains, empêche l’imagerie reproductible de ces marqueurs. Ici, nous décrivons une procédure de coloration optimisée pour la sérine (S) phosphorylée RIPK3 (S227) et MLKL (S358) dans les cellules humaines HT-29 infectées par le virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1). L’inclusion d’une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) dans le protocole de coloration immunofluorescente permet la détection spécifique de S227 phosphorylé RIPK3. De plus, la TSA augmente considérablement la sensibilité de la détection de MLKL phosphorylé S358. Ensemble, cette méthode permet de visualiser ces deux événements de signalisation critiques lors de l’induction de la nécroptose induite par ZBP1.
Introduction
La protéine kinase 3 sérine/thréonine interagissant avec les récepteurs (RIPK3) et le domaine mixte de la kinase de lignée (MLKL) sont des régulateurs centraux de la mort cellulaire nécroptotique 1,2. La nécroptose est une forme lytique et inflammatoire de mort cellulaire régulée impliquée dans l’immunité antivirale et l’autoinflammation. La nécroptose des cellules infectées par le virus arrête immédiatement la réplication du virus. La lyse cellulaire après induction de la nécroptose libère également des schémas moléculaires associés aux dommages, qui stimulent l’immunité antivirale
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Protocole
1. Préparation du tyramide biotinylé
- Préparer du tyramide biotinylé à partir de biotine-tyramide. Pour faire une solution mère de 10 mM, dissoudre 3,6 mg de biotine-tyramide dans 1 mL de DMSO. Conserver le produit dissous dans des aliquotes à −20 °C pour en préserver la qualité.
2. Maintenir les cellules HT-29 en culture
NOTE: Les HT-29 exprimant ZBP1 ont été générés par transduction avec un lentivecteur27 codant pour ZBP1 humain.
- Conservez les cellules HT-29 exprimant ZBP1 dans le milieu 5A de McCoy supplémenté en L-glutamine, en....
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Résultats
La détection par immunofluorescence de la phosphorylation MLKL et en particulier de la phosphorylation RIPK3 dans les cellules humaines est techniquement difficile26. Nous présentons ici un protocole de coloration amélioré pour p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) humains lors de l’activation de ZBP1. Le protocole comprend une étape TSA pour améliorer la limite de détection et la sensibilité des signaux fluorescents. Pour valider la méthode, une comparaison côte à côte de l’immunofluorescence médiée pa.......
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Discussion
Ce protocole de coloration immunofluorescente décrit l’utilisation de l’amplification du signal tyramide (TSA) pour augmenter la sensibilité aux événements de signalisation de la voie de signalisation nécroptotique humaine qui sont difficiles à détecter, y compris la phosphorylation de RIPK3 et MLKL26. L’inclusion d’une étape TSA améliore considérablement le seuil de détection de p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) et augmente la sensibilité de la contrainte p-MLKL (S358). La TSA a révélé un signal p-.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier le VIB Bioimaging Core pour la formation, le soutien et l’accès au parc d’instruments. J.N. est soutenu par une bourse de doctorat de la Fondation pour la recherche de Flandre (FWO). La recherche dans le groupe J.M. a été soutenue par une bourse Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), une subvention de recherche junior (G031022N) de la Fondation de recherche Flanders (FWO), une bourse de preuve de concept pour jeunes chercheurs du CRIG et par l’Université de Gand. La recherche dans le groupe P.V. a été soutenue par EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A932....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Anticorps > | |||
| anti-lapin HRP | Agilent Technologies Belgique | K4002 | Envision+ System-HRP Labellisé Polymère anti-lapin |
| Chèvre anti-souris DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Anticorps sécundary |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Anticorps |
| anti-ICP0(HSV-1) de sourisSérum de souris IAV-PR8 | Production en interne | xx | Anticorps polyclonal anti-IAV-PR8 |
| de souris pMLKL | Abcam | ab187091 | Anticorps anti-MLKL-phospho S358 de lapin |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Anticorps anti-RIPK3-phospho S227 de lapin |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | Visualiser le noyau des cellules |
| Streptavidine couplée à Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | Pour visualiser les molécules de biotine |
| Composations | |||
| 30 % H2O2 | Sigma | H1009 | Substrat oxydant, nécessaire à l’activité HRP |
| 4 % PFA | SANBIO | AR1068 | Pour fixer/réticuler les cellules |
| Biotinyl-tyramide | R& D Systems | 6241 | Pour amplifier le signal, substrat HRP |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 Inhibiteur de l’IAP |
| ; ; | ; ; | ; ; | Pour la culture cellulaire : pour détacher les cellules |
| ; ; | ; ; | ; ; | 8,0 g/L de NaCl |
| ; ; | ; ; | ; ; | 0,4 g/L de sel disodique d’EDTA |
| EDTA 0,04 % | Formulation | 1,1 g/L de Na2HPO4 | |
| ; | ; ; | ; ; | 0,2 g/L de NaH2PO4 |
| ; ; | ; ; | ; ; | 0,2 g/L de KCl |
| ; ; | ; ; | ; ; | 0,2 g/L de glucose |
| Sérum fœtal bovin | TICO | FBS EU XXX | Pour la culture cellulaire, maintien de la culture cellulaire ; numéro de lot : 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 inhibiteur de kinase |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | Pour la culture cellulaire, maintien de la culture cellulaire |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Solution bloquante |
| PBS | Gibco | ||
| Pyruvate de sodium | Sigma-Aldrich | S8636 | Pour la culture cellulaire, le maintien de la culture cellulaire |
| TNF-&alpha ; | Production en | interne-Molécule | de signalisation, capable de déclencher la mort cellulaire en combinaison avec BV6 et zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | Pour perméabiliser les cellules |
| Trypan blue | Merck | 11732 | Pour le comptage cellulaire, utilisé comme marqueur vivant/mort à 0,1 % |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | Pour la culture cellulaire : pour détacher les cellules |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ ;-Slide 8 puits haut fond de verre | iBidi | 80807 | Pour cultiver les cellules |
| Coton Boules de présage-taille moyenne | Microscopie électronique Sciences | 71001-10 | Pour nettoyer les objectifs |
| Immersol 518 F/30 ° ; C | ZEISS | 444970-9000-000 | Pour visualiser l’échantillon à fort grossissement |
| Nettoyeur d’objectif | ZEISS | 000000-0105-200 | Pour nettoyer les objectifs |
| LSM880 Microscope | Pour visualiser l’échantillon | ||
| Software | |||
| Excel | Office xx | Pour traiter les données | |
| Prism 9 | Graphpad | xx | Pour analyser les données- tests statistiques et génération de graphiques |
| Volocité 6.3 | Volocité | xx | Pour effectuer des quantifications |
| Zen noir | ZEISS | xx | Pour acquérir et traiter des images |
| Zen bleu | ZEISS | xx | Pour visualiser des images |
| Virus | |||
| la souche F du HSV-1 (mutRHIM) | produite par le Dr Jiahuai Han | dans la réplication interne | du HSV-1 comme déclencheur de nécroptose ; Le domaine central RHIM d’UL39/ICP6 est muté (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) souche F | produite par le Dr Jiahuai Han | dans la réplication en maison | HSV-1 (WT) en tant que contrôle négatif pour l’induction de la nécroptose (inhibition de l’ICP6) |
| IAV PR8 | dans le stock domestique | en réplication interne | IAV comme déclencheur de nécroptose |
Références
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic c....
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Réimpressions et autorisations
