Summary
L’amplification du signal tyramide lors de la coloration par immunofluorescence permet la détection sensible de RIPK3 et MLKL phosphorylés lors de la nécroptose induite par ZBP1 après une infection à HSV-1.
Abstract
La kinase RIPK3 (RIPK3) qui interagit avec le récepteur de la kinase et son substrat mixte de type domaine kinase (MLKL) sont des régulateurs essentiels de la nécroptose, une forme inflammatoire de mort cellulaire ayant d’importantes fonctions antivirales. L’autophosphorylation de RIPK3 induit la phosphorylation et l’activation de la protéine bourreau formant les pores de la nécroptose MLKL. Le trafic et l’oligomérisation du MLKL phosphorylé au niveau de la membrane cellulaire entraînent une lyse cellulaire, caractéristique de la mort cellulaire nécroptotique. Le capteur d’acide nucléique ZBP1 est activé en se liant à l’ARN double brin (ARN-Z) gaucher de forme Z après infection par des virus à ARN et à ADN. L’activation de ZBP1 limite l’infection virale en induisant la mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose, des cellules hôtes infectées. La microscopie par immunofluorescence permet de visualiser différentes étapes de signalisation en aval de la nécroptose médiée par ZBP1 sur une base cellulaire. Cependant, la sensibilité de la microscopie à fluorescence standard, utilisant actuellement des anticorps phospho-spécifiques disponibles dans le commerce contre RIPK3 et MLKL humains, empêche l’imagerie reproductible de ces marqueurs. Ici, nous décrivons une procédure de coloration optimisée pour la sérine (S) phosphorylée RIPK3 (S227) et MLKL (S358) dans les cellules humaines HT-29 infectées par le virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1). L’inclusion d’une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) dans le protocole de coloration immunofluorescente permet la détection spécifique de S227 phosphorylé RIPK3. De plus, la TSA augmente considérablement la sensibilité de la détection de MLKL phosphorylé S358. Ensemble, cette méthode permet de visualiser ces deux événements de signalisation critiques lors de l’induction de la nécroptose induite par ZBP1.
Introduction
La protéine kinase 3 sérine/thréonine interagissant avec les récepteurs (RIPK3) et le domaine mixte de la kinase de lignée (MLKL) sont des régulateurs centraux de la mort cellulaire nécroptotique 1,2. La nécroptose est une forme lytique et inflammatoire de mort cellulaire régulée impliquée dans l’immunité antivirale et l’autoinflammation. La nécroptose des cellules infectées par le virus arrête immédiatement la réplication du virus. La lyse cellulaire après induction de la nécroptose libère également des schémas moléculaires associés aux dommages, qui stimulent l’immunité antivirale 3,4. La nécroptose est initiée par l’activation de RIPK3 à la suite d’interactions médiées par le motif d’interaction homotypique (RHIM) RIP avec l’une des trois molécules activatrices en amont : RIPK1 (lors de l’engagement du récepteur TNF 1 [TNFR1]), l’interféron-β induisant un adaptateur contenant le domaine TIR (TRIF; lors de l’engagement des récepteurs de type Toll 3 et 4), ou le capteur d’acide nucléique antiviral Protéine de liaison à l’ADN-Z 1 (ZBP1)1,2 . La signalisation de la nécroptose se déroule par une série d’événements de phosphorylation commençant par l’autophosphorylation de RIPK3. L’autophosphorylation de RIPK3 humain à la sérine (S)227 à l’intérieur de son domaine kinase est une condition préalable à la nécroptose en permettant l’interaction avec MLKL et est couramment utilisée comme marqueur biochimique de l’activation humaine de RIPK3 et de la mort cellulaire nécroptotique 1,5. Une fois activé, RIPK3 phosphoryle la boucle d’activation de MLKL à la thréonine (T)357 et S3581. Cela provoque une modification de la conformation MLKL, entraînant une exposition du domaine du faisceau à quatre hélices N-terminal. MLKL s’oligomérise ensuite et se dirige vers la membrane cellulaire où il forme un pore par l’insertion des quatre faisceaux hélicoïdaux exposés dans la bicouche lipidique, conduisant finalement à la mort cellulaire 2,6.
ZBP1 est un capteur d’acide nucléique antiviral qui reconnaît les acides nucléiques gauchers de forme Z, y compris l’ARN double brin dans la conformation Z (ARN-Z). La liaison de l’ARN-Z se produit via deux domaines Zα positionnés à l’extrémité N de ZBP1. On pense que l’ARN-Z s’accumulant lors de l’infection par l’ARN et le virus de l’ADN engage directement ZBP1 7,8. ZBP1 activé recrute RIPK3 par le biais de ses RHIM centraux et induit une mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose 9,10. Les virus ont adopté de nombreux mécanismes d’échappement pour contrer la nécroptose de la cellule hôte induite par ZBP11. Par exemple, la sous-unité 1 de la ribonucléotide réductase du virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1), connue sous le nom de ICP6 et codée par UL39, héberge RHIM à son extrémité N qui interfère avec l’activation de RIPK3 médiée par ZBP1 dans les cellules humaines12,13,14,15. ZBP1 non seulement restreint la réplication virale, mais des études sur la souris ont montré que l’activation de ZBP1 provoque des maladies inflammatoires et stimule l’immunité contre le cancer 16,17,18,19,20,21. Les protocoles qui détectent les événements de signalisation se produisant pendant la nécroptose induite par ZBP1 dans les cellules humaines sont donc utiles pour évaluer le rôle de ZBP1 dans ces processus.
L’amplification du signal tyramide (TSA), également appelée dépôt de rapporteur catalysé (CARD), a été développée pour améliorer la limite de détection et le rapport signal sur bruit dans les immunoessais à base d’anticorps. Au cours de la TSA, n’importe quel anticorps primaire peut être utilisé pour détecter l’antigène d’intérêt. La peroxydase de raifort (HRP), couplée à un anticorps secondaire, catalyse l’accumulation locale de radicaux tyramide biotinylés en présence de peroxyde d’hydrogène. Ces radicaux biotine-tyramide activés réagissent ensuite avec les résidus de tyrosine proximale pour former des liaisons covalentes. Les substrats potentiels tyramide-biotine comprennent l’antigène lui-même, les anticorps primaires et secondaires et les protéines voisines. Ainsi, alors que la TSA améliore considérablement la sensibilité du test, une partie de sa résolution spatiale est perdue. Dans une dernière étape, les molécules de biotine sont détectées à l’aide de streptavidine marquée par fluorescence. La réaction HRP dépose de nombreuses molécules de tyramide-biotine sur ou à proximité de l’antigène d’intérêt. Cela augmente considérablement le nombre de sites de liaison streptavidine-fluorochrome, amplifiant ainsi considérablement la sensibilité du test (Figure 1). Alternativement, le tyramide peut être directement couplé à un fluorochrome, éliminant ainsi le besoin de fluorophores couplés à la streptavidine. L’immunohistochimie des protéines et l’hybridation in situ ADN/ARN ont été parmi les premières méthodes par lesquelles la TSA a été utilisée pour améliorer l’intensité du signal22,23. Plus récemment, la TSA a été combinée avec la cytométrie de flux intracellulaire24 et la spectrométriede masse 25.
Ici, nous présentons un protocole pour détecter la sérine 227 humaine phosphorylée RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) et la MLKL humaine phosphorylée (p-MLKL [S358]) lors de l’activation de ZBP1 par infection à HSV-1 par microscopie d’immunofluorescence. Nous utilisons une lignée cellulaire d’adénocarcinome colorectal humain HT-29 sensible à la nécroptose qui a été transduite pour exprimer de manière stable ZBP1 humain. Ces cellules ont été infectées par une souche HSV-1 exprimant une protéine mutante ICP6 (HSV-1ICP6 mutRHIM) dans laquelle quatre acides aminés centraux du RHIM viral (VQCG) ont été remplacés par des alanines (AAAA), rendant ainsi l’ICP6 incapable de bloquer la nécroptose médiée par ZBP113,14,15. Pour surmonter le problème du faible rapport signal/bruit des anticorps actuellement disponibles dans le commerce dirigés contre p-RIPK3 et p-MLKL dans l’immunomarquage26, nous effectuons une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) (Figure 1), qui se traduit par une détection robuste de p-RIPK3 humain (S227) et améliore la sensibilité de détection du p-MLKL humain (S358) d’un ordre de grandeur.
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Protocol
1. Préparation du tyramide biotinylé
- Préparer du tyramide biotinylé à partir de biotine-tyramide. Pour faire une solution mère de 10 mM, dissoudre 3,6 mg de biotine-tyramide dans 1 mL de DMSO. Conserver le produit dissous dans des aliquotes à −20 °C pour en préserver la qualité.
2. Maintenir les cellules HT-29 en culture
NOTE: Les HT-29 exprimant ZBP1 ont été générés par transduction avec un lentivecteur27 codant pour ZBP1 humain.
- Conservez les cellules HT-29 exprimant ZBP1 dans le milieu 5A de McCoy supplémenté en L-glutamine, en pyruvate de sodium et en sérum bovin fœtal à 10 % (désormais appelé milieu complet) et maintenez-les dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone. Idéalement, utilisez des cellules d’un faible nombre de passages (moins de 10). Laissez les cellules récupérer pendant au moins 5 jours après le cycle de dégel avant le début de l’expérience.
- Pour détacher les cellules du ballon de culture, retirer le milieu et laver les cellules avec 5 mL de PBS (préchauffé à 37 °C). Ensuite, ajouter la quantité appropriée de trypsine/EDTA (0,05 % de trypsine et 0,032 % d’EDTA, respectivement, préchauffées à 37 °C) aux cellules (2 mL pour une fiole T75, 3 mL pour une fiole T175).
- Incuber les cellules avec de la trypsine/EDTA jusqu’à 10 min dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, tapotez la fiole et vérifiez visuellement si les cellules se sont détachées du ballon à l’aide d’un microscope avec un grossissement d’objectif 4x-20x.
- Si les cellules ne sont pas complètement détachées, incuber encore 5 minutes à 37 °C. Lorsque les cellules sont détachées, arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 6 mL de milieu complet dans le flacon.
- Rassemblez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL. Compter les cellules à l’aide d’une coloration bleu trypan pour évaluer la viabilité; Une dilution de 1:5 est recommandée. Ne poursuivez l’expérience que si la viabilité des cellules dépasse 90%.
3. Début de l’expérience, ensemencement et stimulation des cellules
- Ensemencer 90 000 cellules HT-29 exprimant ZBP1 en milieu complet dans une plaque de puits de 1 cm² de surface qui permet une microscopie haut de gamme. Utiliser un volume final de 200 μL par puits.
- Incuber les cellules pendant une nuit à 37 °C avec du dioxyde de carbone à 5%. Tenez compte du fait que certains puits supplémentaires doivent être ensemencés pour les contrôles de coloration, ce qui est expliqué plus en détail à l’étape 5.6.
- Lorsque les cellules atteignent 70% à 80% de confluence, ajoutez un stimulus induisant la nécroptose aux cellules. Ici, les cellules ont été infectées par HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicité de l’infection [MOI] de 5, définie comme des unités formant des plaques (pfu) divisée par le nombre de cellules; le pfu a été quantifié à l’aide d’un test de plaque sur des cellules Vero) pendant 6 h, 8 h ou 10 h.
- Comme témoin positif de l’induction de la nécroptose, stimuler les cellules pendant 4 h avec un cocktail induisant la nécroptose contenant 30 ng / mL de TNF, 20 μM de l’inhibiteur de pan-caspase zVAD-fmk et 5 μM du mimétique SMAC BV6.
- Comme témoin négatif pour la coloration p-RIPK3 (S227), inclure GSK'840 (1 μM) pour inhiber l’activité de la kinase RIPK3 et empêcher l’autophosphorylation de S227. Idéalement, ajoutez l’inhibiteur dans une condition non traitée et après la stimulation de la nécroptose. L’inhibiteur peut être ajouté simultanément avec une infection virale.
- Préparer les stimulations à feu moyen, préchauffé à 37 °C. Utilisez un volume final de 200 μL par puits pour toutes les stimulations.
4. Fixation des cellules
- Retirez le milieu et lavez les cellules avec 200 μL de 1x PBS. Ensuite, ajoutez 150 μL de PFA à 4% (déjà équilibré à température ambiante) aux cellules et incuber à température ambiante pendant 30 min.
REMARQUE: Si vous utilisez des cellules qui se détachent facilement, la fixation des cellules peut être optimisée comme suit. Retirer 100 μL de milieu du puits, de sorte qu’un volume de 100 μL reste sur la plaque. Ajouter 100 μL de PFA à 4% aux cellules. Incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, retirer le milieu/fixateur des puits et le remplacer par 150 μL de PFA à 4 %. Incuber les cellules pendant encore 20 minutes à température ambiante pour assurer une fixation complète des cellules. - Après la fixation, retirez le PFA à 4% et lavez les cellules 3x avec 200 μL de 1x PBS. Les échantillons peuvent être conservés dans un excès (>200 μL) de 1x PBS à 4 °C pendant une nuit jusqu’à un traitement ultérieur.
5. Perméabilisation et coloration primaire
- Retirez le PBS et ajoutez 100 μL de tampon de perméabilisation (0,5% Triton X-100 dans PBS). Incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Retirer le tampon de perméabilisation et, par la suite, laver les puits avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber la chambre d’imagerie avec tampon de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire inclinable (20-30 mouvements de bascule par min).
- Pour éviter la liaison non spécifique des anticorps primaires, ajouter 100 μL de milieu bloquant et incuber à température ambiante pendant 2 h. Alternativement, cette étape de blocage peut être remplacée par un blocage avec 3% de BSA, 0,1% de Triton-X-100 dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
- Laver les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
- Après avoir retiré le tampon de lavage, ajouter les anticorps primaires dans la chambre d’imagerie et incuber pendant une nuit à 4 °C. Utilisez un volume final de 100 μL pour couvrir le puits. Pendant la nuit d’incubation à 4 °C, ne placez pas la chambre d’imagerie sur un agitateur de laboratoire basculant.
NOTE: L’anti-p-MLKL (S358; dilution: 1:200) et l’anti-p-RIPK3 (S227; dilution: 1:200) partagent le lapin comme espèce hôte et ne doivent donc pas être combinés dans un seul puits. Pour surveiller l’infection virale, combinez un anticorps primaire contre une protéine virale de votre choix avec p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227). Ici, les cellules ont été infectées par une infection à HSV-1 suivie d’une coloration ICP0 (dilution: 1:50, espèce hôte: souris). - Prenez en considération les contrôles de coloration nécessaires à ce stade. Toujours inclure une condition d’absence d’anticorps primaire pour visualiser le contexte potentiel de l’étape d’amplification TSA pour définir le seuil de masquage (voir étape 9).
REMARQUE: Dans le cas d’un protocole de co-coloration (par exemple, combinant p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227] avec un anticorps contre une protéine virale), utilisez également des colorations simples. L’utilisation de colorations simples est importante pour corriger le signal de purge potentiel dans d’autres canaux d’imagerie.
6. Amplification du signal tyramide (TSA)
- Retirer le mélange d’anticorps primaires et laver les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
- Retirez le tampon de lavage et ajoutez 100 μL d’anticorps secondaire marqué HRP reconnaissant l’espèce d’anticorps primaire qui doit être amplifiée. Pour amplifier le signal p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), ajouter 100 μL d’anti-lapin-HRP et incuber pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
REMARQUE: Seuls p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227) seront amplifiés. La coloration d’une protéine virale sera visualisée à l’aide d’une méthode de coloration indirecte standard. - Ensuite, lavez les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
- Dans les étapes suivantes, ajoutez le tyramide biotinylé à la plaque microscopique. En utilisant le groupe HRP couplé aux anticorps secondaires, la réaction enzymatique déclenchera la formation de radicaux tyramide à proximité immédiate de la cible primaire (ici, p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227]).
- Pour activer l’activité enzymatique de HRP, ajoutez un substrat oxydant avec le tyramide biotinylé. Pour ce faire, compléter le tampon TSA (acide borique 0,1 M [pH 8,5]) avec 0,03 MH2O2; plus précisément, prendre 5 mL de tampon TSA et ajouter 5 μL de H 2 O2 à 30 %.
- Maintenant, diluez la biotine-tyramide dans un tampon TSA supplémenté enH2O2 allant de 1:1 000 à 1:20 000.
NOTE: Le facteur de dilution de la biotine-tyramide doit être optimisé par lot. - Retirer le tampon de lavage des puits et ajouter de la biotine-tyramide diluée dans les puits jusqu’à un volume final de 100 μL. Incuber à température ambiante pendant 10 min sur un agitateur de laboratoire basculant.
- Ensuite, lavez les puits 3x avec 100 μL de tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
7. Fluorophores
REMARQUE: Puisque le signal de l’anticorps primaire est converti en un groupe biotine, p-MLKL (S358) et p-RIPK3 (S227) sont visualisés à l’aide de streptavidine couplée à un fluorophore (fluorophore 568, dilution: 1:500). De plus, les noyaux sont colorés avec du DAPI (5 μg/mL). Si une protéine virale est incluse dans le protocole de coloration, incluez un anticorps secondaire marqué par fluorescence approprié contre l’espèce hôte de votre anticorps primaire. Dans les résultats représentatifs, un anti-ICP0 de souris a été utilisé. En tant qu’anticorps secondaire de chèvre, l’anti-souris couplé au fluorophore 633 (dilution: 1:1 000) a été inclus.
- Faire le mélange de coloration dans un tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS) contenant les anticorps et les taches mentionnés ci-dessus. Retirer le tampon de lavage, ajouter 100 μL de mélange de coloration et incuber à température ambiante pendant 1 h sur un agitateur de laboratoire basculant. Gardez la chambre d’imagerie à l’abri de la lumière à partir de cette étape.
- Ensuite, lavez les puits 2x avec un tampon de lavage (0,1% Triton X-100 dans PBS). Incuber les étapes de lavage pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.
- Enfin, rincez les puits 2x avec 1x PBS. Conservez les échantillons dans un excès (> 200 μL) de 1x PBS jusqu’à l’imagerie. Vous pouvez également immerger les échantillons dans un support de montage pour préserver la coloration. La chambre d’imagerie est maintenant prête à être visualisée au microscope confocal.
8. Imagerie au microscope confocal
- Allumez le microscope confocal et les lasers au moins 10 minutes avant l’imagerie.
- Utilisez un objectif d’immersion pour la sensibilité. De préférence, utilisez un grossissement d’objectif de 40x ou 63x. Avant l’imagerie, nettoyez les objectifs d’immersion avec un nettoyant pour lentilles à l’aide de boules de coton appropriées. Les objectifs sales (par exemple, à cause de la poussière) peuvent entraîner des images de qualité inférieure.
- Placez une quantité excessive d’huile au fond de la chambre d’imagerie. De plus, ajoutez une goutte d’huile sur l’objectif de choix.
- Placez la chambre d’imagerie sur le microscope. Recherchez le champ de mise au point à l’aide de la coloration DAPI ou de l’imagerie en fond clair. Si nécessaire, déplacez-vous autour de la chambre d’imagerie pour assurer une bonne propagation de l’huile d’immersion.
- Configurez les pistes d’imagerie nécessaires au microscope. Selon le microscope, les étapes suivantes peuvent varier (tableau 1).
REMARQUE: Lors de la configuration des pistes d’imagerie, programmez les pistes de sorte que la coloration nucléaire soit mesurée en dernier. Le laser 405 nm peut contribuer au photoblanchiment et, par conséquent, à la perte de signal spécifique dans tous les canaux. - Pour analyser une cellule complète pour détecter la présence de p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), mesurez les piles z qui couvrent la hauteur de la cellule. Ici, les piles z étaient constituées de 40 tranches tous les 0,16 μm, ce qui donnait une plage de 6,22 μm.
| Piste | Laser | Séparateur de faisceau | Filtre |
| pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) | 561 | MBS -405 + | BP 570-620 + LP645 |
| MBS 488/561/633 + SBS SP615 | |||
| Gène viral : ICP0 | 633 | MBS -405 + | BP 420-480 + LP605 |
| MBS 488/561/633 + SBS LP570 | |||
| Noyau: DAPI | 405 | MBS -405 + | BP 420-480 + BP 495-550 |
| MBS 488/561/633 |
Tableau 1 : Pistes d’imagerie pour la visualisation cellulaire.
9. Analyse et quantification des données
- Téléchargez les images microscopiques dans le logiciel. Utilisez la mise au point étendue pour visualiser toutes les informations de la pile z dans une image 2D.
- Ensuite, programmez le protocole d’analyse afin d’extraire les informations suivantes : le nombre de cellules par image, la somme des voxels montrant la coloration p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+. Un voxel représente un volume tridimensionnel, défini comme l’équivalent tridimensionnel d’un pixel.
- Pour quantifier le nombre de cellules par image, segmentez le noyau. Pour réduire le bruit dans les résultats de segmentation, ajoutez une limite de taille à la segmentation (>100 μm³). Le nombre de noyaux segmentés représente le nombre de cellules dans l’image.
- Pour quantifier la quantité de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+, programmez une segmentation par seuil. Réglez le seuil de sorte qu’aucun signal ne soit capté dans les images sans anticorps primaire (NP).
- Adaptez davantage le seuil en utilisant les images de la condition simulée non traitée. Pour assurer une détection sensible de l’augmentation du signal due à la stimulation de la nécroptose, limitez la captation des voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+ dans des conditions simulées en définissant un seuil plus élevé. Vérifiez toujours le protocole d’analyse programmée dans plusieurs images de la condition simulée et de l’infection virale induisant la nécroptose.
- Exécutez l’analyse sur tous les jeux d’images. Exportez la quantification voxel et la segmentation du noyau dans un fichier .txt pour un traitement ultérieur dans un tableur.
- Créez un tableau croisé dynamique des données indiquant le nom de l’image, la quantification du noyau et la somme des voxels détectés.
- Ensuite, divisez la somme des voxels positifs par le nombre de cellules dans l’image. Il en résulte une valeur relative de voxels positifs par cellule. Pour visualiser l’augmentation du pli, divisez la valeur relative de p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+ voxels par cellule par la médiane de la condition non traitée (simulée).
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Representative Results
La détection par immunofluorescence de la phosphorylation MLKL et en particulier de la phosphorylation RIPK3 dans les cellules humaines est techniquement difficile26. Nous présentons ici un protocole de coloration amélioré pour p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) humains lors de l’activation de ZBP1. Le protocole comprend une étape TSA pour améliorer la limite de détection et la sensibilité des signaux fluorescents. Pour valider la méthode, une comparaison côte à côte de l’immunofluorescence médiée par la TSA avec la coloration fluorescente indirecte standard de p-RIPK3 (S227) et de p-MLKL (S358) a été effectuée.
Les cellules HT-29 exprimant ZBP1 humain ont été infectées pendant 9 heures par une souche HSV-1 mutante ICP6 RHIM (HSV-1ICP6 mutRHIM) pour induire la nécroptose médiée par ZBP1 et la phosphorylation de RIPK3. La soucheHSV-1 ICP6 mutRHIM porte une mutation VQCG à AAAA dans le RHIM ICP6 et est incapable de bloquer la signalisation de la nécroptose en aval de ZBP114,15. Comme indiqué précédemment26, l’immunofluorescence indirecte standard n’était pas suffisamment sensible pour visualiser la phosphorylation de RIPK3 S227 avec l’anticorps actuellement disponible dans le commerce, même lorsque la puissance laser du microscope confocal était augmentée à 30% (Figure 2A). En revanche, l’inclusion d’une étape TSA a permis la détection robuste de p-RIPK3 (S227) dans le cytosol de cellules infectées par HSV-1 ICP6mutRHIM. Le signal p-RIPK3 (S227) a atteint sa saturation lorsque la puissance du laser a été réglée à 2 % (Figure 2A). La quantification des images tridimensionnelles de la pile z (voir étape 9) a montré une augmentation d’environ 20 fois du nombre de voxels positifs pour p-RIPK3 (S227) dans les cellules infectées par HSV-1ICP6 mutRHIM par rapport aux cellules simulées traitées (Figure 2B). L’omission de l’anticorps primaire anti-p-RIPK3 (S227) du protocole de coloration médié par la TSA en tant que contrôle sans primaire (NP) n’a pas donné de signal détectable. Pour visualiser les cellules infectées par HSV-1 ICP6mutRHIM, les échantillons ont été co-colorés avec un anticorps primaire dirigé contre la protéine virale précoce immédiate ICP0 (Figure 2A). Un signal p-RIPK3 (S227) faible mais détectable était présent dans les cellules simulées traitées, ce qui pourrait représenter l’autophosphorylation constitutive de RIPK3 humain sur ce site5 (voir la discussion). Conformément à un rapport précédent28, le RHIM de la CIP6 n’est pas en mesure de bloquer complètement la phosphorylation de RIPK3 S227, car nous avons détecté une coloration accrue de p-RIPK3 (S227) des cellules infectées par le HSV-1 de type sauvage (HSV-1WT; Figure 2A, B). Pour valider davantage la spécificité du signal p-RIPK3 (S227), les cellules ont été traitées avec l’inhibiteur de kinase RIPK3 GSK'840 avant l’infection. GSK'840 se lie au domaine kinase de RIPK3, empêchant son activité et inhibant ainsi son autophosphorylation29. GSK'840 a empêché la phosphorylation de RIPK3 à S227 lors de l’activation de ZBP1 (Figure 2A,B), confirmant la spécificité de la méthode de détection p-RIPK3 (S227) médiée par la TSA.
Pour suivre la phosphorylation MLKL, un marqueur terminal de la nécroptose, les cellules HT-29 exprimant ZBP1 ont été infectées par HSV-1 ICP6mutRHIM pendant 8 h et 10 h. Les cellules ont été colorées avec un anticorps contre MLKL phosphorylé S358 (p-MLKL [S358]) en utilisant TSA. Les cellules simulées ont montré une coloration cytosolique faible et quelque peu ponctuée de p-MLKL (S358), tandis qu’une forte coloration p-MLKL a été détectée dans le cytosol, noyau. et au niveau de la membrane plasmique dans les cellules infectées par lemutRHIM HSV-1 ICP6 (Figure 3A). De plus, le signal p-MLKL (S358) a été observé en grappes. Ceci est conforme aux fonctions de formation de pores des oligomères MLKL phosphorylés activés au niveau de la membrane cellulaire et à sa translocation nucléaire récemment signalée lors de l’infection grippaleA 1,2,6,30. En tant que contrôle positif de la coloration p-MLKL (S358), nous avons stimulé les cellules HT-29 exprimant ZBP1 avec une combinaison de TNF, du SMAC mimétique BV6 et de l’inhibiteur pan-caspase zVAD-fmk pour induire une nécroptose médiée par TNFR1 (Figure 3A). L’omission de l’anticorps primaire anti-p-MLKL (S358) du protocole de coloration médié par la TSA en tant que témoin non primaire n’a pas donné de signal détectable.
Ensuite, nous avons effectué une comparaison côte à côte de la coloration immunofluorescente p-MLKL (S358) avec et sans TSA. Les cellules HT-29 exprimant ZBP1 ont été infectées pendant 9 heures par HSV-1 ICP6mutRHIM. Alors qu’une puissance laser de 40% était nécessaire pour détecter un signal p-MLKL (S358) spécifique dans les cellules infectées en utilisant l’immunofluorescence indirecte standard, les échantillons traités par TSA atteignaient déjà des signaux saturants à une puissance laser de 6% sans augmenter la coloration de fond dans les échantillons simulés traités (Figure 3B). De plus, la quantification des images tridimensionnelles de la pile z a montré une augmentation de plus de 10 fois du nombre de voxels positifs pour p-MLKL (S358) lors de l’utilisation de la TSA par rapport à l’immunofluorescence indirecte standard. Cela montre que la TSA améliore à la fois le seuil de détection et la sensibilité pour p-MLKL (S358; Figure 3C).
Enfin, pour valider le protocole d’immunofluorescence médiée par la TSA pour d’autres stimuli viraux de nécroptose dépendante de ZBP1, nous avons infecté des cellules HT-29 exprimant ZBP1 avec la souche PR8 du virus de la grippe A (IAV) pendant 9 heures. L’IAV induit à la fois l’apoptose médiée par ZBP1 et la nécroptose dans les cellules humaines30. En effet, la TSA a permis la détection robuste de p-RIPK3 (S227) et de p-MLKL (S358), indiquant que ces cellules subissent une nécroptose (Figure 4A-D).
Figure 1 : Représentation schématique du protocole TSA. Les cellules sont ensemencées et stimulées dans une plaque de puits, compatible avec la microscopie haut de gamme. Ensuite, les échantillons sont fixés dans du PFA à 4%, perméabilisés et bloqués pour empêcher une liaison spécifique des anticorps primaires. Afin de visualiser RIPK3 phosphorylé (p-RIPK3 [S227]) et MLKL (p-MLKL [S358]), des anticorps spécifiques reconnaissant ces sites clés de phosphorylation sont incubés pendant une nuit sur la chambre d’imagerie. Ensuite, un anticorps secondaire, couplé à une peroxydase de raifort (HRP), est ajouté. Ce groupe HRP permet l’activation du tyramide biotinylé en présence deH2O2. Par la suite, la biotine-tyramide active se couple de manière covalente à des résidus de tyrosine à proximité immédiate de l’anticorps secondaire marqué HRP. Il s’agit notamment des tyrosines sur les protéines d’intérêt - en l’occurrence p-RIPK3 ou p-MLKL, comme indiqué sur la figure - et celles des protéines voisines et sur les anticorps primaires et secondaires eux-mêmes (non représentés). Cette étape d’amplification du signal tyramide augmente considérablement la sensibilité du protocole de coloration. Dans une dernière étape, de la streptavidine couplée à un groupe fluorescent est ajoutée pour visualiser les molécules biotinylées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : LemutRHIM HSV-1 ICP6 induit une phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 humain à S227. (A) Images confocales représentatives de cellules HT-29 exprimant ZBP1 humaines, comparant la coloration TSA à un protocole standard de coloration par immunofluorescence indirecte (sans TSA) pour p-RIPK3 (S227). Les échantillons simulés et infectés par le virus (HSV-1WT ou HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]) ont été incubés pendant 9 h. En tant que témoin négatif, l’inhibiteur de la kinase RIPK3 GSK'840 (1 μM) a été inclus. Un contrôle sans coloration primaire (NP) des cellules infectées par lemutRHIM ICP6 HSV-1 (MOI = 5) pendant 9 h dans lequel les anticorps primaires anti-p-RIPK3 (S227) et ICP0 ont été omis est inclus. La puissance laser nécessaire pour détecter le signal spécifique p-RIPK3 (S227) est indiquée sur les images. ICP0 a été utilisé pour colorer les cellules infectées par le virus, et DAPI a été utilisé pour colorer le noyau. Les barres d’échelle sont de 10 μm. (B) Quantification relative des voxels p-RIPK3 (S227)+ à l’aide du protocole de coloration TSA. Chaque point représente une image et la barre rouge représente la médiane. Les valeurs de nombre de voxels sont présentées par rapport à la médiane du nombre de voxels des images dans la condition simulée. Les statistiques ont été effectuées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle avec des comparaisons multiples utilisant la correction de Tukey. p > 0,05 (n.s.), p≤ 0,05 (*), p≤ 0,01 (**). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : LemutRHIM ICP6 du HSV-1 induit une phosphorylation dépendante de ZBP1 de MLKL humain à S358. (A) Images confocales représentatives de cellules HT-29 exprimant ZBP1 humaines. Les cellules ont été soit simulées traitées, soit infectées par lemutRHIM HSV-1 ICP6 (MOI = 5) pendant 8 h et 10 h. La TSA a été utilisée pour détecter p-MLKL (S358). ICP0 a été utilisé pour colorer les cellules infectées par le virus, et DAPI a été utilisé pour colorer le noyau. Un contrôle sans coloration primaire (NP) des cellules infectées pendant 10 h par HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) dans lequel l’anti-p-MLKL primaire (S358) a été omis est montré. En tant que témoin positif, les cellules ont été stimulées pendant 4 heures avec 30 ng / mL de TNF, 5 μM BV6 et 20 μM ZVAD-fmk, ce qui induit une nécroptose via TNFR1. Les barres d’échelle sont de 10 μm. (B) Images confocales représentatives de cellules HT-29 exprimant ZBP1 humaines, comparant la coloration TSA à un protocole de coloration par immunofluorescence indirect standard (pas de TSA) pour p-MLKL (S358). Les cellules ont été soit simulées traitées, soit infectées par HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) pendant 9 h. Un contrôle de coloration NP des cellules infectées par HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) pendant 9 h dans lequel les anticorps primaires anti-p-MLKL (S358) et ICP0 ont été omis est inclus. La puissance laser nécessaire pour détecter le signal spécifique p-MLKL (S358) est indiquée sur les images. (C) Quantification relative des voxels p-MLKL (S358)+ à l’aide du protocole de coloration standard (pas de TSA) et TSA. Chaque point représente une image et la barre rouge représente la médiane. Les valeurs du nombre de voxels sont présentées par rapport à la médiane du nombre de voxels des images dans la condition simulée. Les statistiques ont été effectuées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle avec des comparaisons multiples utilisant la correction de Tukey. p > 0,05 (n.-é.), p ≤ 0,0001 (****). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Le virus de la grippe A induit une phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL humains. (A,C) Images confocales représentatives de cellules HT-29 exprimant ZBP1 humaines. Les cellules ont été soit simulées traitées, soit infectées par le virus de la grippe A (IAV), souche PR8 (MOI = 4) pendant 9 h et colorées pour p-RIPK3 (S227; A) ou p-MLKL (S358; C) en utilisant le protocole TSA. Les barres d’échelle sont de 10 μm. (B,D) Quantification relative de p-RIPK3 (S227)+ (B) ou p-MLKL (S358; D) voxels. Chaque point dans (B, D) représente une image, et la barre rouge représente la médiane. Les valeurs du nombre de voxels sont présentées par rapport à la médiane du nombre de voxels des images dans la condition simulée. Les statistiques ont été effectuées à l’aide d’un test de Mann-Whitney. p≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole de coloration immunofluorescente décrit l’utilisation de l’amplification du signal tyramide (TSA) pour augmenter la sensibilité aux événements de signalisation de la voie de signalisation nécroptotique humaine qui sont difficiles à détecter, y compris la phosphorylation de RIPK3 et MLKL26. L’inclusion d’une étape TSA améliore considérablement le seuil de détection de p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) et augmente la sensibilité de la contrainte p-MLKL (S358). La TSA a révélé un signal p-RIPK3 (S227) déjà présent dans les échantillons simulés traités. Dans les cellules humaines, l’autophosphorylation de RIPK3 à S227 est une condition préalable à l’activation de la nécroptose en permettant une interaction stable avec MLKL. Ce processus se produit déjà à des niveaux basaux et entraîne la formation d’un dimère p-RIPK3 (S227)/MLKL inactif stable avant l’induction de la nécroptose 2,5,31. De même, l’anticorps anti-p-RIPK3 utilisé dans cette étude détecte également p-RIPK3 (S227) dans les cellules non traitées par transfert Western26.
La phosphorylation de MLKL par RIPK3 dans la boucle d’activation, à T357 et S358, entraîne la dissociation du complexe inactif p-RIPK3 (S227)/MLKL et induit un changement conformationnel par lequel MLKL expose son domaine N-terminal à quatre hélices. Le p-MLKL activé s’oligomérise ensuite et se dirige vers la membrane cellulaire où il insère ses quatre faisceaux hélicoïdaux dans la bicouche lipidique, entraînant la lysecellulaire 1,2,6. En utilisant ce protocole d’immunofluorescence TSA, nous avons détecté une forte augmentation de la phosphorylation de S358 MLKL au cours de la nécroptose induite par ZBP1. p-MLKL (S358) s’est regroupé dans le cytosol et à la membrane plasmique et a également été trouvé dans le noyau lors de l’activation de ZBP1. En effet, il a été rapporté que ZBP1 stimule la perturbation médiée par MLKL de la membrane nucléaire dans le contexte de l’infection IAV 8,30. Il convient toutefois de noter que la TSA dépose non seulement de la biotine-tyramide sur l’antigène d’intérêt et les anticorps primaires/secondaires, mais aussi sur les protéines voisines. La TSA n’est donc pas idéale pour déduire des informations sur la localisation subcellulaire précise des protéines détectées, et nous ne recommandons pas la TSA pour les études de co-localisation.
Les cycles répétés de gel-dégel ont un impact sur la stabilité du tyramide biotinylé. Pour éviter une diminution de la sensibilité au signal, nous recommandons d’aliquote le tyramide et d’utiliser une nouvelle partie aliquote pour chaque expérience. Il faut faire preuve de prudence en ce qui concerne les différences d’un lot à l’autre dans les stocks de biotine-tyramide. Si la concentration finale de biotine-tyramide est trop élevée, le fond non spécifique de l’amplification TSA masquera le signal spécifique. Pour contrôler cela, nous recommandons de titrer chaque nouveau lot de biotine-tyramide et d’inclure un contrôle sans coloration primaire dans lequel l’anticorps primaire est omis.
Dans le protocole présenté, la TSA était limitée à une cible. La détection de RIPK3 et MLKL phosphorylés n’a pas été combinée dans la même coloration, car les deux anticorps primaires ont été élevés chez la même espèce. Le protocole pourrait être adapté pour détecter plusieurs signaux amplifiés par la TSA (p. ex., p-RIPK3 [S227] et p-MLKL [S358]) dans le même échantillon à l’aide de l’immunofluorescence multiplex TSA32,33. Enfin, l’amplification médiée par TSA pour la microscopie d’immunofluorescence peut être utilisée pour la reconnaissance de biomarqueurs d’autres voies de signalisation avec de mauvais rapports signal sur bruit signalés.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le VIB Bioimaging Core pour la formation, le soutien et l’accès au parc d’instruments. J.N. est soutenu par une bourse de doctorat de la Fondation pour la recherche de Flandre (FWO). La recherche dans le groupe J.M. a été soutenue par une bourse Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), une subvention de recherche junior (G031022N) de la Fondation de recherche Flanders (FWO), une bourse de preuve de concept pour jeunes chercheurs du CRIG et par l’Université de Gand. La recherche dans le groupe P.V. a été soutenue par EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), les consortiums CRIG et GIGG et VIB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | - | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
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