Amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL après infection à HSV-1 dans des cellules humaines

Summary

L’amplification du signal tyramide lors de la coloration par immunofluorescence permet la détection sensible de RIPK3 et MLKL phosphorylés lors de la nécroptose induite par ZBP1 après une infection à HSV-1.

Abstract

La kinase RIPK3 (RIPK3) qui interagit avec le récepteur de la kinase et son substrat mixte de type domaine kinase (MLKL) sont des régulateurs essentiels de la nécroptose, une forme inflammatoire de mort cellulaire ayant d’importantes fonctions antivirales. L’autophosphorylation de RIPK3 induit la phosphorylation et l’activation de la protéine bourreau formant les pores de la nécroptose MLKL. Le trafic et l’oligomérisation du MLKL phosphorylé au niveau de la membrane cellulaire entraînent une lyse cellulaire, caractéristique de la mort cellulaire nécroptotique. Le capteur d’acide nucléique ZBP1 est activé en se liant à l’ARN double brin (ARN-Z) gaucher de forme Z après infection par des virus à ARN et à ADN. L’activation de ZBP1 limite l’infection virale en induisant la mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose, des cellules hôtes infectées. La microscopie par immunofluorescence permet de visualiser différentes étapes de signalisation en aval de la nécroptose médiée par ZBP1 sur une base cellulaire. Cependant, la sensibilité de la microscopie à fluorescence standard, utilisant actuellement des anticorps phospho-spécifiques disponibles dans le commerce contre RIPK3 et MLKL humains, empêche l’imagerie reproductible de ces marqueurs. Ici, nous décrivons une procédure de coloration optimisée pour la sérine (S) phosphorylée RIPK3 (S227) et MLKL (S358) dans les cellules humaines HT-29 infectées par le virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1). L’inclusion d’une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) dans le protocole de coloration immunofluorescente permet la détection spécifique de S227 phosphorylé RIPK3. De plus, la TSA augmente considérablement la sensibilité de la détection de MLKL phosphorylé S358. Ensemble, cette méthode permet de visualiser ces deux événements de signalisation critiques lors de l’induction de la nécroptose induite par ZBP1.

Introduction

La protéine kinase 3 sérine/thréonine interagissant avec les récepteurs (RIPK3) et le domaine mixte de la kinase de lignée (MLKL) sont des régulateurs centraux de la mort cellulaire nécroptotique ^1,2. La nécroptose est une forme lytique et inflammatoire de mort cellulaire régulée impliquée dans l’immunité antivirale et l’autoinflammation. La nécroptose des cellules infectées par le virus arrête immédiatement la réplication du virus. La lyse cellulaire après induction de la nécroptose libère également des schémas moléculaires associés aux dommages, qui stimulent l’immunité antivirale

Protocol

1. Préparation du tyramide biotinylé

1. Préparer du tyramide biotinylé à partir de biotine-tyramide. Pour faire une solution mère de 10 mM, dissoudre 3,6 mg de biotine-tyramide dans 1 mL de DMSO. Conserver le produit dissous dans des aliquotes à −20 °C pour en préserver la qualité.

2. Maintenir les cellules HT-29 en culture

NOTE: Les HT-29 exprimant ZBP1 ont été générés par transduction avec un lentivecteur²⁷ codant pour ZBP1 humain.

1. Conservez les cellules HT-29 exprimant ZBP1 dans le milieu 5A de McCoy supplémenté en L-glutamine, en....

Results

La détection par immunofluorescence de la phosphorylation MLKL et en particulier de la phosphorylation RIPK3 dans les cellules humaines est techniquement difficile²⁶. Nous présentons ici un protocole de coloration amélioré pour p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) humains lors de l’activation de ZBP1. Le protocole comprend une étape TSA pour améliorer la limite de détection et la sensibilité des signaux fluorescents. Pour valider la méthode, une comparaison côte à côte de l’immunofluorescence médiée pa.......

Discussion

Ce protocole de coloration immunofluorescente décrit l’utilisation de l’amplification du signal tyramide (TSA) pour augmenter la sensibilité aux événements de signalisation de la voie de signalisation nécroptotique humaine qui sont difficiles à détecter, y compris la phosphorylation de RIPK3 et MLKL²⁶. L’inclusion d’une étape TSA améliore considérablement le seuil de détection de p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) et augmente la sensibilité de la contrainte p-MLKL (S358). La TSA a révélé un signal p-.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorps >
anti-lapin HRP	Agilent Technologies Belgique	K4002	Envision+ System-HRP Labellisé Polymère anti-lapin
Chèvre anti-souris DyLight 633	Thermofisher	35513	Anticorps sécundary
HSV-1 ICP0	Santa Cruz	sc-53070	Anticorps
anti-ICP0(HSV-1) de sourisSérum de souris IAV-PR8	Production en interne	xx	Anticorps polyclonal anti-IAV-PR8
de souris pMLKL	Abcam	ab187091	Anticorps anti-MLKL-phospho S358 de lapin
pRIPK3	Abcam	ab209384	Anticorps anti-RIPK3-phospho S227 de lapin
Fluorophores
DAPI	Thermofisher	D21490	Visualiser le noyau des cellules
Streptavidine couplée à Alexa Fluor 568	Thermofisher	S11226	Pour visualiser les molécules de biotine
Composations
30 % H2O2	Sigma	H1009	Substrat oxydant, nécessaire à l’activité HRP
4 % PFA	SANBIO	AR1068	Pour fixer/réticuler les cellules
Biotinyl-tyramide	R& D Systems	6241	Pour amplifier le signal, substrat HRP
BV-6	Selleckchem	S7597	BV6 Inhibiteur de l’IAP
;   ;	;   ;	;   ;	Pour la culture cellulaire : pour détacher les cellules
;   ;	;   ;	;   ;	8,0 g/L de NaCl
;   ;	;   ;	;   ;	0,4 g/L de sel disodique d’EDTA
EDTA 0,04 %	Formulation		1,1 g/L de Na2HPO4
;	;   ;	;   ;	0,2 g/L de NaH2PO4
;   ;	;   ;	;   ;	0,2 g/L de KCl
;   ;	;   ;	;   ;	0,2 g/L de glucose
Sérum fœtal bovin	TICO	FBS EU XXX	Pour la culture cellulaire, maintien de la culture cellulaire ; numéro de lot : 90439
GSK'840	Aobious	AOB0917	RIPK3 inhibiteur de kinase
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	Pour la culture cellulaire, maintien de la culture cellulaire
MAXblock	Active Motif	15252	Solution bloquante
PBS	Gibco
Pyruvate de sodium	Sigma-Aldrich	S8636	Pour la culture cellulaire, le maintien de la culture cellulaire
TNF-&alpha ;	Production en	interne-Molécule	de signalisation, capable de déclencher la mort cellulaire en combinaison avec BV6 et zVAD
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-50ML	Pour perméabiliser les cellules
Trypan blue	Merck	11732	Pour le comptage cellulaire, utilisé comme marqueur vivant/mort à 0,1 %
Trypsine	Sigma-Aldrich	T4424	Pour la culture cellulaire : pour détacher les cellules
zVAD	Bachem	BACE4026865.0005	Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ ;-Slide 8 puits haut fond de verre	iBidi	80807	Pour cultiver les cellules
Coton Boules de présage-taille moyenne	Microscopie électronique Sciences	71001-10	Pour nettoyer les objectifs
Immersol 518 F/30 ° ; C	ZEISS	444970-9000-000	Pour visualiser l’échantillon à fort grossissement
Nettoyeur d’objectif	ZEISS	000000-0105-200	Pour nettoyer les objectifs
LSM880 Microscope			Pour visualiser l’échantillon
Software
Excel	Office xx		Pour traiter les données
Prism 9	Graphpad	xx	Pour analyser les données- tests statistiques et génération de graphiques
Volocité 6.3	Volocité	xx	Pour effectuer des quantifications
Zen noir	ZEISS	xx	Pour acquérir et traiter des images
Zen bleu	ZEISS	xx	Pour visualiser des images
Virus
la souche F du HSV-1 (mutRHIM)	produite par le Dr Jiahuai Han	dans la réplication interne	du HSV-1 comme déclencheur de nécroptose ; Le domaine central RHIM d’UL39/ICP6 est muté (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) souche F	produite par le Dr Jiahuai Han	dans la réplication en maison	HSV-1 (WT) en tant que contrôle négatif pour l’induction de la nécroptose (inhibition de l’ICP6)
IAV PR8	dans le stock domestique	en réplication interne	IAV comme déclencheur de nécroptose