Summary
Усиление тирамидного сигнала во время иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет чувствительно обнаруживать фосфорилированные RIPK3 и MLKL во время ZBP1-индуцированного некроптоза после инфекции ВПГ-1.
Abstract
Киназна-взаимодействующая с рецептором серин/треонин протеинкиназа 3 (RIPK3) и ее субстрат смешанной линии киназы доменной (MLKL) являются критическими регуляторами некроптоза, воспалительной формы гибели клеток с важными противовирусными функциями. Аутофосфорилирование RIPK3 индуцирует фосфорилирование и активацию порообразующего белка-палача некроптоза MLKL. Незаконный оборот и олигомеризация фосфорилированного МЛКЛ на клеточной мембране приводит к лизису клеток, характерному для некроптотической гибели клеток. Датчик нуклеиновых кислот ZBP1 активируется путем связывания с левосторонней Z-формой двухцепочечной РНК (Z-РНК) после заражения РНК и ДНК-вирусами. Активация ZBP1 ограничивает вирусную инфекцию, вызывая регулируемую гибель клеток, включая некроптоз, инфицированных клеток-хозяев. Иммунофлуоресцентная микроскопия позволяет визуализировать различные сигнальные стадии после ZBP1-опосредованного некроптоза на клеточной основе. Однако чувствительность стандартной флуоресцентной микроскопии с использованием современных коммерчески доступных фосфоспецифических антител против человека RIPK3 и MLKL исключает воспроизводимую визуализацию этих маркеров. Здесь мы описываем оптимизированную процедуру окрашивания сериновых (S) фосфорилированных RIPK3 (S227) и MLKL (S358) в клетках HT-29 человека, инфицированных вирусом простого герпеса 1 (HSV-1). Включение стадии усиления тирамидного сигнала (TSA) в протокол иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет специфически обнаруживать фосфорилированный RIPK3 S227. Кроме того, TSA значительно повышает чувствительность обнаружения фосфорилированного MLKL S358. Вместе этот метод позволяет визуализировать эти два критических сигнальных события во время индукции некроптоза, индуцированного ZBP1.
Introduction
Рецептор-взаимодействующая серин/треонин протеинкиназа 3 (RIPK3) и доменная диназа смешанной линии (MLKL) являются центральными регуляторами некроптотической гибели клеток 1,2. Некроптоз является литической и воспалительной формой регулируемой гибели клеток, участвующей в противовирусном иммунитете и аутовоспалении. Некроптоз инфицированных вирусом клеток немедленно отключает репликацию вируса. Лизис клеток после индукции некроптоза также высвобождает связанные с повреждением молекулярные паттерны, которые стимулируют противовирусный иммунитет 3,4. Некроптоз инициируется активацией RIPK3 после опосредованного мотивом гомотипического взаимодействия RIP (RHIM) с одной из трех восходящих активирующих молекул: RIPK1 (при вовлечении рецептора TNF 1 [TNFR1]), TIR-доменсодержащим адаптером, индуцирующим интерферон-β (TRIF; при вовлечении Toll-подобных рецепторов 3 и 4) или датчиком противовирусной нуклеиновой кислоты Z-ДНК-связывающим белком 1 (ZBP1)1,2 . Передача сигналов некроптоза протекает через серию событий фосфорилирования, начиная с автофосфорилирования RIPK3. Аутофосфорилирование человеческого RIPK3 при серине (S)227 внутри его киназного домена является предпосылкой для некроптоза, обеспечивая взаимодействие с MLKL, и обычно используется в качестве биохимического маркера активации RIPK3 человека и некроптотической гибели клеток 1,5. После активации RIPK3 фосфорилирует цикл активации MLKL при треонине (T)357 и S3581. Это вызывает изменение конформации MLKL, что приводит к воздействию N-концевого домена четырехспирального пучка спирали. Затем MLKL олигомеризуется и транспортируется к клеточной мембране, где он образует пору через вставку открытых четырех пучков спирали в липидный бислой, что в конечном итоге приводит к гибели клеток 2,6.
ZBP1 - это датчик противовирусных нуклеиновых кислот, который распознает левосторонние Z-образные нуклеиновые кислоты, включая двухцепочечную РНК в Z-конформации (Z-РНК). Связывание Z-РНК происходит через два Zα-домена, расположенных на N-конце ZBP1. Считается, что Z-РНК, накапливающаяся во время заражения РНК и ДНК вирусами, напрямую влияет на ZBP1 7,8. Активированный ZBP1 набирает RIPK3 через свои центральные RHIM и индуцирует регулируемую гибель клеток, включая некроптоз 9,10. Вирусы приняли многочисленные механизмы побега для противодействия ZBP1-индуцированному некроптозу клеток-хозяев11. Например, вирус простого герпеса 1 (ВПГ-1) рибонуклеотидредуктазы субъединицы 1, известный как ICP6 и кодируемый UL39, содержит RHIM на своем N-конце, который препятствует ZBP1-опосредованной активации RIPK3 в клетках человека 12,13,14,15. ZBP1 не только ограничивает репликацию вируса, но исследования на мышах показали, что активация ZBP1 вызывает воспалительные заболевания и стимулирует раковый иммунитет 16,17,18,19,20,21. Поэтому протоколы, которые обнаруживают сигнальные события, происходящие во время ZBP1-индуцированного некроптоза в клетках человека, ценны для оценки роли ZBP1 в этих процессах.
Амплификация тирамидного сигнала (TSA), также называемая катализируемым репортерным осаждением (CARD), была разработана для улучшения предела обнаружения и отношения сигнал/шум в иммуноанализах на основе антител. Во время TSA любое первичное антитело может быть использовано для обнаружения интересующего антигена. Пероксидаза хрена (HRP) в сочетании со вторичным антителом катализирует местное накопление биотинилированных тирамидных радикалов в присутствии перекиси водорода. Эти активированные биотин-тирамидные радикалы затем реагируют с проксимальными остатками тирозина с образованием ковалентных связей. Потенциальные тирамидно-биотиновые субстраты включают сам антиген, первичные и вторичные антитела и соседние белки. Таким образом, в то время как TSA значительно улучшает чувствительность анализа, часть его пространственного разрешения теряется. На заключительном этапе молекулы биотина обнаруживаются с использованием флуоресцентно меченого стрептавидина. Реакция HRP откладывает много молекул тирамида-биотина на интересующем антигене или рядом с ним. Это значительно увеличивает количество сайтов связывания стрептавидин-фторхром, тем самым значительно усиливая чувствительность анализа (рисунок 1). Альтернативно, тирамид может быть непосредственно соединен с фторхромом, устраняя необходимость в флуорофорах, связанных со стрептавидином. Иммуногистохимия белка и гибридизация ДНК/РНК in situ были одними из первых методов, с помощью которых TSA был использован для улучшения интенсивности сигнала22,23. Совсем недавно TSA был объединен с внутриклеточной проточной цитометрией24 и масс-спектрометрией25.
Здесь мы представляем протокол для обнаружения серина 227 фосфорилированного человеческого RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) и фосфорилированного человеческого MLKL (p-MLKL [S358]) при активации ZBP1 инфекцией HSV-1 с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии. Мы используем чувствительную к некроптозу клеточную линию колоректальной аденокарциномы человека HT-29, которая была трансдуцирована для стабильной экспрессии человеческого ZBP1. Эти клетки были инфицированы штаммом HSV-1, экспрессирующим мутантный белок ICP6 (HSV-1 ICP6mutRHIM), в котором четыре основные аминокислоты в вирусном RHIM (VQCG) были заменены аланинами (AAAA), тем самым делая ICP6 неспособным блокировать ZBP1-опосредованный некроптоз 13,14,15. Чтобы преодолеть проблему низкого отношения сигнал/шум коммерчески доступных в настоящее время антител, направленных против p-RIPK3 и p-MLKL в иммуноокрашивании26, мы выполняем стадию усиления тирамидного сигнала (TSA) (рисунок 1), которая приводит к надежному обнаружению человеческого p-RIPK3 (S227) и улучшает чувствительность обнаружения p-MLKL человека (S358) на порядок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение биотинилированного тирамида
- Готовят биотинилированный тирамид, начиная с биотин-тирамида. Чтобы сделать 10 мМ запасного раствора, растворить 3,6 мг биотин-тирамида в 1 мл ДМСО. Хранить растворенный продукт в аликвотах при −20 °C для сохранения качества.
2. Поддержание клеток HT-29 в культуре
ПРИМЕЧАНИЕ: ZBP1-экспрессирующие HT-29 были сгенерированы трансдукцией с лентивектором27 , кодирующим человеческий ZBP1.
- Храните ZBP1-экспрессирующие клетки HT-29 в среде McCoy 5A, дополненной L-глутамином, пируватом натрия и 10% фетальной бычьей сывороткой (отныне называемой полной средой) и поддерживайте в инкубаторе при 37 ° C с 5% углекислого газа. В идеале используйте ячейки с низким проходным числом (менее 10). Оставьте клетки восстанавливаться в течение как минимум 5 дней после цикла оттаивания до начала эксперимента.
- Чтобы отсоединить клетки от колбы для культивирования, удалите среду и промыть клетки 5 мл PBS (предварительно нагретым до 37 °C). Затем добавьте соответствующее количество трипсина/ЭДТА (0,05% трипсина и 0,032% ЭДТА, соответственно, предварительно нагретого до 37 °C) в клетки (2 мл для колбы T75, 3 мл для колбы T175).
- Инкубировать клетки с трипсином/ЭДТА в течение 10 мин в инкубаторе при 37 °C с 5% углекислого газа. После этого коснитесь колбы и визуально проверьте, отделились ли клетки от колбы с помощью микроскопа с объективным увеличением 4x-20x.
- Если клетки не полностью отсоединены, инкубируют еще 5 мин при 37 °C. Когда клетки отделяются, остановите ферментативную реакцию, добавив 6 мл полной среды в колбу.
- Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл. Подсчитайте клетки, используя синее пятно трипана для оценки жизнеспособности; рекомендуется разведение 1:5. Приступайте к эксперименту только в том случае, если жизнеспособность клеток превышает 90%.
3. Начало эксперимента, посев и стимуляция клеток
- Посейте 90 000 ZBP1-экспрессирующих клеток HT-29 в полной среде в пластине скважины площадью 1 см², которая позволяет проводить микроскопию высокого класса. Используйте конечный объем 200 мкл на скважину.
- Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C с 5% углекислого газа. Примите во внимание, что некоторые дополнительные колодцы должны быть засеяны для контроля окрашивания, что более подробно объясняется на этапе 5.6.
- Когда клетки достигнут 70%-80% конфлюзии, добавьте к клеткам стимул, вызывающий некроптоз. Здесь клетки были инфицированы HSV-1 ICP6mutRHIM (кратность инфекции [MOI] 5, определяемая как бляшеобразующие единицы (pfu), разделенные на количество клеток; pfu количественно оценивали с помощью анализа бляшек на клетках Vero) в течение 6 ч, 8 ч или 10 ч.
- В качестве положительного контроля индукции некроптоза стимулируют клетки в течение 4 ч с помощью вызывающего некроптоз коктейля, содержащего 30 нг/мл TNF, 20 мкМ ингибитора панкаспазы zVAD-fmk и 5 мкМ миметического BV6 SMAC.
- В качестве отрицательного контроля для окрашивания p-RIPK3 (S227) включают GSK'840 (1 мкМ) для ингибирования активности киназы RIPK3 и предотвращения аутофосфорилирования S227. В идеале добавляют ингибитор в необработанном состоянии и после стимуляции некроптоза. Ингибитор может быть добавлен одновременно с вирусной инфекцией.
- Подготовьте стимуляцию в полной среде, предварительно разогретой до 37 °C. Используйте конечный объем 200 мкл на лунку для всех стимуляций.
4. Фиксация ячеек
- Удалите среду и промыть клетки 200 мкл 1x PBS. Затем добавляют в клетки 150 мкл 4% PFA (уже уравновешенного при комнатной температуре) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете ячейки, которые легко отсоединяются, фиксация ячеек может быть оптимизирована следующим образом. Извлеките из скважины 100 мкл среды, чтобы на пластине остался объем 100 мкл. Добавьте 100 мкл 4% PFA к клеткам. Инкубировать клетки в течение 5 мин при комнатной температуре. После этого удалите среду/фиксатор из скважин и замените 150 мкл 4% PFA. Инкубируйте клетки еще 20 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить полную фиксацию клеток. - После фиксации удалите 4% PFA и промыть ячейки 3x с 200 мкл 1x PBS. Образцы могут храниться в избытке (>200 мкл) 1x PBS при 4 °C в течение ночи до дальнейшей обработки.
5. Пермеабилизация и первичное окрашивание
- Удалите PBS и добавьте 100 мкл буфера пермеабилизации (0,5% Triton X-100 в PBS). Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Удалите буфер проницаемости и, впоследствии, промыть скважины 100 мкл промывочного буфера (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте камеру визуализации с буфером промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере (20-30 качающихся движений в минуту).
- Для предотвращения неспецифического связывания первичных антител добавляют 100 мкл блокирующей среды и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Альтернативно, этот блокирующий шаг может быть заменен блокировкой 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промывайте скважины 3x со 100 мкл промывочного буфера (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте шаги промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
- После удаления буфера промывки добавьте первичные антитела в камеру визуализации и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Используйте конечный объем 100 мкл для покрытия скважины. Во время ночной инкубации при 4°C не размещайте камеру визуализации на наклонном лабораторном шейкере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-p-MLKL (S358; разбавление: 1:200) и анти-p-RIPK3 (S227; разбавление: 1:200) разделяют кролика в качестве вида-хозяина и поэтому не должны комбинироваться в одной лунке. Для мониторинга вирусной инфекции комбинируйте первичное антитело против вирусного белка по выбору с p-MLKL (S358) или p-RIPK3 (S227). Здесь клетки были инфицированы инфекцией ВПГ-1 с последующим окрашиванием ICP0 (разведение: 1:50, вид хозяина: мышь). - Примите во внимание необходимые элементы управления окрашиванием на этом этапе. Всегда включайте состояние отсутствия первичных антител для визуализации потенциального фона стадии амплификации TSA для установки порога маскировки (см. шаг 9).
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае протокола совместного окрашивания (например, комбинирования p-MLKL [S358] или p-RIPK3 [S227] с антителом против вирусного белка) также используйте одиночные пятна. Использование одиночных пятен важно для коррекции потенциального сквозного сигнала в других каналах визуализации.
6. Усиление тирамидного сигнала (TSA)
- Удалить первичную смесь антител и промыть колодцы в 3 раза со 100 мкл промывочного буфера (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте шаги промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
- Удалите промывочный буфер и добавьте 100 мкл меченого HRP вторичного антитела, распознающего вид первичного антитела, которое необходимо усилить. Для усиления сигнала p-RIPK3 (S227) или p-MLKL (S358) добавьте 100 мкл анти-rabbit-HRP и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будет усилен только p-MLKL (S358) или p-RIPK3 (S227). Окрашивание вирусного белка будет визуализироваться с помощью стандартного метода косвенного окрашивания. - После этого промывайте скважины 3x 100 мкл промывочного буфера (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте шаги промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
- На следующих этапах добавьте биотинилированный тирамид к микроскопической пластине. Используя HRP-группу, связанную со вторичными антителами, ферментативная реакция вызовет образование тирамидных радикалов в непосредственной близости от первичной мишени (здесь p-MLKL [S358] или p-RIPK3 [S227]).
- Чтобы активировать ферментативную активность HRP, добавляют окисляющий субстрат вместе с биотинилированным тирамидом. Для достижения этой цели дополните буфер TSA (0,1 М борной кислоты [рН 8,5]) 0,03 М H2O2; в частности, возьмите 5 мл буфера TSA и добавьте 5 мкл 30% H2O2.
- Теперь разбавьте биотин-тирамид вH2O 2-дополненномбуфером TSA в диапазоне от 1:1000 до 1:20 000.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разбавления биотин-тирамида должен быть оптимизирован для каждой партии. - Извлеките промывочный буфер из скважин и добавьте в скважины разбавленный биотин-тирамид до конечного объема 100 мкл. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин на наклонном лабораторном шейкере.
- Далее промываем скважины 3x со 100 мкл промывочного буфера (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте шаги промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
7. Флуорофоры
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку сигнал первичного антитела преобразуется в биотин-группу, p-MLKL (S358) и p-RIPK3 (S227) визуализируются с помощью стрептавидина, связанного с флуорофором (флуорофор 568, разведение: 1:500). Кроме того, ядра окрашиваются DAPI (5 мкг/мл). Если вирусный белок включен в протокол окрашивания, включите подходящее флуоресцентно меченое вторичное антитело против вида хозяина вашего первичного антитела. В репрезентативных результатах использовался мышиный анти-ICP0. В качестве вторичного антитела была включена козья антимышка, связанная с флуорофором 633 (разведение: 1:1000).
- Внесите окрашивающую смесь в буфер для стирки (0,1% Triton X-100 в PBS), содержащую антитела и пятна, упомянутые выше. Снимите буфер для стирки, добавьте 100 мкл смеси для окрашивания и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч на наклонном лабораторном шейкере. Держите камеру визуализации защищенной от света с этого шага вперед.
- Далее промываем скважины 2х с промывочным буфером (0,1% Triton X-100 в PBS). Инкубируйте шаги промывки в течение 5 мин при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.
- Наконец, промыть скважины 2x с 1x PBS. Храните образцы в избытке (> 200 мкл) 1x PBS до получения изображения. В качестве альтернативы, погружайте образцы в монтажную среду, чтобы сохранить окрашивание. Камера визуализации теперь готова к визуализации на конфокальном микроскопе.
8. Визуализация с помощью конфокального микроскопа
- Включите конфокальный микроскоп и лазеры не менее чем за 10 минут до получения изображения.
- Используйте цель погружения для чувствительности. Предпочтительно использовать 40-кратное или 63-кратное объективное увеличение. Перед визуализацией очистите погружные объективы с помощью очистителя линз с помощью соответствующих ватных шариков. Грязные цели (например, из-за пыли) могут привести к снижению качества изображения.
- Поместите избыточное количество масла на дно камеры визуализации. Кроме того, добавьте каплю масла на цель выбора.
- Поместите камеру визуализации на микроскоп. Найдите поле фокусировки с помощью окрашивания DAPI или с помощью визуализации яркого поля. При необходимости перемещайтесь по камере визуализации, чтобы обеспечить правильное распределение погружного масла.
- Настройте необходимые дорожки визуализации на микроскопе. В зависимости от микроскопа следующие шаги могут варьироваться (таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: При настройке треков визуализации запрограммируйте дорожки таким образом, чтобы ядерное окрашивание измерялось последним. Лазер 405 нм может способствовать фотоотбеливанию и, таким образом, потере определенного сигнала во всех каналах. - Чтобы проанализировать всю ячейку на наличие p-RIPK3 (S227) или p-MLKL (S358), измерьте z-стеки, которые охватывают высоту ячейки. Здесь z-стеки были сделаны из 40 срезов каждые 0,16 мкм, что привело к диапазону 6,22 мкм.
| Дорожка | Лазер | Светоделитель | Фильтр |
| pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) | 561 | МБС -405 + | BP 570-620 + LP645 |
| MBS 488/561/633 + SBS с пакетом обновления 615 (SP615) | |||
| Вирусный ген: ICP0 | 633 | МБС -405 + | ВР 420-480 + LP605 |
| MBS 488/561/633 + SBS LP570 | |||
| Ядро: DAPI | 405 | МБС -405 + | ВР 420-480 + ВР 495-550 |
| МБС 488/561/633 |
Таблица 1: Визуальные дорожки для визуализации клеток.
9. Анализ и количественная оценка данных
- Загрузите микроскопические изображения в программное обеспечение. Используйте расширенный фокус для визуализации всей информации z-стека в 2D-изображении.
- Затем запрограммируйте протокол анализа, чтобы извлечь следующую информацию: количество ячеек на изображение, сумму вокселей, показывающих окрашивание p-RIPK3 (S227)+ или p-MLKL (S358)+ . Воксель представляет собой трехмерный объем, определяемый как трехмерный эквивалент пикселя.
- Чтобы количественно оценить количество клеток на изображении, сегментируйте ядро. Чтобы уменьшить шум в результатах сегментации, добавьте ограничение по размеру сегментации (>100 мкм³). Количество сегментированных ядер представляет собой количество клеток на изображении.
- Для количественной оценки количества вокселей p-RIPK3 (S227)+ или p-MLKL (S358)+ запрограммируйте сегментацию на основе пороговых значений. Установите порог таким образом, чтобы сигнал не улавливался на изображениях без первичных антител (NP).
- Далее адаптируйте порог, используя изображения из необработанного имитационного состояния. Чтобы обеспечить чувствительное обнаружение увеличения сигнала из-за стимуляции некроптоза, ограничьте прием вокселей p-RIPK3 (S227)+ или p-MLKL (S358)+ в имитационных условиях, установив более высокий порог. Всегда проверяйте запрограммированный протокол анализа на нескольких изображениях из имитационного состояния и вирусной инфекции, вызывающей некроптоз.
- Выполните анализ всех наборов изображений. Экспортируйте квантовую оценку вокселя и сегментацию ядра в файл .txt для дальнейшей обработки в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
- Составьте сводную таблицу данных, показывающую имя изображения, количественную оценку ядра и сумму обнаруженных вокселей.
- Затем разделите сумму положительных вокселей на количество ячеек на изображении. Это приводит к относительному значению положительных вокселей на клетку. Чтобы визуализировать увеличение складки, разделите относительное значение p-RIPK3 (S227)+ или p-MLKL (S358)+ вокселей на ячейку на медиану необработанного состояния (макет).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Иммунофлуоресцентное обнаружение фосфорилирования MLKL и особенно фосфорилирования RIPK3 в клетках человека технически сложно26. Здесь мы представляем улучшенный протокол окрашивания для человека p-RIPK3 (S227) и p-MLKL (S358) при активации ZBP1. Протокол включает в себя шаг TSA для улучшения предела обнаружения и чувствительности флуоресцентных сигналов. Для валидации метода было проведено параллельное сравнение TSA-опосредованной иммунофлуоресценции со стандартным непрямым флуоресцентным окрашиванием как p-RIPK3 (S227), так и p-MLKL (S358).
Клетки HT-29, экспрессирующие человеческий ZBP1, были инфицированы в течение 9 ч мутантным штаммом ICP6 RHIM HSV-1 (HSV-1 ICP6mutRHIM), чтобы индуцировать ZBP1-опосредованный некроптоз и фосфорилирование RIPK3. Штамм HSV-1 ICP6mutRHIM несет мутацию VQCG в AAAA в RHIM ICP6 и не может блокировать некроптоз, сигнализирующий после ZBP1 14,15. Как сообщалось ранее26, стандартная непрямая иммунофлуоресценция не была достаточно чувствительной для визуализации фосфорилирования RIPK3 S227 с текущим коммерчески доступным антителом, даже когда мощность лазера конфокального микроскопа была увеличена до 30% (рисунок 2A). Напротив, включение стадии TSA позволило надежно обнаружить p-RIPK3 (S227) в цитозоле клеток, инфицированных HSV-1 ICP6mutRHIM. Сигнал p-RIPK3 (S227) достигал насыщения, когда мощность лазера была установлена на уровне 2% (рисунок 2A). Количественная оценка трехмерных изображений z-стека (см. этап 9) показала приблизительное 20-кратное увеличение числа вокселей, которые были положительными для p-RIPK3 (S227) в HSV-1 ICP6mutRHIM-инфицированных по сравнению с имитированными обработанными клетками (рисунок 2B). Исключение первичного антитела против p-RIPK3 (S227) из протокола окрашивания, опосредованного TSA, в качестве контроля без первичного (NP) не давало обнаруживаемого сигнала. Для визуализации клеток, инфицированных HSV-1 ICP6mutRHIM, образцы были окрашены совместно с первичным антителом, направленным против непосредственного раннего вирусного белка ICP0 (рисунок 2A). В клетках, обработанных имитацией, присутствовал низкий, но обнаруживаемый сигнал p-RIPK3 (S227), который может представлять собой конститутивное автофосфорилирование человеческого RIPK3 на этом участке5 (см. обсуждение). В соответствии с предыдущим отчетом28, RHIM ICP6 не может полностью блокировать фосфорилирование RIPK3 S227, поскольку мы обнаружили повышенное окрашивание p-RIPK3 (S227) клеток, инфицированных ВПГ-1 дикого типа (ВПГ-1WT; Рисунок 2А,В). Для дальнейшей проверки специфичности сигнала p-RIPK3 (S227) клетки обрабатывали ингибитором киназы RIPK3 GSK'840 до заражения. GSK'840 связывается с киназным доменом RIPK3, предотвращая его активность и тем самым ингибируя его аутофосфорилирование29. GSK'840 предотвращал фосфорилирование RIPK3 при S227 при активации ZBP1 (рисунок 2A,B), подтверждая специфичность метода обнаружения P-RIPK3 (S227), опосредованного TSA.
Для последующего фосфорилирования MLKL, маркера конечной стадии некроптоза, ZBP1-экспрессирующие HT-29 клетки были инфицированы HSV-1 ICP6mutRHIM в течение 8 ч и 10 ч. Клетки окрашивали антителом против фосфорилированного MLKL S358 (p-MLKL [S358]) с использованием TSA. Обработанные макетом клетки показали низкое и несколько пунктатное цитозольное окрашивание p-MLKL (S358), в то время как сильное окрашивание p-MLKL было обнаружено в цитозоле, ядре. и на плазматической мембране в клетках, которые были инфицированы HSV-1 ICP6mutRHIM (рисунок 3A). Более того, сигнал p-MLKL (S358) наблюдался в кластерах. Это соответствует порообразующим функциям активированных фосфорилированных олигомеров MLKL на клеточной мембране и его недавно зарегистрированной ядерной транслокации при инфекции гриппа А 1,2,6,30. В качестве положительного контроля окрашивания p-MLKL (S358) мы стимулировали ZBP1-экспрессирующие клетки HT-29 комбинацией TNF, миметического BV6 SMAC и ингибитора панкаспазы zVAD-fmk для индуцирования TNFR1-опосредованного некроптоза (рисунок 3A). Исключение первичного антитела против p-MLKL (S358) из протокола окрашивания, опосредованного TSA, в качестве первичного контроля не давало обнаруживаемого сигнала.
Затем мы провели параллельное сравнение иммунофлуоресцентного окрашивания p-MLKL (S358) с TSA и без него. ZBP1-экспрессирующие клетки HT-29 были инфицированы в течение 9 ч HSV-1 ICP6mutRHIM. В то время как лазерная мощность 40% была необходима для обнаружения специфического сигнала p-MLKL (S358) в инфицированных клетках с использованием стандартной непрямой иммунофлуоресценции, образцы, обработанные TSA, уже достигали насыщающих сигналов при мощности лазера 6% без увеличения фонового окрашивания в образцах, обработанных имитацией (рисунок 3B). Кроме того, количественная оценка трехмерных изображений z-стека показала более чем 10-кратное увеличение числа вокселей, которые были положительными для p-MLKL (S358) при использовании TSA по сравнению со стандартной непрямой иммунофлуоресценцией. Это показывает, что TSA улучшает как порог обнаружения, так и чувствительность для p-MLKL (S358; Рисунок 3C).
Наконец, чтобы проверить протокол иммунофлуоресценции, опосредованный TSA, для других ZBP1-зависимых вирусных стимулов некроптоза, мы заразили ZBP1-экспрессирующие клетки HT-29 штаммом PR8 вируса гриппа A (IAV) в течение 9 ч. IAV индуцирует как ZBP1-опосредованный апоптоз, так и некроптоз в клетках человека30. Действительно, TSA позволила надежно обнаружить p-RIPK3 (S227) и p-MLKL (S358), что свидетельствует о том, что эти клетки подвергаются некроптозу (рисунок 4A-D).
Рисунок 1: Схематическое представление протокола TSA. Клетки высеваются и стимулируются в пластине лунки, совместимой с высококачественной микроскопией. После этого образцы фиксируются в 4% PFA, пермеабилизируются и блокируются для предотвращения аспецифического связывания первичных антител. Чтобы визуализировать фосфорилированные RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) и MLKL (p-MLKL [S358]), специфические антитела, распознающие эти ключевые участки фосфорилирования, инкубируются в течение ночи в камере визуализации. Далее добавляют вторичное антитело, связанное с пероксидазой хрена (HRP). Эта группа HRP позволяет активировать биотинилированный тирамид в присутствииH2O2. Впоследствии активный биотин-тирамид ковалентно соединяется с остатками тирозина в непосредственной близости от меченого HRP вторичного антитела. К ним относятся тирозины на белках, представляющих интерес , в данном случае p-RIPK3 или p-MLKL, как показано на рисунке, — и тирозины соседних белков, а также на самих первичных и вторичных антителах (не показаны). Этот этап усиления тирамидного сигнала значительно повышает чувствительность протокола окрашивания. На заключительном этапе стрептавидин, соединенный с флуоресцентной группой, добавляют для визуализации биотинилированных молекул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: HSV-1 ICP6mutRHIM индуцирует ZBP1-зависимое фосфорилирование человеческого RIPK3 в S227. (A) Репрезентативные конфокальные изображения человеческих ZBP1-экспрессирующих HT-29 клеток, сравнивая окрашивание TSA со стандартным непрямым (без TSA) протоколом иммунофлуоресцентного окрашивания для p-RIPK3 (S227). Образцы, инфицированные имитацией и вирусом (ВПГ-1WT или ВПГ-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]), инкубировали в течение 9 ч. В качестве отрицательного контроля был включен ингибитор киназы RIPK3 GSK'840 (1 мкМ). Включен контроль без первичного (NP) окрашивания клеток, инфицированных HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) в течение 9 ч, в котором были опущены как первичные анти-p-RIPK3 (S227), так и ICP0 антитела. Мощность лазера, необходимая для обнаружения конкретного сигнала p-RIPK3 (S227), указана на изображениях. ICP0 использовался для окрашивания инфицированных вирусом клеток, а DAPI использовался для окрашивания ядра. Шкалы составляют 10 мкм. (B) Относительная количественная оценка вокселей p-RIPK3 (S227)+ с использованием протокола окрашивания TSA. Каждая точка представляет изображение, а красная полоса представляет медиану. Значения количества вокселя представлены относительно медианы количества вокселей изображений в имитационном состоянии. Статистика была сделана с использованием одностороннего ANOVA с несколькими сравнениями с использованием коррекции Tukey. p > 0,05 (н.с.), p≤ 0,05 (*), p≤ 0,01 (**). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: HSV-1 ICP6mutRHIM индуцирует ZBP1-зависимое фосфорилирование человеческого MLKL в S358. (A) Репрезентативные конфокальные изображения человеческих ZBP1-экспрессирующих HT-29 клеток. Клетки либо имитировали, либо инфицировали HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) в течение 8 ч и 10 ч. TSA использовали для обнаружения p-MLKL (S358). ICP0 использовался для окрашивания инфицированных вирусом клеток, а DAPI использовался для окрашивания ядра. Показан контроль без первичного (NP) окрашивания клеток, которые были инфицированы в течение 10 ч HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5), в котором первичный анти-p-MLKL (S358) был опущен. В качестве положительного контроля клетки стимулировали в течение 4 ч 30 нг/мл TNF, 5 мкМ BV6 и 20 мкМ ZVAD-fmk, что индуцирует некроптоз через TNFR1. Шкала составляет 10 мкм. (B) Репрезентативные конфокальные изображения человеческих ZBP1-экспрессирующих клеток HT-29, сравнивая окрашивание TSA со стандартным непрямым (без TSA) протоколом иммунофлуоресцентного окрашивания для p-MLKL (S358). Клетки либо имитировали, либо инфицировали ВПГ-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) в течение 9 ч. Включен контроль окрашивания NP клеток, инфицированных HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) в течение 9 ч, в котором были опущены первичные анти-p-MLKL (S358) и ICP0 антитела. Мощность лазера, необходимая для обнаружения специфического сигнала p-MLKL (S358), указывается на изображениях. (C) Относительная количественная оценка вокселей p-MLKL (S358)+ с использованием стандартного (без TSA) и протокола окрашивания TSA. Каждая точка представляет изображение, а красная полоса представляет медиану. Значения количества вокселей представлены относительно медианы количества вокселей изображений в имитационном состоянии. Статистика была сделана с использованием одностороннего ANOVA с несколькими сравнениями с использованием коррекции Tukey. p > 0,05 (н.с.), p ≤ 0,0001 (****). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Вирус гриппа А индуцирует ZBP1-зависимое фосфорилирование человеческих RIPK3 и MLKL. (A,C) Репрезентативные конфокальные изображения человеческих ZBP1-экспрессирующих HT-29 клеток. Клетки либо имитировали, либо инфицировали вирусом гриппа А (IAV), штаммом PR8 (MOI = 4) в течение 9 ч и окрашивали для p-RIPK3 (S227; A) или p-MLKL (S358; В) с использованием протокола TSA. Шкала шкалы составляет 10 мкм. (B,D) Относительная количественная оценка p-RIPK3 (S227)+ (B) или p-MLKL (S358; Г) вокселы. Каждая точка в (B,D) представляет изображение, а красная полоса представляет медиану. Значения количества вокселей представлены относительно медианы количества вокселей изображений в имитационном состоянии. Статистика была сделана с помощью теста Манна-Уитни. ≤ 0,05 (*), р ≤ 0,01 (**). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол иммунофлуоресцентного окрашивания описывает использование амплификации тирамидного сигнала (TSA) для повышения чувствительности к сигнальным событиям некроптотического сигнального пути человека, которые трудно обнаружить, включая фосфорилирование RIPK3 и MLKL26. Включение ступени TSA значительно улучшает порог обнаружения p-RIPK3 (S227) и p-MLKL (S358) и повышает чувствительность p-MLKL (S358) деформации. TSA выявила сигнал p-RIPK3 (S227), уже присутствующий в образцах, обработанных макетами. В клетках человека аутофосфорилирование RIPK3 при S227 является предпосылкой для активации некроптоза, обеспечивая стабильное взаимодействие с MLKL. Этот процесс уже происходит на базальных уровнях и приводит к образованию стабильного неактивного димера p-RIPK3 (S227)/MLKL до индукции некроптоза 2,5,31. Аналогичным образом, антитело против p-RIPK3, используемое в этом исследовании, также обнаруживает p-RIPK3 (S227) в необработанных клетках с помощью вестерн-блоттинга26.
Фосфорилирование MLKL RIPK3 в цикле активации при T357 и S358 приводит к диссоциации неактивного комплекса p-RIPK3 (S227)/MLKL и вызывает конформационное изменение, в результате чего MLKL подвергает свой N-концевой четырехспиральный пучок пучка. Активированный p-MLKL затем олигомеризуется и транспортируется к клеточной мембране, где он вставляет свои четыре спиральных пучка в липидный бислой, что приводит к лизису клеток 1,2,6. Используя этот протокол иммунофлуоресценции TSA, мы обнаружили сильное увеличение фосфорилирования S358 MLKL во время ZBP1-индуцированного некроптоза. p-MLKL (S358) группировался внутри цитозола и плазматической мембраны и также был обнаружен в ядре при активации ZBP1. Действительно, сообщалось, что ZBP1 стимулирует MLKL-опосредованное возмущение ядерной мембраны в контексте инфекции IAV 8,30. Следует, однако, отметить, что TSA не только откладывает биотин-тирамид на интересующем антигене и первичных/вторичных антителах, но и на соседних белках. Поэтому TSA не идеально подходит для вывода информации о точной субклеточной локализации обнаруженных белков, и мы не рекомендуем TSA для исследований колокализации.
Повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания влияют на стабильность биотинилированного тирамида. Чтобы не допустить снижения чувствительности сигнала, рекомендуем аликвотировать тирамид и использовать свежую аликвоту для каждого эксперимента. Следует соблюдать осторожность при периодических различиях в запасах биотин-тирамида. Если конечная концентрация биотин-тирамида слишком высока, неспецифический фон усиления TSA будет маскировать специфический сигнал. Чтобы контролировать это, мы рекомендуем титровать каждую новую партию биотин-тирамида и включать контроль без первичного окрашивания, в котором первичное антитело опущено.
В представленном протоколе TSA была ограничена одной целью. Обнаружение фосфорилированных RIPK3 и MLKL не было объединено в одном и том же окрашивании, так как оба первичных антитела были выращены у одного и того же вида. Протокол может быть адаптирован для обнаружения нескольких сигналов, усиленных TSA (например, p-RIPK3 [S227] и p-MLKL [S358]) в одном образце с использованием мультиплексного иммунофлуоресцентного TSA32,33. Наконец, TSA-опосредованная амплификация для иммунофлуоресцентной микроскопии может быть использована для распознавания биомаркеров других сигнальных путей с заявленным плохим отношением сигнал/шум.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить VIB Bioimaging Core за обучение, поддержку и доступ к инструментальному парку. J.N. поддерживается стипендией PhD от Исследовательского фонда Фландрии (FWO). Исследования в группе J.M. были поддержаны грантом Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), грантом для младших исследователей (G031022N) от Исследовательского фонда Фландрии (FWO), грантом CRIG для молодых исследователей, доказательством концепции, а также Гентским университетом. Исследования в группе P.V. были поддержаны EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), старшими исследовательскими грантами FWO (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Фондом против рака (F/2016/865, F/2020/1505), консорциумами CRIG и GIGG и VIB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | - | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
- Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
- Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
- Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
- Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
- Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
- Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
- Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
- Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
- Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
- Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
- Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
- Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
- Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
- Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
- Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
- de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
- Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
- Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
- Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
- Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
- Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
- Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
- Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
- Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
- De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
- Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
- Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
- Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
- Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).
