Summary
Tyramidsignalförstärkning under immunofluorescerande färgning möjliggör känslig detektion av fosforylerad RIPK3 och MLKL under ZBP1-inducerad nekroptos efter HSV-1-infektion.
Abstract
Kinasreceptor-interagerande serin / treoninproteinkinas 3 (RIPK3) och dess substratblandade härstamningskinasdomänliknande (MLKL) är kritiska regulatorer för nekroptos, en inflammatorisk form av celldöd med viktiga antivirala funktioner. Autofosforylering av RIPK3 inducerar fosforylering och aktivering av det porbildande bödelproteinet av nekroptos MLKL. Trafficking och oligomerisering av fosforylerad MLKL vid cellmembranet resulterar i celllys, som är karakteristisk för nekroptotisk celldöd. Nukleinsyrasensorn ZBP1 aktiveras genom bindning till vänsterhänt Z-form dubbelsträngat RNA (Z-RNA) efter infektion med RNA- och DNA-virus. ZBP1-aktivering begränsar virusinfektion genom att inducera reglerad celldöd, inklusive nekroptos, av infekterade värdceller. Immunofluorescensmikroskopi möjliggör visualisering av olika signalsteg nedströms ZBP1-medierad nekroptos per cell. Känsligheten hos standardfluorescensmikroskopi, med användning av nuvarande kommersiellt tillgängliga fosfospecifika antikroppar mot humana RIPK3 och MLKL, utesluter emellertid reproducerbar avbildning av dessa markörer. Här beskriver vi ett optimerat färgningsförfarande för serin (S) fosforylerad RIPK3 (S227) och MLKL (S358) i humana HT-29-celler infekterade med herpes simplexvirus 1 (HSV-1). Införandet av ett tyramidsignalförstärkningssteg (TSA) i det immunofluorescerande färgningsprotokollet möjliggör specifik detektion av S227 fosforylerad RIPK3. Dessutom ökar TSA kraftigt känsligheten för detekteringen av S358 fosforylerad MLKL. Tillsammans möjliggör denna metod visualisering av dessa två kritiska signalhändelser under induktionen av ZBP1-inducerad nekroptos.
Introduction
Receptor-interagerande serin / treoninproteinkinas 3 (RIPK3) och blandad härstamningskinasdomänliknande (MLKL) är centrala regulatorer för nekroptotisk celldöd 1,2. Nekroptos är en lytisk och inflammatorisk form av reglerad celldöd involverad i antiviral immunitet och autoinflammation. Nekroptos av virusinfekterade celler stänger omedelbart av virusreplikation. Celllys efter nekroptosinduktion frigör också skadeassocierade molekylära mönster, vilket stimulerar antiviral immunitet 3,4. Nekroptos initieras genom aktivering av RIPK3 efter RIP-homotypiska interaktionsmotiv (RHIM)-medierade interaktioner med en av tre uppströms aktiverande molekyler: RIPK1 (vid TNF-receptor 1 [TNFR1] engagemang), TIR-domäninnehållande adapterinducerande interferon-β (TRIF; vid Toll-liknande receptor 3 och 4 engagemang) eller den antivirala nukleinsyrasensorn Z-DNA-bindande protein 1 (ZBP1)1,2 . Nekroptossignalering fortsätter genom en serie fosforyleringshändelser som börjar med autofosforylering av RIPK3. Autofosforylering av human RIPK3 vid serin (S)227 inuti dess kinasdomän är en förutsättning för nekroptos genom att möjliggöra interaktion med MLKL och används vanligtvis som en biokemisk markör för human RIPK3-aktivering och nekroptotisk celldöd 1,5. När den väl är aktiverad fosforylerar RIPK3 aktiveringsslingan för MLKL vid treonin (T)357 och S3581. Detta orsakar en förändring i MLKL-konformationen, vilket resulterar i exponering av den N-terminala fyra helix-buntdomänen. MLKL oligomeriserar sedan och trafikerar till cellmembranet där det bildar en por genom införandet av de exponerade fyra helixbuntarna i lipid-dubbelskiktet, vilket så småningom leder till celldöd 2,6.
ZBP1 är en antiviral nukleinsyrasensor som känner igen vänsterhänta Z-formnukleinsyror inklusive dubbelsträngat RNA i Z-konformationen (Z-RNA). Z-RNA-bindning sker via två Zα-domäner placerade vid N-änden av ZBP1. Z-RNA som ackumuleras under RNA- och DNA-virusinfektion tros direkt engagera ZBP1 7,8. Aktiverad ZBP1 rekryterar RIPK3 genom sina centrala RHIMs och inducerar reglerad celldöd, inklusive nekroptos 9,10. Virus har antagit många flyktmekanismer för att motverka ZBP1-inducerad värdcellsnekroptos11. Till exempel har herpes simplexvirus 1 (HSV-1) ribonukleotidreduktasunderenhet 1, känd som ICP6 och kodad av UL39, RHIM vid sin N-ändpunkt som stör ZBP1-medierad RIPK3-aktivering i mänskliga celler12,13,14,15. ZBP1 begränsar inte bara viral replikation, men musstudier har visat att ZBP1-aktivering orsakar inflammatoriska sjukdomar och stimulerar cancerimmunitet 16,17,18,19,20,21. Protokoll som detekterar signalhändelser som inträffar under ZBP1-inducerad nekroptos i mänskliga celler är därför värdefulla för att bedöma ZBP1: s roll i dessa processer.
Tyramidsignalförstärkning (TSA), även kallad katalyserad reporterdeposition (CARD), har utvecklats för att förbättra detektionsgränsen och signal-brusförhållandet i antikroppsbaserade immunanalyser. Under TSA kan vilken primär antikropp som helst användas för att detektera antigenet av intresse. Pepparrotsperoxidas (HRP), kopplat till en sekundär antikropp, katalyserar den lokala uppbyggnaden av biotinylerade tyramidradikaler i närvaro av väteperoxid. Dessa aktiverade biotin-tyramidradikaler reagerar sedan med proximala tyrosinrester för att bilda kovalenta bindningar. Potentiella tyramid-biotinsubstrat inkluderar själva antigenet, de primära och sekundära antikropparna och angränsande proteiner. Således, medan TSA avsevärt förbättrar analysens känslighet, förloras en del av dess rumsliga upplösning. I ett sista steg detekteras biotinmolekyler med hjälp av fluorescerande märkt streptavidin. HRP-reaktionen avsätter många tyramid-biotinmolekyler på eller nära antigenet av intresse. Detta ökar kraftigt antalet streptavidin-fluorokrombindningsställen, vilket kraftigt förstärker analysens känslighet (figur 1). Alternativt kan tyramid kopplas direkt till en fluorokrom, vilket eliminerar behovet av streptavidinkopplade fluoroforer. Proteinimmunhistokemi och DNA/RNA in situ-hybridisering var bland de första metoderna där TSA användes för att förbättra signalintensiteterna22,23. På senare tid har TSA kombinerats med intracellulär flödescytometri24 och masspektrometri25.
Här presenterar vi ett protokoll för att detektera serin 227 fosforylerad human RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) och fosforylerad human MLKL (p-MLKL [S358]) vid aktivering av ZBP1 genom HSV-1-infektion med immunofluorescensmikroskopi. Vi använder en nekroptoskänslig HT-29 human kolorektal adenokarcinomcellinje som transducerades för att stabilt uttrycka human ZBP1. Dessa celler infekterades med en HSV-1-stam som uttryckte ett mutant ICP6-protein (HSV-1 ICP6mutRHIM) i vilket fyra kärnaminosyror i virala RHIM (VQCG) ersattes av alaniner (AAAA), vilket gjorde att ICP6 inte kunde blockera ZBP1-medierad nekroptos13,14,15. För att övervinna problemet med det låga signal-brusförhållandet för de för närvarande kommersiellt tillgängliga antikropparna riktade mot p-RIPK3 och p-MLKL vid immunfärgning26, utför vi ett tyramidsignalförstärkningssteg (TSA) (figur 1), vilket resulterar i robust detektion av humant p-RIPK3 (S227) och förbättrar detektionskänsligheten för humant p-MLKL (S358) med en storleksordning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av biotinylerad tyramid
- Förbered biotinylerad tyramid från biotin-tyramid. För att göra en 10 mM stamlösning, lös 3,6 mg biotin-tyramid i 1 ml DMSO. Förvara den upplösta produkten i alikvoter vid −20 °C för att bevara kvaliteten.
2. Upprätthålla HT-29-celler i odling
OBS: ZBP1-uttryckande HT-29 genererades genom transduktion med en lentivector27 som kodar för human ZBP1.
- Håll ZBP1-uttryckande HT-29-celler i McCoys 5A-medium kompletterat med L-glutamin, natriumpyruvat och 10% fetalt bovint serum (från och med nu kallat fullt medium) och behåll i en inkubator vid 37 ° C med 5% koldioxid. Använd helst celler med lågt passagenummer (mindre än 10). Låt cellerna återhämta sig i minst 5 dagar efter upptiningscykeln innan experimentet börjar.
- För att avlägsna cellerna från odlingskolven, avlägsna mediet och tvätta cellerna med 5 ml PBS (förvärmd till 37 °C). Tillsätt sedan lämplig mängd trypsin/EDTA (0,05 % trypsin respektive 0,032 % EDTA, förvärmd till 37 °C) i cellerna (2 ml för en T75-kolv, 3 ml för en T175-kolv).
- Inkubera cellerna med trypsin/EDTA i upp till 10 minuter i en inkubator vid 37 °C med 5 % koldioxid. Tryck sedan på kolven och kontrollera visuellt om cellerna lossnat från kolven med ett mikroskop med 4x-20x objektiv förstoring.
- Om cellerna inte är helt fristående, inkubera i ytterligare 5 minuter vid 37 °C. När cellerna lossnar, stoppa den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 6 ml fullt medium till kolven.
- Samla cellsuspensionen i ett 15 ml rör. Räkna cellerna med hjälp av en trypan blå fläck för att bedöma livskraften; En utspädning på 1:5 rekommenderas. Fortsätt bara med experimentet om cellernas livskraft överstiger 90%.
3. Starta experimentet, sådd och stimulering av cellerna
- Frö 90,000 ZBP1-uttryckande HT-29-celler i fullt medium i en 1 cm² ytbrunnsplatta som möjliggör avancerad mikroskopi. Använd en slutvolym på 200 μl per brunn.
- Inkubera cellerna över natten vid 37 °C med 5% koldioxid. Tänk på att vissa extra brunnar måste sås för färgningskontroller, vilket förklaras mer detaljerat i steg 5.6.
- När cellerna når 70%-80% sammanflöde, lägg till en nekroptosinducerande stimulans till cellerna. Här infekterades cellerna med HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicitet av infektion [MOI] av 5, definierad som plackbildande enheter (pfu) dividerat med antalet celler; pfu kvantifierades med hjälp av en plackanalys på Vero-celler) i 6 h, 8 h eller 10 h.
- Som en positiv kontroll för nekroptosinduktion, stimulera cellerna i 4 timmar med en nekroptosinducerande cocktail innehållande 30 ng / ml TNF, 20 μM av pan-caspase-hämmaren zVAD-fmk och 5 μM av SMAC-mimetik BV6.
- Som en negativ kontroll för p-RIPK3 (S227) färgning, inkludera GSK'840 (1 μM) för att hämma RIPK3-kinasaktivitet och förhindra autofosforylering av S227. Helst tillsätt hämmaren i ett obehandlat tillstånd och efter nekroptosstimulering. Hämmaren kan tillsättas samtidigt med virusinfektion.
- Förbered stimuleringarna i fullt medium, förvärmt till 37 °C. Använd en slutvolym på 200 μL per brunn för alla stimuleringar.
4. Fixering av cellerna
- Ta bort mediet och tvätta cellerna med 200 μL 1x PBS. Tillsätt sedan 150 μl 4% PFA (redan utjämnad vid rumstemperatur) till cellerna och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
OBS: Om du använder celler som lätt lossnar kan fixeringen av cellerna optimeras enligt följande. Ta bort 100 μL medium från brunnen, så en volym på 100 μL kvarstår på plattan. Tillsätt 100 μl 4% PFA till cellerna. Inkubera cellerna i 5 minuter vid rumstemperatur. Ta sedan bort mediet/fixeringsmedlet från brunnarna och ersätt med 150 μL 4 % PFA. Inkubera cellerna i ytterligare 20 minuter vid rumstemperatur för att säkerställa fullständig fixering av cellerna. - Efter fixering, ta bort 4% PFA och tvätta cellerna 3x med 200 μL 1x PBS. Proverna kan förvaras i ett överskott (>200 μL) av 1x PBS vid 4 °C över natten tills vidare bearbetning.
5. Permeabilisering och primärfärgning
- Ta bort PBS och tillsätt 100 μL permeabiliseringsbuffert (0,5% Triton X-100 i PBS). Inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
- Ta bort permeabiliseringsbufferten och tvätta därefter brunnarna med 100 μL tvättbuffert (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkubera bildkammaren med tvättbuffert i 5 minuter vid rumstemperatur på en lutande laboratorieskakare (20-30 gungrörelser per min).
- För att förhindra ospecifik bindning av primära antikroppar, tillsätt 100 μL blockerande medium och inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar. Alternativt kan detta blockeringssteg ersättas med blockering med 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 i PBS i 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta brunnarna 3x med 100 μL tvättbuffert (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkubera tvättstegen i 5 minuter vid rumstemperatur på en lutande laboratorieskakare.
- När tvättbufferten har avlägsnats tillsätter du de primära antikropparna i bildkammaren och inkuberar natten vid 4 °C. Använd en ändvolym på 100 μL för att täcka brunnen. Under nattens inkubation vid 4 °C ska du inte placera bildkammaren på en lutande laboratorieskakare.
OBS: Anti p-MLKL (S358; utspädning: 1:200) och anti-p-RIPK3 (S227; utspädning: 1:200) delar kanin som värdart och bör därför inte kombineras i en brunn. För att övervaka virusinfektionen, kombinera en primär antikropp mot ett valfritt viralt protein med p-MLKL (S358) eller p-RIPK3 (S227). Här infekterades cellerna med HSV-1-infektion följt av ICP0-färgning (utspädning: 1:50, värdart: mus). - Ta hänsyn till de nödvändiga färgningskontrollerna vid denna tidpunkt. Inkludera alltid ett inget primärt antikroppstillstånd för att visualisera den potentiella bakgrunden till TSA-förstärkningssteget för att ställa in maskeringströskeln (se steg 9).
OBS: Vid ett samfärgningsprotokoll (t.ex. att kombinera p-MLKL [S358] eller p-RIPK3 [S227] med en antikropp mot ett virusprotein) använd också enstaka fläckar. Användningen av enstaka fläckar är viktigt att korrigera för potentiell genomblödningssignal i andra bildkanaler.
6. Tyramidsignalförstärkning (TSA)
- Ta bort den primära antikroppsblandningen och tvätta brunnarna 3x med 100 μL tvättbuffert (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkubera tvättstegen i 5 minuter vid rumstemperatur på en lutande laboratorieskakare.
- Ta bort tvättbufferten och tillsätt 100 μL HRP-märkt sekundär antikropp som känner igen arten av primär antikropp som behöver förstärkas. För att förstärka signalen p-RIPK3 (S227) eller p-MLKL (S358), tillsätt 100 μL antikanin-HRP och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur på en lutande laboratorieskakare.
OBS: Endast p-MLKL (S358) eller p-RIPK3 (S227) kommer att förstärkas. Färgningen av ett viralt protein kommer att visualiseras med hjälp av en standard indirekt färgningsmetod. - Tvätta sedan brunnarna 3x med 100 μL tvättbuffert (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkubera tvättstegen i 5 minuter vid rumstemperatur på en lutande laboratorieskakare.
- I nästa steg tillsätter du den biotinylerade tyramiden till den mikroskopiska plattan. Med hjälp av HRP-gruppen kopplad till de sekundära antikropparna kommer den enzymatiska reaktionen att utlösa bildandet av tyramidradikaler i närheten av det primära målet (här p-MLKL [S358] eller p-RIPK3 [S227]).
- För att aktivera den enzymatiska aktiviteten hos HRP, tillsätt ett oxiderande substrat tillsammans med den biotinylerade tyramiden. För att uppnå detta, komplettera TSA-bufferten (0,1 M borsyra [pH 8,5]) med 0,03 MH2O2; specifikt, ta 5 ml TSA-buffert och tillsätt 5 μL 30%H2O2.
- Späd nu biotin-tyramiden i H2O2-kompletterad TSA-buffert från 1:1 000 till 1:20 000.
OBS: Utspädningsfaktorn för biotin-tyramiden måste optimeras per sats. - Ta bort tvättbufferten från brunnarna och tillsätt utspädd biotintyramid till brunnarna till en slutvolym på 100 μl. Inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter på en lutande laboratorieskakare.
- Tvätta sedan brunnarna 3x med 100 μL tvättbuffert (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkubera tvättstegen i 5 minuter vid rumstemperatur på en lutande laboratorieskakare.
7. Fluoroforer
OBS: Eftersom signalen från den primära antikroppen omvandlas till en biotingrupp visualiseras p-MLKL (S358) och p-RIPK3 (S227) med hjälp av streptavidin kopplat till en fluorofor (fluorofor 568, utspädning: 1:500). Dessutom färgas kärnorna med DAPI (5 μg / ml). Om ett viralt protein ingår i färgningsprotokollet, inkludera en lämplig fluorescerande märkt sekundär antikropp mot värdarten för din primära antikropp. I de representativa resultaten användes en mus anti-ICP0. Som en sekundär antikropp get-antimus kopplad till fluorofor inkluderades 633 (utspädning: 1:1 000).
- Gör färgningsblandningen i tvättbuffert (0,1% Triton X-100 i PBS) som innehåller antikropparna och fläckarna som nämns ovan. Ta bort tvättbufferten, tillsätt 100 μl färgningsblandning och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme på en lutande laboratorieskakare. Håll bildkammaren avskärmad från ljus från detta steg och framåt.
- Tvätta sedan brunnarna 2x med tvättbuffert (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkubera tvättstegen i 5 minuter vid rumstemperatur på en lutande laboratorieskakare.
- Skölj slutligen brunnarna 2x med 1x PBS. Förvara proverna i ett överskott (> 200 μl) av 1x PBS tills avbildning. Alternativt kan du sänka ner proverna i monteringsmedium för att bevara färgningen. Bildkammaren är nu redo att visualiseras på ett konfokalmikroskop.
8. Bildbehandling med konfokalmikroskop
- Slå på konfokalmikroskopet och lasrarna minst 10 minuter före avbildning.
- Använd ett nedsänkningsmål för känslighet. Använd helst 40x eller 63x objektiv förstoring. Innan du bildar, rengör nedsänkningsmålen med linsrengörare med lämpliga bomullstussar. Smutsiga mål (t.ex. på grund av damm) kan resultera i bilder av lägre kvalitet.
- Lägg en överflödig mängd olja på botten av bildkammaren. Tillsätt dessutom en droppe olja på det valda målet.
- Sätt bildkammaren på mikroskopet. Hitta fokusfältet med DAPI-färgning eller med brightfield-avbildning. Flytta vid behov runt bildkammaren för att säkerställa korrekt spridning av nedsänkningsoljan.
- Ställ in nödvändiga bildspår på mikroskopet. Beroende på mikroskopet kan följande steg variera (tabell 1).
OBS: När du ställer in bildspåren, programmera spåren så att kärnfärgningen mäts sist. 405 nm-lasern kan bidra till fotoblekning och därmed förlust av specifik signal i alla kanaler. - För att analysera en komplett cell för närvaron av p-RIPK3 (S227) eller p-MLKL (S358), mät z-stackar som sträcker sig över cellens höjd. Här gjordes z-stackarna av 40 skivor var 0,16 μm, vilket resulterade i ett intervall på 6,22 μm.
| Spår | Laser | Stråldelare | Filter |
| pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) | 561 | MBS -405 + | BP 570-620 + LP645 |
| MBS 488/561/633 + SBS SP615 | |||
| Viral gen: ICP0 | 633 | MBS -405 + | BP 420-480 + LP605 |
| MBS 488/561/633 + SBS LP570 | |||
| Kärna: DAPI | 405 | MBS -405 + | BP 420-480 + BP 495-550 |
| MBS 488/561/633 |
Tabell 1: Bildspår för cellvisualisering.
9. Dataanalys och kvantifiering
- Ladda upp mikroskopiska bilder till programvaran. Använd det utökade fokuset för att visualisera all information om z-stacken i en 2D-bild.
- Programmera sedan analysprotokollet för att extrahera följande information: antalet celler per bild, summan av voxlar som visar p-RIPK3 (S227)+ eller p-MLKL (S358)+ färgning. En voxel representerar en tredimensionell volym, definierad som den tredimensionella motsvarigheten till en pixel.
- För att kvantifiera antalet celler per bild, segmentera kärnan. För att minska bruset i segmenteringsresultaten, lägg till en storleksbegränsning i segmenteringen (>100 μm³). Antalet segmenterade kärnor representerar antalet celler i bilden.
- För att kvantifiera mängden p-RIPK3 (S227)+ eller p-MLKL (S358)+ voxlar, programmera en tröskelbaserad segmentering. Ställ in tröskeln så att ingen signal fångas upp i bilderna utan primär antikropp (NP).
- Anpassa tröskeln ytterligare med hjälp av bilderna från det obehandlade mock-tillståndet. För att säkerställa känslig detektering av signalökningen på grund av nekroptosstimulering, begränsa upptagningen av p-RIPK3 (S227)+ eller p-MLKL (S358)+ voxlar under mockförhållanden genom att ställa in en högre tröskel. Kontrollera alltid det programmerade analysprotokollet i flera bilder från mock-tillståndet och nekroptosinducerande virusinfektion.
- Kör analysen på alla bilduppsättningar. Exportera voxelkvantifieringen och kärnsegmenteringen i en .txt-fil för vidare bearbetning i kalkylprogram.
- Gör en pivottabell med data som visar bildnamnet, kärnkvantifieringen och summan av upptäckta voxlar.
- Dela sedan summan av positiva voxlar med antalet celler i bilden. Detta resulterar i ett relativt värde av positiva voxlar per cell. För att visualisera vikökningen, dela det relativa värdet av p-RIPK3 (S227)+ eller p-MLKL (S358)+ voxlar per cell med medianen för det obehandlade tillståndet (mock).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den immunofluorescerande detektionen av MLKL-fosforylering och särskilt RIPK3-fosforylering i mänskliga celler är tekniskt utmanande26. Vi presenterar här ett förbättrat färgningsprotokoll för humant p-RIPK3 (S227) och p-MLKL (S358) vid aktivering av ZBP1. Protokollet innehåller ett TSA-steg för att förbättra detekteringsgränsen och känsligheten hos de fluorescerande signalerna. För att validera metoden utfördes en jämförelse sida vid sida av den TSA-medierade immunofluorescensen med standard indirekt fluorescerande färgning av både p-RIPK3 (S227) och p-MLKL (S358).
HT-29-celler som uttrycker human ZBP1 infekterades i 9 timmar med en ICP6 RHIM-mutant HSV-1-stam (HSV-1 ICP6mutRHIM) för att inducera ZBP1-medierad nekroptos och RIPK3-fosforylering. HSV-1 ICP6mutRHIM-stammen bär en VQCG till AAAA-mutation inom ICP6 RHIM och kan inte blockera nekroptossignalering nedströms ZBP114,15. Som tidigare rapporterats26 var indirekt standardimmunofluorescens inte tillräckligt känslig för att visualisera RIPK3 S227 fosforylering med den nuvarande kommersiellt tillgängliga antikroppen, även när lasereffekten hos konfokalmikroskopet ökades till 30% (Figur 2A). Däremot möjliggjorde införandet av ett TSA-steg robust detektion av p-RIPK3 (S227) i cytosolen hos celler infekterade med HSV-1 ICP6mutRHIM. P-RIPK3 -signalen (S227) nådde mättnad när lasereffekten ställdes in på 2% (figur 2A). Kvantifiering av de tredimensionella z-stackbilderna (se steg 9) visade en ungefärlig 20-faldig ökning av antalet voxlar som var positiva för p-RIPK3 (S227) i HSV-1 ICP6mutRHIM-infekterade över mockbehandlade celler (figur 2B). Att utelämna den primära anti-p-RIPK3 (S227) antikroppen från det TSA-medierade färgningsprotokollet som en ingen primär (NP) kontroll gav inte en detekterbar signal. För att visualisera HSV-1 ICP6mutRHIM-infekterade celler färgades proverna tillsammans med en primär antikropp riktad mot det omedelbara tidiga virala proteinet ICP0 (figur 2A). En låg men detekterbar p-RIPK3 (S227) signal fanns i de mockbehandlade cellerna, vilket kan representera den konstitutiva autofosforyleringen av human RIPK3 på denna plats5 (se diskussionen). I linje med en tidigare rapport28 kan RHIM för ICP6 inte helt blockera RIPK3 S227-fosforylering, eftersom vi upptäckte ökad p-RIPK3 (S227) färgning av celler infekterade med vildtyp HSV-1 (HSV-1WT; Figur 2A,B). För att ytterligare validera specificiteten hos p-RIPK3 (S227)-signalen behandlades cellerna med RIPK3-kinashämmaren GSK'840 före infektion. GSK'840 binder till kinasdomänen för RIPK3, förhindrar dess aktivitet och hämmar därmed dess autofosforylering29. GSK'840 förhindrade RIPK3-fosforylering vid S227 vid ZBP1-aktivering (figur 2A,B), vilket bekräftade specificiteten hos den TSA-medierade p-RIPK3 (S227) detektionsmetoden.
För att följa MLKL-fosforylering, en slutstegsmarkör för nekroptos, infekterades ZBP1-uttryckande HT-29-celler med HSV-1 ICP6mutRHIM i 8 timmar och 10 timmar. Cellerna färgades med en antikropp mot S358 fosforylerad MLKL (p-MLKL [S358]) med hjälp av TSA. De mockbehandlade cellerna visade låg och något punkterad cytosolisk färgning av p-MLKL (S358), medan stark p-MLKL-färgning detekterades i cytosolkärnan. och vid plasmamembranet i cellerna som infekterades med HSV-1 ICP6mutRHIM (figur 3A). Dessutom observerades p-MLKL (S358) -signalen i kluster. Detta är i linje med de porbildande funktionerna hos aktiverade fosforylerade MLKL-oligomerer vid cellmembranet och dess nyligen rapporterade kärntranslokation vid influensa A-infektion 1,2,6,30. Som en positiv p-MLKL (S358) färgningskontroll stimulerade vi ZBP1-uttryckande HT-29-celler med en kombination av TNF, SMAC-mimetik BV6 och pan-caspase-hämmare zVAD-fmk för att inducera TNFR1-medierad nekroptos (figur 3A). Att utelämna den primära anti-p-MLKL (S358) antikroppen från det TSA-medierade färgningsprotokollet som en ingen primär kontroll gav inte en detekterbar signal.
Därefter utförde vi en jämförelse sida vid sida av p-MLKL (S358) immunofluorescerande färgning med och utan TSA. ZBP1-uttryckande HT-29-celler infekterades i 9 timmar med HSV-1 ICP6mutRHIM. Medan en lasereffekt på 40% behövdes för att detektera en specifik p-MLKL (S358) -signal i de infekterade cellerna med hjälp av standard indirekt immunofluorescens, nådde de TSA-behandlade proverna redan mättande signaler vid en lasereffekt på 6% utan att öka bakgrundsfärgningen i de mockbehandlade proverna (Figur 3B). Dessutom visade kvantifieringen av de tredimensionella z-stackbilderna en över 10-faldig ökning av antalet voxlar som var positiva för p-MLKL (S358) vid användning av TSA jämfört med standard indirekt immunofluorescens. Detta visar att TSA förbättrar både detektionströskeln och känsligheten för p-MLKL (S358; Figur 3C).
Slutligen, för att validera det TSA-medierade immunofluorescensprotokollet för andra ZBP1-beroende nekroptosvirusstimuli, infekterade vi ZBP1-uttryckande HT-29-celler med influensa A-virus (IAV) PR8-stam i 9 timmar. Faktum är att TSA möjliggjorde robust detektion av p-RIPK3 (S227) och p-MLKL (S358), vilket indikerar att dessa celler genomgår nekroptos (figur 4A-D).
Figur 1: Schematisk representation av TSA-protokollet. Cellerna frös och stimuleras i en brunnsplatta, kompatibel med avancerad mikroskopi. Därefter fixeras proverna i 4% PFA, permeabiliseras och blockeras för att förhindra en specifik bindning av primära antikroppar. För att visualisera fosforylerad RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) och MLKL (p-MLKL [S358]) inkuberas specifika antikroppar som känner igen dessa viktiga fosforyleringsställen över natten på bildkammaren. Därefter tillsätts en sekundär antikropp, kopplad till ett hästrädisperoxidas (HRP). Denna HRP-grupp möjliggör aktivering av biotinylerad tyramid i närvaro avH2O2. Därefter kopplas den aktiva biotin-tyramiden kovalent till tyrosinrester i närheten av den HRP-märkta sekundära antikroppen. Dessa inkluderar tyrosiner på proteinerna av intresse-i detta fall p-RIPK3 eller p-MLKL, som anges i figuren-och de hos angränsande proteiner och på de primära och sekundära antikropparna själva (visas inte). Detta tyramidsignalförstärkningssteg ökar kraftigt känsligheten hos färgningsprotokollet. I ett sista steg tillsätts streptavidin kopplat till en fluorescerande grupp för att visualisera de biotinylerade molekylerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: HSV-1 ICP6mutRHIM inducerar ZBP1-beroende fosforylering av human RIPK3 vid S227. (A) Representativa konfokala bilder av humana ZBP1-uttryckande HT-29-celler, som jämför TSA-färgning med ett standard indirekt (ingen TSA) immunofluorescensfärgningsprotokoll för p-RIPK3 (S227). De mock- och virusinfekterade proverna (HSV-1WT eller HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]) inkuberades i 9 timmar. Som en negativ kontroll inkluderades RIPK3-kinashämmaren GSK'840 (1 μM). En ingen primär (NP) färgningskontroll av celler infekterade med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 9 timmar där både de primära anti-p-RIPK3 (S227) och ICP0-antikropparna utelämnades ingår. Den lasereffekt som krävs för att detektera den specifika p-RIPK3 (S227) signalen anges på bilderna. ICP0 användes för att färga de virusinfekterade cellerna, och DAPI användes för att fläcka kärnan. Skalstängerna är 10 μm. (B) Relativ kvantifiering av p-RIPK3 (S227)+ voxlar med hjälp av TSA-färgningsprotokollet. Varje punkt representerar en bild och den röda stapeln representerar medianen. Voxel-räkningsvärden presenteras i förhållande till medianen för voxelantalet för bilder i mock-tillståndet. Statistik gjordes med hjälp av en enkelriktad ANOVA med flera jämförelser med Tukey-korrigering. p > 0,05 (n.s.), p≤ 0,05 (*), p≤ 0,01 (**). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: HSV-1 ICP6mutRHIM inducerar ZBP1-beroende fosforylering av human MLKL vid S358. (A) Representativa konfokala bilder av humana ZBP1-uttryckande HT-29-celler. Cellerna var antingen mockbehandlade eller infekterade med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 8 h och 10 h. TSA användes för att detektera p-MLKL (S358). ICP0 användes för att färga de virusinfekterade cellerna, och DAPI användes för att fläcka kärnan. En ingen primär (NP) färgningskontroll av celler som infekterades i 10 timmar med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) där den primära anti-p-MLKL (S358) utelämnades visas. Som en positiv kontroll stimulerades cellerna i 4 timmar med 30 ng/ml TNF, 5 μM BV6 och 20 μM ZVAD-fmk, vilket inducerar nekroptos via TNFR1. Skalstrecken är 10 μm. (B) Representativa konfokala bilder av humana ZBP1-uttryckande HT-29-celler, som jämför TSA-färgning med ett standard indirekt (ingen TSA) immunofluorescensfärgningsprotokoll för p-MLKL (S358). Cellerna var antingen mockbehandlade eller infekterade med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 9 timmar. En NP-färgningskontroll av celler infekterade med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 9 timmar där de primära anti-p-MLKL (S358) och ICP0-antikropparna utelämnades ingår. Den lasereffekt som krävs för att detektera den specifika p-MLKL -signalen (S358) anges på bilderna. (C) Relativ kvantifiering av p-MLKL (S358)+ voxlar med hjälp av standard (ingen TSA) och TSA-färgningsprotokoll. Varje punkt representerar en bild och den röda stapeln representerar medianen. Voxelräkningsvärdena presenteras i förhållande till medianen för voxelantalet för bilder i mock-tillståndet. Statistik gjordes med hjälp av en enkelriktad ANOVA med flera jämförelser med Tukey-korrigering. p > 0,05 (n.s.), p ≤ 0,0001 (****). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Influensa A-virus inducerar ZBP1-beroende fosforylering av human RIPK3 och MLKL. (A,C) Representativa konfokala bilder av humana ZBP1-uttryckande HT-29-celler. Cellerna var antingen mockbehandlade eller infekterade med influensa A-virus (IAV), PR8-stam (MOI = 4) i 9 timmar och färgade för p-RIPK3 (S227; A) eller p-MLKL (S358; C) med hjälp av TSA-protokollet. Skalstrecken är 10 μm. (B,D) Relativ kvantifiering av p-RIPK3 (S227)+ (B) eller p-MLKL (S358; D) voxlar. Varje punkt i (B,D) representerar en bild och den röda stapeln representerar medianen. Voxelräkningsvärdena presenteras i förhållande till medianen för voxelantalet för bilder i mock-tillståndet. Statistiken gjordes med hjälp av ett Mann-Whitney-test. p≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta immunofluorescerande färgningsprotokoll beskriver användningen av tyramidsignalförstärkning (TSA) för att öka känsligheten för signalhändelser i den humana nekroptotiska signalvägen som är svåra att upptäcka, inklusive fosforylering av RIPK3 och MLKL26. Införandet av ett TSA-steg förbättrar detektionströskeln för p-RIPK3 (S227) och p-MLKL (S358) avsevärt och ökar känsligheten för p-MLKL (S358) -töjning. TSA avslöjade en p-RIPK3 (S227) signal som redan finns i de mock-behandlade proverna. I humana celler är autofosforylering av RIPK3 vid S227 en förutsättning för nekroptosaktivering genom att möjliggöra en stabil interaktion med MLKL. Denna process sker redan på basalnivåer och resulterar i bildandet av en stabil inaktiv p-RIPK3 (S227)/MLKL-dimer före nekroptosinduktion 2,5,31. På liknande sätt detekterar anti-p-RIPK3-antikroppen som används i denna studie också p-RIPK3 (S227) i obehandlade celler genom western blotting26.
Fosforyleringen av MLKL med RIPK3 inom aktiveringsslingan, vid T357 och S358, resulterar i dissociation av det inaktiva p-RIPK3 (S227) / MLKL-komplexet och inducerar en konformationsförändring varigenom MLKL exponerar sin N-terminala fyra helix-buntdomän. Aktiverad p-MLKL oligomeriserar sedan och trafikerar till cellmembranet där den sätter in sina fyra helixbuntar i lipid-dubbelskiktet, vilket resulterar i celllys 1,2,6. Med hjälp av detta TSA-immunofluorescensprotokoll upptäckte vi en stark ökning av S358 MLKL-fosforylering under ZBP1-inducerad nekroptos. p-MLKL (S358) grupperade sig i cytosolen och vid plasmamembranet och hittades också i kärnan vid ZBP1-aktivering. Faktum är att ZBP1 har rapporterats stimulera MLKL-medierad störning av kärnmembranet i samband med IAV-infektion 8,30. Det bör dock noteras att TSA inte bara deponerar biotin-tyramid på antigenet av intresse och de primära / sekundära antikropparna utan också på angränsande proteiner. TSA är därför inte idealiskt för att härleda information om den exakta subcellulära lokaliseringen av de detekterade proteinerna, och vi rekommenderar inte TSA för samlokaliseringsstudier.
Upprepade frys-tina cykler påverkar stabiliteten hos den biotinylerade tyramiden. För att förhindra en minskning av signalkänsligheten rekommenderar vi att du alikvoterar tyramiden och använder en ny alikvot för varje experiment. Försiktighet bör iakttas vid skillnader mellan partier i biotintyramidbestånden. Om den slutliga koncentrationen av biotin-tyramid är för hög kommer icke-specifik bakgrund av TSA-förstärkningen att maskera den specifika signalen. För att kontrollera för detta rekommenderar vi att titrering av varje ny biotin-tyramidbatch och att inkludera en ingen primär färgningskontroll där den primära antikroppen utelämnas.
I det presenterade protokollet var TSA begränsad till ett mål. Detektionen av fosforylerad RIPK3 och MLKL kombinerades inte i samma färgning, eftersom båda primära antikropparna höjdes i samma art. Protokollet skulle kunna anpassas för att detektera flera TSA-förstärkta signaler (t.ex. p-RIPK3 [S227] och p-MLKL [S358]) inom samma prov med användning av multiplex immunofluorescerande TSA32,33. Slutligen kan TSA-medierad förstärkning för immunofluorescensmikroskopi användas för igenkänning av biomarkörer för andra signalvägar med rapporterade dåliga signal-brusförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka VIB Bioimaging Core för utbildning, support och tillgång till instrumentparken. J.N. stöds av ett doktorandstipendium från Research Foundation Flanders (FWO). Forskning i JM-gruppen stöddes av ett Odysseus II-bidrag (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), ett juniorforskningsbidrag (G031022N) från Research Foundation Flanders (FWO), ett CRIG-bidrag för unga utredare och av Gent University. Forskning i P.V.-gruppen stöddes av EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG- och GIGG-konsortier och VIB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | - | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
- Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
- Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
- Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
- Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
- Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
- Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
- Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
- Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
- Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
- Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
- Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
- Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
- Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
- Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
- Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
- de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
- Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
- Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
- Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
- Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
- Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
- Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
- Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
- Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
- De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
- Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
- Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
- Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
- Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).
