Summary
Qui presentiamo un protocollo per esprimere e purificare la Drosophila caspases ricombinante Dronc e Drice e il loro uso nei saggi di clivaggio in vitro .
Abstract
Le caspasi sono proteasi di morte cellulare molto specifiche che sono coinvolte in processi apoptotici e non apoptotici. Mentre il ruolo delle caspasi durante l'apoptosi è stato molto ben definito e molti substrati proteolitici apoptotici delle caspasi sono stati identificati e caratterizzati, il ruolo delle caspasi per i processi non apoptotici non è ben compreso. In particolare, finora sono stati identificati pochi substrati non apoptotici delle caspasi. Qui, al fine di facilitare l'identificazione e la caratterizzazione di potenziali substrati di caspasi, viene descritto un protocollo che consente di testare i substrati candidati nei saggi di clivaggio delle caspasi in vitro . Questo protocollo include la produzione e la purificazione di proteine caspasi ricombinanti, la produzione dei substrati candidati sia ricombinante che in un sistema di espressione libera da cellule e l'effettiva reazione di scissione in vitro seguita da SDS-PAGE e immunoblotting. Questo protocollo è su misura per le Drosophila caspases Dronc e Drice, ma può essere facilmente adattato per le caspasi di altri organismi, compresi i mammiferi.
Introduction
La morte cellulare programmata o apoptosi viene eseguita da una classe di proteasi di morte cellulare altamente specializzate chiamate caspasi (esaminate nel riferimento1). Le caspasi sono proteasi Cys che contengono un residuo di Cys nel sito catalitico. Hanno definito i siti di scissione del consenso e fendono i substrati proteoliticamente dopo i residui di Asp (sebbene anche la Drosophila caspase Dronc sia stata segnalata per scindersi dopo i residui di Glu2). Sono suddivise in caspasi iniziatrici (note anche come apicali o a monte) ed effettrici (boia o a valle). Le caspasi iniziatrici attivano le caspasi effettrici. Ad esempio, nei mammiferi, l'iniziatore caspasi Caspasi-9 fende e attiva l'effettore caspasi Caspasi-33. Allo stesso modo, in Drosophila melanogaster, la caspasi-9-ortologa Dronc fende e attiva la caspasi-3-ortologo Drice 2,4. Durante l'apoptosi, le caspasi effettrici scindono centinaia di substrati portando alla morte della cellula5.
Le caspasi sono sintetizzate come proenzimi inattivi (zimogeni) nella cellula. In questa forma, contengono un prodominio N-terminale, una grande subunità con il Cys catalitico nella porzione centrale del proenzima e una piccola subunità al C-terminale 1 (Figura 1). Il meccanismo di attivazione è diverso tra le caspasi iniziatrici ed effettrici. Le caspasi iniziatrici (Caspase-9, Dronc) richiedono la dimerizzazione per l'attivazione, che avviene per incorporazione in un grande complesso proteico, chiamato apoptosoma6. Per l'incorporazione nell'apoptosoma, Caspase-9 e Dronc portano un dominio di attivazione e reclutamento della caspasi (CARD) nel prodominio N-terminale (Figura 1). La componente apoptosoma Apaf-1 contiene anche una CARD e recluta Caspase-9 o Dronc tramite interazione CARD/CARD nell'apoptosoma 3,6,7. Mentre Caspasi-9 e Dronc possono essere processati proteoliticamente nell'apoptosoma, questa elaborazione non è completamente richiesta per l'attività enzimatica 8,9.
Al contrario, le caspasi effettrici (Caspasi-3, Drice) non portano una CARD nei loro prodomini e non sono incorporate in grandi complessi proteici per l'attivazione1. Dipendono dalla scissione proteolitica da parte della Caspasi-9 attiva o del Dronc1, rispettivamente. La caspasi effettrice attiva forma un tetramero composto da due subunità grandi e due piccole, e quindi contiene due siti catalitici (Figura 1). È importante sottolineare che per questo protocollo, l'espressione ricombinante delle caspasi in E. coli causa l'auto-elaborazione e l'attivazione delle caspasi, tra cui Drice 10 e Dronc 2,8,9,11,12, anche in assenza di Apaf-1. Questo auto-processing consente di eseguire saggi di clivaggio in vitro di substrati candidati con proteina caspasi ricombinante.
Le caspasi non sono solo coinvolte nell'apoptosi, ma possono anche avere molte funzioni non apoptotiche, tra cui proliferazione, differenziazione, migrazione cellulare, potatura neuronale, immunità innata e altre13,14,15. Attualmente non è noto come le cellule possano sopravvivere nonostante contengano caspasi attive durante i processi non apoptotici. È possibile che queste cellule attivino le caspasi solo a livelli sub-letali16 o sequestrino caspasi attive in compartimenti non apoptotici della cellula come la membrana plasmatica17,18. Pertanto, l'identificazione e la verifica di substrati non apoptotici non solo rivelerà come le caspasi mediano i processi non apoptotici, ma potrebbe anche aiutare a capire come le cellule possono sopravvivere in presenza di caspasi attive.
Le proteine candidate come substrati di caspasi possono essere identificate utilizzando metodi genetici e biochimici. Le proteine identificate possono essere controllate per la presenza dei siti di scissione Dronc di consenso. Questo può essere fatto ispezionando visivamente la sequenza proteica o utilizzando strumenti bioinformatici online più sofisticati come CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. Questi strumenti utilizzano i siti di scissione di consenso noti delle caspasi e considerazioni strutturali per prevedere nuovi bersagli di caspasi. Mentre CasCleave incorpora le informazioni di substrati verificati da caspasi-1, -3, -6, -7 e -8 umane, può comunque essere utile anche per gli scopi descritti qui in quanto queste caspasi e i loro siti di scissione del consenso sono ben conservati. Tuttavia, poiché il sito di clivaggio di Dronc non è ben definito (due studi hanno identificato due diversi siti di clivaggio ottimali, TATD / E2 e LALD9), i substrati candidati vengono esaminati anche per la presenza di altri siti di scissione delle caspasi, incluso Drice.
Per convalidare i substrati previsti delle caspasi, sono necessari ulteriori test. Uno di questi test è la dimostrazione che una data caspasi può effettivamente scindere la proteina candidata in vitro. Qui, forniamo un protocollo conveniente per i saggi di scissione delle caspasi in vitro . Utilizzando questo protocollo, i substrati candidati vengono testati con Dronc come caspasi. Possono anche essere testati come substrati di Drice. Sebbene questo protocollo sia scritto per le caspasi Drosophila Dronc e Drice, può anche essere adattato per caspasi di altri organismi.
L'estrazione e la purificazione di Dronc e Drice insieme al test di scissione in vitro devono essere eseguite lo stesso giorno a causa della perdita di attività catalitica da parte di queste caspasi. Questo protocollo è stato modificato e ottimizzato dalle precedenti pubblicazioni 8,9,11,12,21,22. In questo protocollo, quattro diverse proteine della caspasi sono espresse in modo ricombinante nel ceppo BL21 (DE3) di E. coli pLysS. Queste proteine sono: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt e 6xHis-DriceC211A. Ognuna di queste proteine è marcata con 6 residui di istidina (6xHis) al N-terminale per la purificazione. Dronc wt e Dricewt sono le proteine wild-type e possono auto-processarsi nella caspasi attiva dopo l'espressione ricombinante. DroncC318A e DriceC211A codificano forme mutanti di Dronc e Drice che cambiano il residuo catalitico di Cys in un residuo Ala. Questi costrutti sono cataliticamente inattivi e non possono essere auto-processati (vedere la Figura 2A). Sono usati come controlli nel test di scissione. Poiché DriceC211A non può essere auto-processato, viene utilizzato anche come substrato modello per Droncwt nel test di clivaggio in vitro qui descritto.
Protocol
1. Espressione della caspasi ricombinante nei batteri
- Clonare il gene di interesse (caspasi o substrato putativo) in un vettore di espressione batterica con tag N- e/o C-terminali utilizzando protocolli standard23.
NOTA: I tag possono aumentare la solubilità delle proteine ricombinanti e vengono utilizzati per la purificazione delle proteine ricombinanti. Qui, Dronc, Drice e i loro mutanti catalitici vengono clonati nel vettore pET28a, che fornisce un tag N-terminale 6xHis (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-DriceC211A); (per informazioni introduttive cfr. tabella supplementare 1). - Trasformare i vettori con i geni di interesse in cellule competenti di BL21 (DE3) pLysS E. coli utilizzando procedure standard23,24. Placcare la miscela di trasformazione su piastre di agar LB con l'antibiotico appropriato (kanamicina in caso di pET28a) per selezionare i batteri trasformati. (Fare riferimento alla tabella supplementare 2.)
- Prelevare una colonia dalla piastra e inoculare in 5 ml di terreno LB contenente l'antibiotico appropriato per crescere durante la notte a 37 °C a 220 giri/min su una piattaforma di agitazione.
- Il giorno successivo, preparare 30-50 ml (per campione) di terreno LB con antibiotico e aggiungere 1 ml della coltura coltivata durante la notte. La densità ottica a 600 nm (OD600) utilizzando un biofotometro/spettrofotometro dovrebbe essere compresa tra 0,1 e 0,2.
- Coltivare la coltura a 37 °C a 220 giri/min su una piattaforma di agitazione fino a quando OD600 raggiunge 0,6. Controllare l'OD600 ogni ora fino a quando non raggiunge 0,6. Questo richiede circa 2 o 3 ore.
- Per indurre l'espressione di proteine (caspasi), aggiungere IPTG a una concentrazione finale di 0,1-0,2 mM (diluire 1:1.000-1:500 dal materiale di proprietà IPTG, vedere Tabella supplementare 2).
- Coltivare le colture per 3 ore a 30 °C a 220 giri/min.
NOTA: Il tempo e la temperatura dipendono dal tipo di proteina che viene espressa e dalla sua solubilità. Potrebbe essere necessario modificare queste condizioni se vengono espresse caspasi o substrati diversi. - Dopo 3 ore, centrifugare le colture in provette da centrifuga da 50 mL per 20 minuti a 4 °C a 2.000 x g. Scartare il surnatante e procedere con il pellet.
NOTA: il protocollo può essere interrotto a questo punto e continuato in seguito. I pellet batterici possono essere congelati a -80 °C.
2. Estrazione di caspasi ricombinanti su piccola scala
- Rimuovere i tubi congelati con le colture pellettate da -80 °C e tenerli in ghiaccio per 10 minuti per ammorbidire il pellet.
- Dopo 10 minuti, aggiungere 0,6 mL di tampone di lisi cellulare batterica (Tabella supplementare 2) integrato con inibitori della proteasi appena aggiunti, 10 mg/ml di lisozima e 50 U/mL di benzonasi nei tubi contenenti pellet utilizzando un controller per pipette con una pipetta sierologica da 1 ml.
- Con la stessa punta della pipetta, sciogliere il pellet mediante pipettaggio su e giù fino a quando non è visibile una soluzione limpida giallo pallido senza particelle di pellet. Incubare per 30 minuti su ghiaccio.
- Trasferire il lisato in apposite provette da centrifuga e centrifugare i lisati a 17.000 x g per 40 minuti a 4 °C.
- Trasferire i surnatanti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Questo è l'estratto grezzo contenente le caspasi.
- Tenere i tubi sotto ghiaccio e procedere alla purificazione con agarosio Ni-NTA.
3. Purificazione delle caspasi su piccola scala con tag His.
- Aggiungere 0,2 mL del 50% di liquame di Ni-NTA agarosio a ciascuna provetta degli estratti di caspasi dal punto 2.5. Ruotare i tubi su un rotatore end-on-end per 1 ora a 4 °C.
- Dopo 1 h, aggiungere l'estratto con l'agarosio Ni-NTA a 1 mL di colonne di polipropilene con la punta intatta, poste in una griglia. Lasciare riposare per 5 minuti.
- Dopo 5 minuti, rimuovere il cappuccio delle colonne e lasciare che il surnatante fuoriesca dal flusso di gravità.
- Aggiungere con cautela 1 mL del tampone di lavaggio (Tabella supplementare 2) alle colonne senza disturbare la resina impacchettata di agarosio Ni-NTA e lavarla attraverso il flusso per gravità.
- Eseguire la fase di lavaggio tre volte.
- Per l'eluizione delle caspasi, posizionare i tubi di microcentrifuga da 1,5 ml sotto l'ugello di raccolta delle colonne dopo aver completamente drenato il tampone di lavaggio.
- Aggiungere 0,5 mL di tampone di eluizione (integrato con 1x inibitori della proteasi immediatamente prima dell'uso) a ciascuna colonna e raccogliere l'eluato nelle provette da microcentrifuga da 1,5 ml.
NOTA: L'eluato purificato fine sarà di colore trasparente. - Tenere gli eluati sul ghiaccio e misurare la concentrazione di proteine mediante il saggio Bradford25. Confermare la purezza/omogeneità delle caspasi purificate mediante SDS-PAGE seguita dalla colorazione Coomassie Blue26.
NOTA: La resa di una coltura da 50 mL LB varia tra 0,5 e 1,5 mg di proteine caspasi. Dato che per l'eluizione vengono utilizzati 0,5 ml di tampone di eluizione, la concentrazione varia da 1 a 3 mg/ml. È importante utilizzare gli eluati di caspasi purificati per saggi di clivaggio in vitro lo stesso giorno della lisi e della purificazione, poiché questi preparati di caspasi perdono attività durante la notte.
4. Espressione del substrato putativo della caspasi in sistemi di espressione cell-free
NOTA: In questo protocollo, Drice, il substrato naturale di Dronc, è preparato sia dall'espressione ricombinante in E. coli (vedere paragrafo 3 sopra) sia dall'espressione nel lisato dei reticolociti di coniglio (RRL), un sistema di espressione libero da cellule di mammifero (questa sezione, vedere sotto).
- Clonare il gene del substrato putativo in un vettore di espressione contenente un promotore T7, T3 o SP6 utilizzando procedure standard23.
NOTA: In questo protocollo, DriceC211A viene utilizzato come substrato modello ed è stato clonato nel vettore pT7CFE1-N-Myc, che trasporta un promotore T7 per l'espressione genica e tagga il substrato proteico putativo con un tag Myc-terminale per il rilevamento mediante immunoblotting. - In RRL, i substrati candidati possono essere sintetizzati radioattivamente o non radioattivamente.
- Sintesi non radioattiva: in una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml, aggiungere 25 μL di RRL, 2 μL di tampone di reazione, 0,5 μL di miscela di aminoacidi -meno leucina (1 mM), 0,5 μL di miscela di aminoacidi-meno metionina (1 mM), 1 μL di inibitore della ribonucleasi (40 U/μL), 2 μL di DNA Template (0,5 μg/μL) e 1 μL di T7-RNA polimerasi. Aggiungere acqua priva di nucleasi per regolare il volume finale della reazione a 50 μL. Mescolare delicatamente i componenti mediante pipettaggio o agitazione con la punta della pipetta e ruotare brevemente verso il basso.
NOTA: Il lisato di RRL contiene 100-200 mg/ml di proteine endogene. Per le reazioni di traduzione in vitro , aggiungere l'RRL al 50% di concentrazione (qui reazione 25 μL/50 μL). - Sintesi radioattiva: in una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml, aggiungere 25 μL di lisato RRL, 2 μL di tampone di reazione, 0,5 μL di miscela di aminoacidi-meno metionina (1 mM), 1 μL di inibitore della ribonucleasi (40 U/μL), 2 μL di DNA Template (0,5 μg/μL), 2 μL di metionina marcata con S35 (1000 Ci/mmol a 10 mCi/mL) e 1 μL di T7-RNA polimerasi. Aggiungere acqua priva di nucleasi per regolare il volume finale della reazione a 50 μL. Mescolare delicatamente i componenti mediante pipettaggio o agitazione con la punta della pipetta e ruotare brevemente verso il basso. Smaltire punte e tubi in un contenitore per rifiuti radioattivi.
NOTA: Non aggiungere la miscela di aminoacidi senza leucina. Il vettore pT7CFE1 utilizza un promotore T7 per l'espressione proteica. Altri vettori utilizzano promotori T3 o SP6. In tal caso, le RNA polimerasi T3 o SP6 dovrebbero essere utilizzate al posto della T7 RNA polimerasi. Assicurati che il modello di DNA sia di elevata purezza.
- Sintesi non radioattiva: in una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml, aggiungere 25 μL di RRL, 2 μL di tampone di reazione, 0,5 μL di miscela di aminoacidi -meno leucina (1 mM), 0,5 μL di miscela di aminoacidi-meno metionina (1 mM), 1 μL di inibitore della ribonucleasi (40 U/μL), 2 μL di DNA Template (0,5 μg/μL) e 1 μL di T7-RNA polimerasi. Aggiungere acqua priva di nucleasi per regolare il volume finale della reazione a 50 μL. Mescolare delicatamente i componenti mediante pipettaggio o agitazione con la punta della pipetta e ruotare brevemente verso il basso.
- Incubare la reazione a 30 °C per 90 min.
- Girare brevemente per 10 secondi e posizionare i tubi sul ghiaccio. Controllare il livello di espressione del substrato putativo in RRL mediante SDS-PAGE e immunoblotting/autoradiografia.
NOTA: La quantità di estratto di RRL aggiunta alla reazione di scissione deve essere basata sulla quantità di proteine che possono essere rilevate con il metodo di rilevazione (immunoblotting o autoradiografia S35 ). Procedere al test di scissione in vitro (sezione successiva) o conservarlo a -80 °C.
5. Saggio di scissione in vitro con substrati generati con RRL
- Prendere il/i substrato/i putativo/i generato/i, come descritto nella sezione 4. In questo protocollo, N-Myc-DriceC211A viene utilizzato come substrato modello.
- A seconda del livello di espressione del substrato putativo (da determinare separatamente mediante immunoblot o analisi autoradiografica, vedere punto 4.4), utilizzare 1-10 μL di RRL programmato con la proteina di interesse nel test di clivaggio.
- Aggiungere 10 μg di proteina caspasi purificata generata nelle sezioni 1, 2 e 3.
- Portare il volume totale di reazione a 50 μL con tampone di dosaggio della caspasi.
- Incubare le reazioni a bagnomaria a 30 °C per 3 ore. Assicurarsi di includere i controlli appropriati nel test di clivaggio. Qui, il mutante catalitico DroncC318A viene utilizzato come controllo.
- Dopo 3 ore, interrompere le reazioni trasferendo i tubi sul ghiaccio.
- Aggiungere un volume di tampone campione LDS contenente 50 mM DTT. La reazione viene interrotta completamente con l'aggiunta di tampone campione LDS.
- Incubare i campioni a 75 °C in un blocco termico per 10 minuti.
- Centrifugare rapidamente, mescolare scorrendo, caricare 24 μL per campione ed eseguire SDS-PAGE (vedere paragrafo 7) o conservare i campioni a -20 °C.
6. Saggio di clivaggio in vitro con proteina di substrato ricombinante espressa battericamente
- Aggiungere 10 μg di substrato candidato purificato (qui 6xHis-DriceC211A, generato nelle sezioni 1, 2 e 3) in una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml.
- Aggiungere 10 μg delle proteine delle caspasi purificate generate nelle sezioni 1 e 2. Portare il volume totale a 50 μL utilizzando il tampone di analisi della caspasi.
- Seguire i passaggi da 5.5 a 5.9.
7. SDS-PAGE e immunoblotting
- Caricare le reazioni di scissione (24 μL) su gel tris-glicina o bis-tris gradiente 4%-12% (tabella dei materiali) ed eseguire elettroforesi proteica e immunoblotting (o autoradiografia se si utilizzano substrati marcati con S35) per visualizzare i risultati utilizzando procedure standard27,28.
NOTA: Qui, in questo protocollo, sono stati utilizzati gel gradiente Bis-Tris con buffer di esecuzione Mops e buffer di carico LDS. In generale, i protocolli PAGE comunemente usati dei gel Tris-Glycine vengono eseguiti utilizzando il buffer di esecuzione Tris-Glycine-SDS e il buffer di caricamento SDS funzionano bene.
Representative Results
Questo protocollo fornisce istruzioni passo-passo per l'induzione della proteina caspasi in E. coli, la purificazione delle caspasi ricombinanti Drosophila Dronc e Drice, la sintesi di substrati candidati e la reazione di scissione in vitro con substrati candidati (qui DriceC211A) e la caspasi Dronc. Il mutante catalitico DriceC211A è stato utilizzato come substrato modello in questo test perché non ha attività di auto-elaborazione (Figura 2A) e rimane a tutta lunghezza fino a quando non viene scisso da Droncwt. DriceC211A deve sempre essere usato come controllo positivo per convalidare che il preparato Droncwt abbia attività enzimatica.
La figura 2A fornisce un esempio rappresentativo dell'espressione e della purificazione delle caspasi ricombinanti. Sono state indotte e purificate quattro diverse caspasi ricombinanti: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt e 6xHis-DriceC211A. Le caspasi purificate sono state eseguite da SDS-PAGE, immunoblotted, e la macchia è stata sondata con un anticorpo anti-His (diluito 1:5.000; seguito da IgG anti-topo, anticorpo legato all'HRP (1:10.000)). Il 6xHis-Dronc non elaborato (proDronc) funziona con un peso molecolare relativo (MW r) di 55 kDa (corsia 2) e 6xHis-Drice non elaborato (proDrice) ha un MWr di 35 kDa (corsia 4). L'auto-elaborazione delle caspasi è visibile dalla comparsa di bande di MWr più piccole che a causa della presenza del tag His-all'N-terminale rappresentano le grandi subunità delle caspasi (Figura 1). Nel caso di 6x-Dronc, la grande subunità ha un MWr di 40 kDa (corsia 1). La grande subunità di 6x-Drice corre a 23 kDa (corsia 3). I mutanti catalitici 6xHis-DroncC318A e 6xHis-DriceC211A non riescono ad auto-processarsi e sono rilevabili solo come proteine a lunghezza intera (corsie 2 e 4).
Figura 2B Per dimostrare che il preparato di 6xHis-Droncwt prodotto e purificato battericamente ha attività enzimatica, è stato eseguito un test di clivaggio in vitro come descritto in questo protocollo. Come controllo negativo, è stato utilizzato il mutante catalitico 6xHis-DroncC318A. Il substrato era N-Myc-DriceC211A generato da RRL, che è etichettato con un tag Myc al capolinea N. Dopo la reazione di scissione in vitro, le proteine sono state separate da SDS-PAGE, immunoblotted e le macchie sono state incubate con un anticorpo anti-Myc (diluito 1:1.000) seguito da anti-topo IgG, anticorpo HRP-linked (1:10.000)) per rilevare N-Myc-DriceC211A. La scissione riuscita e quindi l'attività enzimatica della caspasi possono essere dimostrate dalla comparsa di almeno una banda di MWr più piccoli rispetto alla forma intera e non trasformata del substrato. N-Myc-Drice C211A non lavorato, a lunghezza intera ha un MWr di 40 kDa (corsie 2 e 4), mentre la grande subunità di N-Myc-DriceC211A lavorata corre a 30 kDa (corsia 3). La corsia 1 rappresenta il lisato RRL non programmato (nessun plasmide/trascritto aggiunto). La corsia 2 dimostra la produzione in vitro di DriceC211A mediante espressione RRL. La corsia 3 contiene la reazione di scissione in vitro con 6xHis-Droncwt. La corsia 4 contiene la reazione di scissione in vitro con 6xHis-DroncC318A.
Figura 2C Una reazione di scissione in vitro che utilizza sia caspasi ricombinante che purificata (6xHis-Droncwt e 6x-His-DroncC318A) e substrato (6xHis-DriceC211A) secondo questo protocollo, è stata analizzata da SDS-PAGE e immunoblot. Per l'analisi della reazione di scissione, in questo immunoblot è stato utilizzato l'anticorpo anti-scissione Drice (diluito 1:5.000; seguito da anticorpo anti-coniglio IgG, HRP-linked (1:10.000)) L'anticorpo anti-scisso Drice rileva il suo neoepitopo nella grande subunità (23 kDa) di 6xHis-DriceC211A solo dopo l'elaborazione da parte di 6xHis-Droncwt (corsia 1). Il mutante catalitico 6xHis-DroncC318A non è in grado di elaborare 6xHis-Drice C211A in questo test e il 6xHis-DriceC211A a lunghezza intera appare come una debole banda non elaborata di 35 kDa (corsia 2).
Figura 1: Struttura del dominio delle caspasi iniziatrici Caspase-9 e Dronc e delle caspasi effettrici Caspasi-3 e Drice. CARD - dominio di attivazione e reclutamento delle caspasi; Cys - posizione relativa del residuo catalitico di cisteina; L - grande subunità; S - piccola subunità. Viene indicata la posizione dei prodomini N-terminali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi . (A) Analisi immunoblot di preparati ricombinanti purificati 6xHis-Dronc e 6xHis-Drice, sondati con un anticorpo anti-He. Non trasformati (proDronc e proDrice) e scissi 6xHis-Dronc e 6xHis-Drice sono indicati da frecce. I marcatori MW sono indicati a sinistra. (B) Analisi immunoblot della reazione di scissione in vitro di N-Myc-Drice generato da RRL con caspasi 6xHis-Droncwt (corsia 3) o 6x-His-DroncC318A (corsia 4) sondata con un anticorpo anti-Myc. Le reazioni RRL non programmate e programmate (N-Myc-DriceC211A) vengono caricate e separate nelle corsie 1 e 2. N-Myc-Drice non lavorato (proDrice) e scisso sono indicati da frecce. I marcatori MW sono indicati a sinistra. (C) Analisi immunoblot della reazione di scissione in vitro di 6xHis-DriceC211A ricombinante battericamente espresso e purificato con caspasi 6xHis-Droncwt (corsia 1) o 6x-His-DroncC318A (corsia 2), sondato con un anticorpo Drice anti-scissione. La lunghezza intera (proDrice) e la 6xHis-DriceC211A sono indicate da frecce. I marcatori MW sono indicati a sinistra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella supplementare 1: Questa tabella contiene i primer utilizzati per la clonazione nel vettore pET28a. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 2: Questa tabella contiene la composizione dei buffer e dei supporti. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
La maggior parte delle nostre conoscenze sulle caspasi e sulla funzione delle caspasi è derivata da un intenso lavoro sull'apoptosi negli ultimi tre decenni. E' ben noto che le caspasi iniziatrici processano proteoliticamente le caspasi effettrici e centinaia di proteine sono state identificate come substrati effettrici delle caspasi durante l'apoptosi 5,29. Al contrario, si sa molto meno sulla funzione delle caspasi per i processi non apoptotici e su quali substrati non apoptotici stanno elaborando. È concepibile che le caspasi dell'iniziatore siano i decisori chiave qui. Durante l'apoptosi, attivano le caspasi effettrici causando la morte cellulare. Tuttavia, per innescare processi non apoptotici, possono attivare diverse proteine (diverse dalle caspasi effettrici), che controllano il processo non apoptotico. Questo protocollo testa le proteine candidate come substrati dell'iniziatore caspasi Dronc in Drosophila 17,30.
I substrati da testare nel test di clivaggio possono essere prodotti sia in un sistema di espressione libera da cellule di mammifero in vitro come RRL o mediante espressione ricombinante in E. coli. Ci sono diversi vantaggi per l'espressione in vitro utilizzando RRL rispetto all'espressione batterica. Il protocollo di espressione RRL è semplice e veloce, consentendo di preparare molti substrati diversi in parallelo. In molti casi, l'estratto RRL contenente la proteina di interesse può essere conservato a -80 °C prima dell'uso nel test di scissione (anche se questo deve essere determinato separatamente per ciascun substrato). Il substrato putativo può essere etichettato con S35-Met, che consente una facile analisi mediante autoradiografia dopo SDS-PAGE. Ciò è particolarmente utile, se non è disponibile alcun anticorpo specifico del substrato. In alternativa, se l'etichettatura S35-Met non è desiderata, il substrato putativo può essere etichettato con tag comuni come tag Flag, HA o Myc, che consentono il rilevamento della scissione della caspasi mediante immunoblotting.
Va sottolineato con forza che il successo di questo protocollo dipende dalla purificazione attenta e coerente delle proteine ricombinanti Dronc e Drice. Sfortunatamente, queste proteine non possono essere conservate – nemmeno a breve termine – né in frigorifero né congelate. Perdono l'attività enzimatica durante la notte in qualsiasi forma memorizzata. Pertanto, devono essere preparati freschi il giorno del test di scissione. Indipendentemente dalla proteina o dalle proteine candidate testate, DriceC211A deve sempre essere usato come controllo positivo per convalidare l'attività enzimatica del preparato Droncwt (vedere Figura 2B,C). In alternativa, l'attività dei preparati Dronc e Drice può anche essere testata mediante scissione in vitro di substrati tetrapeptidici sintetici fluorogenici 2,9,31.
Se gli anticorpi vengono utilizzati per rilevare i substrati candidati, devono essere convalidati dall'utente32,33. Ciò vale anche per gli anticorpi disponibili in commercio che rilevano tag epitopi come Flag, HA, Myc o altri. Una scarsa qualità degli anticorpi può oscurare risultati importanti. Si raccomanda inoltre la marcatura a doppio epitopo dei substrati candidati sia sul terminale N che su quello C con tag diversi34. Se si verifica una scissione, la doppia marcatura aiuta a tracciare entrambi i prodotti di scissione e può aiutare a chiarire se la scissione si verifica in uno o più siti.
Mentre questo protocollo convalida facilmente il noto substrato biologico di Dronc, Drice, ci sono anche limitazioni. Una limitazione è che si tratta di un protocollo in vitro con proteine ricombinanti. In questi saggi, le caspasi sono presenti ad una concentrazione non fisiologicamente elevata, che è evidente dall'osservazione che possono auto-processarsi spontaneamente in E. coli. L'auto-elaborazione spontanea di solito non si verifica nelle condizioni fisiologiche. Questa elevata concentrazione di caspasi può causare attività spuria con conseguente falsi positivi. I falsi positivi possono essere eliminati abbassando la concentrazione di caspasi nella reazione di scissione in vitro . Inoltre, come descritto più dettagliatamente di seguito, sono necessari ulteriori test per confermare i substrati originali ed eliminare i falsi positivi.
Le caspasi ricombinanti potrebbero non avere la stessa specificità che hanno nel loro normale ambiente cellulare in vivo. Ad esempio, l'attività delle caspasi può essere modificata da modifiche post-traduzionali. Questi non sono presenti sulle proteine ricombinanti. Inoltre, in vivo, le caspasi iniziatrici, incluso Dronc, sono incorporate in grandi complessi proteici come l'apoptosoma. Nelle condizioni di questo protocollo, la formazione dell'apoptosoma non viene raggiunta. Ciò richiederebbe l'espressione ricombinante di Drosophila Apaf-1 (aka Dark o Hac-1) 35-37 che ha sfide proprie. Pertanto, in vitro, Dronc potrebbe non avere la stessa specificità che ha in vivo.
È anche concepibile che Dronc sia incorporato in un diverso complesso proteico per processi non apoptotici. Ciò potrebbe conferire una diversa specificità di scissione a Dronc, il che potrebbe anche spiegare perché Dronc non induce apoptosi in condizioni non apoptotiche. In relazione a questo, CasCleave utilizza i siti di consenso di scissione noti per prevedere nuovi substrati di caspasi. Tuttavia, non è noto se gli stessi siti di consenso di scissione siano utilizzati anche per processi non apoptotici. Infatti, recentemente, è stato dimostrato che la Caspasi-3 cambia il suo sito di consenso preferito durante un processo non apoptotico nel tronco cerebrale uditivo in via di sviluppo nell'embrione di pulcino38. Allo stesso modo, se le caspasi iniziatrici sono incorporate in diversi complessi proteici, possono avere una specificità diversa e quindi possono scindersi in diverse sequenze di consenso.
Queste limitazioni illustrano che non è sufficiente fare affidamento esclusivamente sui test di clivaggio in vitro descritti in questo protocollo. Approcci alternativi dovrebbero essere impiegati per convalidare ulteriormente i risultati ottenuti utilizzando questo protocollo. Idealmente, i saggi in vivo dovrebbero essere utilizzati per rispondere alle seguenti domande: la proteina candidata viene processata proteoliticamente durante il processo non apoptotico in vivo? In caso affermativo, lo stesso sito di scissione viene utilizzato in vivo e in vitro? Qual è la conseguenza se la scissione è bloccata dalla mutagenesi del sito di scissione? La lavorazione del substrato candidato dipende dalle caspasi e, in caso affermativo, quale? Qual è il ruolo dei frammenti di scissione per il processo non apoptotico? Queste domande possono essere facilmente affrontate negli organismi modello genetici come C. elegans e Drosophila utilizzando metodi genetici e transgenici standard.
In sintesi, questo protocollo descrive un metodo affidabile e coerente per produrre caspasi enzimaticamente attive, in particolare le Drosophila caspases Dronc e Drice. L'obiettivo finale di questo protocollo è esaminare se Dronc può scindere i substrati candidati in vitro, che sono stati identificati da approcci genetici, biochimici o bioinformatici. Come spiegato nel paragrafo precedente, sono necessari ulteriori saggi per convalidare queste proteine come substrati di caspasi in vivo. Dato il grado di conservazione dei geni delle caspasi attraverso i metazoi, dovrebbe essere possibile adattare questo protocollo anche alle caspasi di altri organismi.
Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la dottoressa Elif Kamber-Kaya per il suo aiuto nello stabilire il protocollo in laboratorio. Il Dr. Guy Salvesen ha gentilmente fornito il mutante DriceC211A 9. Questo lavoro è stato finanziato da un premio MIRA dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) del National Institutes of Health (NIH) con il numero di sovvenzione 2R35GM118330. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Anti-His antibody | Sigma-Aldrich | MA1-21315 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7076P2 | |
| Anti-Myc antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7074P2 | |
| Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| BioPhotometer | Eppendorf | #6131 | |
| BL21 (DE3) pLysS Competent Cells | Promega | L1195 | |
| Centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023-1G | |
| ChemiDoc with image software | Bio-Rad | Universal Hood II | For Chemiluminiscence imaging |
| Chemiluminiscence Substrate | Thermofisher Scientific | 34095 | For Chemiluminiscence imaging |
| Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody | Cell Signaling Technology | 9478S | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955128 | Used to measure bacterial growth and protein concentration |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610610 | |
| Erlenmeyer flasks, 1000 mL | Millipore sigma | CLS49801L | For LB agar media preparation and autoclaving |
| Erlenmeyer flasks, 250 mL | Millipore sigma | CLS4980250 | For bacterial culture growth and induction. |
| Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Thermofisher Scientific | STM1001 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher scientific | 87786 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| His-Drice-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DriceC211A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-Dronc-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DroncC318A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermofisher Scientific | FERR0392 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LB Agar, Miller (Powder) | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lysozyme | Thermofisher Scientific | 90082 | |
| Microbiological plate incubator | Fisher Scientific | 11-690-650D | For colony growth after transformation |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 22363611 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12243 | |
| Mini tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Motorized Pipette Controller | Gilson | F110120 | For using serological pipettes |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | BP330-1 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well | Thermofisher Scientific | WG1402BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermofisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) | Thermofisher Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Invitrogen | NP00061 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | C25 incubator shaker | |
| Petridish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plating beads | Zymo research | S1001 | For spreading culture on AmpR/KanR plates |
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | 34924 | For purification of His-tagged proteins |
| Precision Plus Protein Standards | Bio-Rad | #161-0374 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| pT7CFE1-NMyc | Thermofisher Scientific | 88863 | For cloning substrates for RRL expression |
| PVDF membrane | Invitrogen | LC2007 | |
| 14 mL Polypropylene round bottom tubes | Fisher Scientific | 352029 | For growing plasmid cultures |
| QiaRack | Qiagen | 19095 | For holding polypropylene columns during purification |
| Refrigerated High speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | |
| rRNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251A | For RRL expression |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sterile Falcon tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Sterile Falcon tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S70903-250G | |
| 1 mL Serological Pipets, Sterile | celltreat | 229001B | For bacterial cell lysis in 50 mL tubes |
| TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 | Promega | L4611 | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Waterbath | Fisher Scientific | 2340 | |
| Western wet transferring cassette | Thermofisher Scientific | STM2001 |
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