Summary
يتم تقديم بروتوكول محسن يتيح استنفاد مراكز تنظيم الأنابيب الدقيقة السيتوبلازمية في بويضات الفئران أثناء الطور الاستوائي الأول باستخدام ليزر الفيمتو ثانية القريب من الأشعة تحت الحمراء.
Abstract
تعد دقة الانقسام الاختزالي للخلايا البيضية أمرا بالغ الأهمية لتوليد بويضات euploid مؤهلة من الناحية التنموية. في الثدييات ، تخضع البويضة لاعتقال طويل في المرحلة الأولى من الانقسام الاختزالي الأول. بعد البلوغ وعند الاستئناف الاختزالي ، يتفكك الغشاء النووي (انهيار الغلاف النووي) ، ويتم تجميع المغزل بشكل أساسي في مركز البويضة. يعد وضع المغزل المركزي الأولي ضروريا للحماية من مرفقات الأنابيب الدقيقة الحركية (MT) غير الطبيعية واختلال الصيغة الصبغية. يهاجر المغزل ذو الموقع المركزي بطريقة حساسة للوقت نحو القشرة ، وهذه عملية ضرورية لقذف جسم قطبي صغير. في الخلايا الانقسامية ، يعتمد وضع المغزل على التفاعل بين MTs النجمي بوساطة المركز وقشرة الخلية. على العكس من ذلك ، تفتقر بويضات الفئران إلى الجسيمات المركزية الكلاسيكية ، وبدلا من ذلك ، تحتوي على العديد من مراكز تنظيم MT اللامركزية (MTOCs). في المرحلة الفوقية الأولى ، تحتوي بويضات الفئران على مجموعتين مختلفتين من MTOCs: (1) MTOCs التي يتم تجميعها وفرزها لتجميع أقطاب المغزل (MTOCs القطبية) ، و (2) MTOCs السيتوبلازمية الطورية (mcMTOCs) التي تبقى في السيتوبلازم ولا تساهم بشكل مباشر في تكوين المغزل ولكنها تلعب دورا حاسما في تنظيم وضع المغزل وهجرة المغزل في الوقت المناسب. هنا ، يتم وصف طريقة الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتونات لاستنفاد mcMTOCs الموسومة داخليا بشكل انتقائي في البويضات التي تم جمعها من الفئران المراسلة Cep192-eGfp . تساهم هذه الطريقة في فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء وضع المغزل والهجرة في بويضات الثدييات.
Introduction
تنتج الجاميتات الأحادية الصيغة الصبغية (الحيوانات المنوية والخلايا البيضية) من خلال الانقسام الميوزي، الذي يستلزم جولة واحدة من تضاعف الحمض النووي (DNA) يتبعها قسمان متتاليان ضروريان لتقليل عدد الكروموسومات قبل الإخصاب. في الثدييات ، خلال الحياة الجنينية المبكرة ، تخضع الخلية البيضية لتوقف طويل (حتى سن البلوغ) في مرحلة diplotene من الطور التمهيدي الأول من الانقسام الميوتي الأول ، وهي مرحلة تسمى مرحلة الحويصلة الجرثومية (GV). بعد الاستئناف الاختزالي ، تخضع بويضة GV لانهيار الغلاف النووي (NEBD) ، ويتم تجميع المغزل بشكل أساسي في مركز البويضة1،2،3. في وقت لاحق ، مدفوعا ب F-actin ، يهاجر المغزل في الوقت المناسب من مركز البويضة إلى القشرة لضمان الانقسام غير المتماثل للغاية ، مما ينتج عنه بيضة ذات جسم قطبي صغير (PB) 4،5،6.
في الخلايا الانقسامية ، تتكون الجسيمات المركزية من زوج من المراكز المركزية محاطة بمكونات مادة شبه مركزية (PMC) ، مثل pericentrin و γ-tubulin و Cep152 و Cep1927. تساهم هذه الجسيمات المركزية المحتوية على المركز المركزي في دقة تكوين المغزل ثنائي القطب8. ومع ذلك ، يتم فقدان المراكز المركزية أثناء تكوين البويضات المبكر في أنواع مختلفة ، بما في ذلك القوارض9. لذلك ، تتبنى بويضات الفأر مسار تجميع مغزل مستقل عن المركز باستخدام العديد من مراكز تنظيم الأنابيب الدقيقة المركزية (MTOCs)9،10. عند الاستئناف الاختزالي ، تخضع MTOCs المحيطة بالنواة لثلاث خطوات متميزة من التكثيف والتمدد والتجزئة إلى عدد كبير من MTOCsالأصغر 11,12. ثم يتم تجميع MTOCs المجزأة وفرزها لتنظيم مغزل ثنائي القطب10،13،14. توجد مجموعة أخرى من MTOCs في السيتوبلازم أثناء NEBD. تهاجر بعض هذه MTOCs السيتوبلازمية وتشكل أقطاب مغزل (MTOCs القطبية ، pMTOCs)10,11. في الآونة الأخيرة ، تم اكتشاف مجموعة فرعية أخرى من MTOCs السيتوبلازمية ، تسمى MTOCs السيتوبلازمية الطورية (mcMTOCs) ، والتي لا تساهم في تكوين قطب المغزل ولكنها تبقى في سيتوبلازم الخلية البيضية أثناء الطور الاستوائي الأول (Met I)15. يؤدي استنفاد mcMTOCs عن طريق الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتونات أو زيادة أعدادها بشكل غير طبيعي عن طريق تثبيط الالتهام الذاتي إلى اضطراب وضع المغزل والهجرة ويزيد من حدوث اختلال الصيغة الصبغية في بويضات الطور الثاني15.
ومن المثير للاهتمام ، أن mcMTOCs تختلف عن pMTOCs في العديد من الجوانب15. على سبيل المثال ، على عكس pMTOCs ، التي تنشأ بشكل أساسي من MTOCs المحيطة بالنواة ، تنشأ mcMTOCs من قشرة البويضة. عندما يكون المغزل لا يزال في مركز البويضة ، يتم توطين mcMTOCs بشكل غير متماثل مقابل الجانب الذي يهاجر إليه المغزل من أجل بثق PB15. لا يمكن ل MTs الشبيهة بالنجوم الوصول إلى القشرة في الخلية البيضية الكبيرة نسبيا. لذلك ، تقوم هذه MCMTOCs بنواة MTs لتثبيت المغزل (عبر MTOCs الشبيهة بالنجمية) إلى القشرة. تشير هذه النتائج إلى نموذج تتصدى فيه قوة MT ذات النواة mcMTOC للقوة بوساطة F-actin التي تدفع هجرة المغزل نحو القشرة. التوازن بين هاتين القوتين المتعارضتين ضروري لتنظيم وضع المغزل المركزي وهجرة المغزل في الوقت المناسب15.
حتى الآن ، تتمركز جميع بروتينات PMC التي تم فحصها (pericentrin و g-tubulin و Cep192 و Aurora kinase A) في كل من تجمعات MTOC: mcMTOCs و pMTOCs15. لذلك ، لا يوجد نهج كيميائي أو وراثي لإزعاج mcMTOCs بشكل انتقائي دون إزعاج pMTOCs. يمكن التحايل على هذه القيود عن طريق استهداف mcMTOCs بشكل انتقائي باستخدام الاجتثاث بالليزر. من بين التقنيات القائمة على الليزر التي تم تطويرها للاستئصال الدقيق ، تظهر ليزر الفيمتو ثانية النبضي متعدد الفوتون إمكانات كبيرة بسبب تأثيرها الدقيق الذي يقتصر على المستوى البؤري ، وعمق الاختراق العالي للضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء ، وانخفاض السمية الضوئية والأضرار الحرارية للخلية16،17،18. يصف هذا العمل نهجا انتقائيا لاستئصال mcMTOCs في بويضات الفئران باستخدام ليزر متعدد الفوتونات مقترن بمجهر مقلوب.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل جامعة ميسوري (رقم ضمان جودة رعاية الحيوان 9695). تم استخدام الفئران الإناث مراسلة Cep192-eGFP الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع في الدراسة الحالية. لتوليد فئران مراسلة Cep192-eGFP ، تم استخدام الإصلاح الموجه بالتماثل بوساطة CRISPR / Cas9 لدمج جين مراسل EGFP في جينوم الفأر CF-1. تم دمج مراسل EGFP في المحطة C ل Cep192 (جزء لا يتجزأ من MTOCs)15. للحفاظ على مستعمرة الفأر ، تم استخدام الفئران المراسلة Cep192-eGfp متماثلة الزيجوت. تم الاحتفاظ بجميع الحيوانات في أقفاص (حتى أربعة / قفص) عند 21 درجة مئوية ورطوبة 55٪ ، مع دورة ضوئية / مظلمة لمدة 12 ساعة وإمكانية الوصول إلى الطعام والماء .
1. جمع بويضات الفأر
- قم بإعداد وسط الاستزراع (Chatot و Ziomek و Bavister ، CZB19 ، انظر جدول المواد) ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن تخزين وسط CZB عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد (انظر الملف التكميلي 1 لتكوين الوسائط). - استكمل وسط CZB بالجلوتامين (1 مللي مول) والميلرينون (2.5 مللي مول) (CZB + M) (انظر جدول المواد) ، وضعه في الحاضنة.
ملاحظة: ميلرينون هو مثبط فسفوديستراز يحافظ على البويضات المحتجزة في الطور التمهيدي الأول ويمنع استئناف الانقسام الاختزالي20. - قم بإعداد وسط التجميع (الحد الأدنى من الوسط الأساسي الخالي من البيكربونات ، MEM) الذي يحتوي على 3 مجم / مل بولي فينيل بيروليدون (PVP) ، 25 مللي مول HEPES (درجة الحموضة 7.3) (الملف التكميلي 1) ، وميلرينون (2.5 مللي متر) (MEM / PVP + M ، انظر جدول المواد).
- قم بإعداد أطباق التجميع والثقافة ، وقم بعمل أربع قطرات صغيرة (100 ميكرولتر) من وسط التجميع (MEM / PVP + M) وقطرتين صغيرتين (100 ميكرولتر) من وسط الثقافة (CZB + M) في أطباق بتري 60 مم و 35 مم ، على التوالي ، وقم بتغطيتها بالزيت المعدني (انظر جدول المواد). احتفظ بطبق التجميع على الشريحة أكثر دفئا ، وضع طبق الاستزراع في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- حقن داخل الصفاق 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل (PMSG ، انظر جدول المواد) في الفئران الإناث الناضجة جنسيا (6-8 أسابيع) Cep192-eGFP المراسلة 44-48 ساعة قبل جمع البويضات.
- التضحية بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم ، وتحديد وإزالة المبيضين21 ، ونقلها إلى زجاج ساعة يحتوي على وسط تجميع مسبق التسخين (MEM / PVP + M) عند 37 درجة مئوية.
- ثبت المبيض عن طريق لمس حقنة سعة 1 مل في أسفل زجاج الساعة وثقبها عدة مرات (~ 40 مرة لكل مبيض) باستخدام إبر الخياطة المجمعة معا لتحرير البويضات في الوسط.
- باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، انقل كل الوسط الذي يحتوي على مجمعات الركام والبويضة (COCs) من الخطوة 1.7 إلى طبق بتري بلاستيكي فارغ 100 مم.
- تحت المجهر المجسم ، اجمع موانع الحمل الفموية باستخدام ماصة زجاجية باستور ، وانقلها إلى طبق التجميع الذي يحتوي على MEM / PVP + M.
- باستخدام ماصة زجاجية ضيقة من باستور (قطرها حوالي 100 ميكرومتر) ، قم بتجريد البويضات ميكانيكيا عن طريق سحب الريش المتكرر اللطيف ، متبوعا بنقلها وغسلها في أربع قطرات صغيرة من (100 ميكرولتر) MEM / PVP + M (طبق التجميع) قبل نقلها إلى طبق الاستزراع CZB + M.
- احتضان البويضات العارية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء.
2. الحقن المجهري للبويضات
- ضع قطرة 250 ميكرولتر من MEM / PVP + M في غطاء طبق بتري بلاستيكي 100 مم ، وقم بتغطيته بالزيت المعدني.
ملاحظة: يحتوي غطاء طبق بتري على حافة سفلية توفر مساحة أكبر لضبط المعالج الدقيق. - قم بتشغيل نظام الحقن المجهري (انظر جدول المواد).
- ضع طبق الحقن المجهري على مرحلة التسخين (37 درجة مئوية) من المجهر.
- قم بتحميل إبرة الحقن ب 0.5 ميكرولتر من mCh-Cep192cRNA باستخدام أطراف ماصة microloader (انظر جدول المواد) ، وقم بتأمين إبرة الحقن في المعالج الدقيق.
- انقل البويضات العارية (الخطوة 1.11) إلى ميكرودروب 250 ميكرولتر (الخطوة 2.1).
- تحت عدسة موضوعية 20x أو 40x ، اضبط موضع وتركيز الحقن وإبر الإمساك وفقا لموضع البويضة (الشكل 1).
- قم بإعداد وحدة الحقن المجهري ، واضبط ضغط الحقن (p i) ، وضغط التعويض (pc) ، ووقت الحقن (ti) لتتمكن من حقن 5-10 pl من mCh-Cep192 cRNA (لتسمية MTOCs خارجيا).
- حقن بعناية البويضات دون لمس النواة.
- بمجرد حقن جميع البويضات ، اغسلها في ثلاث قطرات صغيرة من CZB + M ، وانقلها إلى طبق الاستزراع (CZB + M) ، واحتضنها لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية للسماح بتعبير mCh-Cep192.
3. نضوج البويضة
- تحضير وسط النضج عن طريق إضافة الجلوتامين (1 mM) إلى وسط CZB المتوازن مسبقا في حاضنة مع 5٪ CO2 في الهواء عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات على الأقل.
- اصنع قطرتين صغيرتين (100 ميكرولتر) من وسط النضج في طبق بتري 35 مم ، وقم بتغطيتهما بالزيت المعدني (طبق النضج).
- اغسل البويضات المسحوبة من الطور الأول ثلاث مرات على الأقل في 100 ميكروقطرات ميكروبية خالية من ميلرينون لإزالة الميلرينون تماما والسماح باستئناف الانقسام الاختزالي.
- انقل البويضات إلى طبق النضج ، واحتضنها لمدة 5 ساعات (المرحلة الأولى من البروميتا) في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 في الهواء عند 37 درجة مئوية.
4. إعداد البويضة للاستئصال والتصوير
- انقل بويضات الطور الأولي (الخطوة 3.4) إلى طبق استزراع ذو قاع زجاجي يحتوي على 100 ميكرولتر من وسط النضج (الخطوة 3.1) مغطى بالزيت المعدني.
5. إعداد المجهر للاجتثاث
- قبل 30 دقيقة على الأقل من الاجتثاث ، قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة لحاضنة المسرح (انظر جدول المواد) واضبطها على 37 درجة مئوية.
- قم بتشغيل وحدة التحكم CO 2 واضبطها على 5٪ CO2.
- حدد هدفا أبوكروماتيا للغمر بالزيت 40x ، وقم بتطبيق قطرة صغيرة من زيت الغمر.
- قم بتركيب طبق الاستزراع ذو القاع الزجاجي مع البويضات على حاضنة أعلى المسرح ، وقم بتغطية الحاضنة بغطاء غاز.
- في برنامج الحصول على الصور (انظر جدول المواد) ، حدد خيارا يتيح حفظ مواضع مراحل متعددة (على سبيل المثال ، "تحديد العلامة والعثور على التجربة"). باستخدام إضاءة الضوء المنقول ، ركز على البويضات الفردية واحفظ مواقعها.
- في برنامج الحصول على الصور ، حدد وضع المسح الضوئي XYZ ، واضبط تنسيق الصورة على 256 × 256 بكسل ، واضبط عامل التكبير / التصغير على 2.5x - 3.0x ، وحدد تردد المسح الضوئي 600 هرتز. هذا يتوافق مع وقت سكون بكسل يبلغ حوالي 1.6 μs.
- اضبط خط ليزر إثارة 488 نانومتر عند حوالي 10٪ من طاقة الليزر (التي تتوافق مع 4.0 μW على مستوى العينة) (انظر جدول المواد) ، واستخدم عرض النطاق الطيفي من 500-550 نانومتر لمراقبة إشارة GFP من MTOCs. للمراقبة المتزامنة للتألق من Cep192 الموسومة ب mCherry ، اضبط خط ليزر إثارة 585 نانومتر عند حوالي 8٪ من طاقة الليزر (التي تتوافق مع 10.7 μW على مستوى العينة) ، واستخدم كاشفا آخر مضبوطا على عرض النطاق الطيفي 595-645 نانومتر.
ملاحظة: من المفيد استخدام كاشف الضوء المرسل (TLD) الخاص بالمجهر متحد البؤر للكشف المتزامن عن حدود الخلايا البيضية. - باستخدام وضع المسح المباشر والتحكم اليدوي في محرك z-drive ، قم بفحص البويضة بحثا عن MTOCs.
- بمجرد اكتشاف mcMTOC ، ارسم منطقة ذات أهمية مربعة (ROI) حولها.
6. الاجتثاث من mcMTOCs
- اضبط ليزر الفيمتو ثانية على طول موجي 740 نانومتر.
ملاحظة: يمكن تغيير الطول الموجي لليزر وفقا للمجهر وظروف الليزر. - استخدم المغير الكهروضوئي للمجهر متعدد الفوتون (انظر جدول المواد) لضبط طاقة الليزر على 70٪ -80٪ ، أي ما يعادل طاقة 60-70 ميجاوات في مستوى العينة.
ملاحظة: إذا كان الليزر مزودا بمعوض نبضة الفيمتو ثانية ، فاستخدمه لتصحيح تشتت تأخير المجموعة (GDD). يقلل تصحيح GDD من كمية طاقة الليزر المطلوبة لاستئصال mcMTOC بكفاءة ويقلل من التلف الضوئي للبويضة. عادة ما يتم دمج التحكم GDD مع برنامج الحصول على الصور للمجاهر التجارية متعددة الفوتونات. - استخدم نفس تنسيق الصورة وعامل التكبير/التصغير وتكرار المسح الضوئي كما في الخطوة 5.6. اضبط معلمات متوسط الخط والإطار على 1.
- انقر فوق الزر Scan في البرنامج لإجراء استئصال mcMTOC عن طريق إجراء مسح ليزر واحد لعائد الاستثمار المحدد.
- استخدم إعدادات القناة من الخطوة 5.7 لمراجعة نتائج الاجتثاث من خلال مقارنة صور الهياكل التي تحمل علامة GFP التي تم التقاطها قبل وبعد التعرض لليزر متعدد الفوتونات. إذا نجح الاجتثاث ، فإن شدة مضان GFP في mcMTOC المستهدف تنخفض إلى المستويات التي لوحظت في الخلفية.
- إذا بقيت بعض أجزاء بنية تسمية GFP ، كرر الخطوة 6.4 مرة واحدة أو أكثر من خلال التركيز على مستويات z المختلفة من mcMTOC.
- استخدم إعدادات القناة من الخطوة 5.7 للتحقق من كفاءة الاجتثاث عن طريق الفقد الكامل لإشارات mCherry المرتبطة ب mcMTOC (mCh-Cep192).
- كرر الخطوة 5.8 إلى الخطوة 6.7 حتى يتم استئصال جميع MTOCs للخلية البيضية (في المستويات البؤرية المختلفة).
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول الحقن المجهري mCh-Cep192 كاستراتيجية لتأكيد استنفاد mcMTOC بعد التعرض لليزر متعدد الفوتونات واستبعاد احتمال أن يكون فقدان مضان GFP ناتجا عن التبييض الضوئي GFP. ومع ذلك ، فإن الحقن المجهري لهذا المسبار اختياري وغير مطلوب لإجراء الاجتثاث.
Representative Results
يوفر الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتونات طريقة فعالة لاستئصال الهياكل داخل الخلايا بشكل انتقائي. استخدمت الدراسة الحالية الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتونات لاستنفاد mcMTOCs في بويضات الفئران بشكل انتقائي. أدى الاجتثاث بالليزر إلى استنفاد MCMTOCs بكفاءة ، كما يتضح من انخفاض مضان GFP الداخلي في mcMTOCs المستهدفة إلى مستوى مماثل للخلفية. كما تم إلغاء mCh-Cep192 الخارجي في mcMTOCs المستهدفة بعد الاستئصال بالليزر. يجب إجراء الاستئصال بالليزر ل mcMTOCs على مستويات بؤرية مختلفة داخل البويضة (حيث توجد mcMTOCs ، الشكل 2) لضمان استنفاد جميع mcMTOCs داخل البويضة (الشكل 3).
الشكل 1: الحقن المجهري للبويضات. الحقن المجهري لبويضة فأر متوقفة في الطور الأول مع mCh-Cep192 cRNA. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: استنفاد mcMTOCs في بويضات الفئران. صور تمثيلية للطائرات البؤرية المفردة. تشير المربعات البيضاء إلى mcMTOC قبل وبعد الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتونات. شريط المقياس: 40 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: استنفاد mcMTOCs في مستويات بؤرية مختلفة في بويضة الفأر. صور الإسقاط القصوى التمثيلية لبويضة فأر تم استئصالها بواسطة mcMTOC. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الملف التكميلي 1: تركيبات Chatot و Ziomek و Bavister (CZB) والوسط الأساسي الأدنى الخالي من البيكربونات (MEM / PVP). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
توجد طرق مختلفة لإزعاج الهياكل المرتبطة بالهيكل الخلوي داخل الخلايا22،23،24،25. ومع ذلك ، فإن إيجاد تقنيات فعالة لإزعاج البنية المستهدفة بشكل انتقائي دون المساس بصلاحية الخلية يمثل تحديا. طريقة الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتونات المعروضة هنا هي استراتيجية فعالة للحث على اضطراب ميكانيكي انتقائي ل mcMTOCs داخل البويضة دون تغيير صلاحية البويضة.
تم استخدام الاستئصال بالليزر على نطاق واسع لفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في فصل الكروموسومات أثناء الانقسام والانقسام الاختزالي22،23،26،27. نظرا للحجم الكبير نسبيا (>80 مم في القطر) لبويضات الثدييات مقارنة بالخلايا الجسدية28 ، فإن استئصال هياكلها داخل الخلايا يمثل تحديا. علاوة على ذلك ، فإن متوسط حجم mcMTOC في بويضات الطور الأول هو ~ 20 ميكرومتر15 ، مما يمثل تحديا إضافيا. يجب اعتماد طريقة فعالة توفر اختراقا أعمق للأنسجة للتغلب على هذه التحديات. الميزة الرئيسية لاستخدام الليزر متعدد الفوتونات للاستئصال هي قدرته على الوصول إلى عمق الخلية مع تقليل التأثيرات خارج الهدف29.
للتحقق من فعالية وكفاءة طريقة الاستئصال بالليزر لاستنفاد البنية المستهدفة ، يوصى باستخدام بروتين موسوم بالفلورسنت لتحديد البنية المستهدفة بمرور الوقت (قبل وبعد الاستئصال)23. من المهم ملاحظة أن الاجتثاث بالليزر يستنفد mcMTOC بالكامل كهيكل ، وعلى الرغم من أن mcMTOCs الأصغر تتطلب تعرضا واحدا فقط لليزر ليتم استنفادها ، فقد تتطلب mcMTOCs الأكبر حجما أكثر من تعرض ليزر واحد في مستويات بؤرية مختلفة. يوصى أيضا بإصلاح مجموعة فرعية من البويضات الضابطة والخلايا الاستئصالية المستأصلة ب mcMTOC وتسميتها المناعية باستخدام علامة MTOC (مثل γ-tubulin أو pericentrin أو Cep192) لتأكيد كفاءة استئصال mcMTOC بشكل أكبر. في البويضات الضابطة ، ستتعرض مناطق السيتوبلازم المجاورة ل mcMTOCs ولكنها لا تتداخل معها لليزر.
تتطلب هذه التجربة العديد من عمليات استئصال mcMTOC أثناء التنقل بين المستويات البؤرية المختلفة داخل البويضات. لذلك ، يوصى بشدة بممارسة هذه التقنية عدة مرات قبل تنفيذ التجربة لتقليل وقت التجربة ، وبالتالي زيادة صلاحية البويضة. علاوة على ذلك ، من المهم استخدام الحد الأدنى من طاقة الليزر الكافية لاستنفاد mcMTOCs دون التأثير على صلاحية البويضة.
هذه التقنية لها بعض القيود. أولا ، المجاهر متحدة البؤر متعددة الفوتونات أغلى نسبيا من المجاهر متحدة البؤر العادية. ثانيا ، إن إزعاج جميع MCMTOCs في مستويات بؤرية مختلفة يستغرق وقتا أطول من الاضطرابات الكيميائية أو الجينية. ثالثا ، يتطلب هذا البروتوكول مهارات تقنية لاستئصال جميع mcMTOCs في أقصر وقت ممكن. ومع ذلك ، بمجرد إتقانه ، يوفر استخدام الليزر متعدد الفوتونات استراتيجية ممتازة لإزعاج العديد من الهياكل داخل الخلايا في بويضات الفئران ، بما في ذلك mcMTOCs ، مما يساهم في فهم الآليات الجزيئية التي تنظم وضع المغزل وهجرته في الوقت المناسب في بويضات الثدييات.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مختبر بالبولا على مساعدتهم ومناقشاتهم القيمة. يشكر المؤلفون ميلينا شوه على تفضلها بمشاركة بنية mCherry-Cep192. تم دعم هذه الدراسة من قبل R35GM142537 (NIGMS ، NIH) إلى AZB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
| Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
| Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
| Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
| Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
| Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
| CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
| CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
| DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
| DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
| EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
| Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
| Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
| Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
| Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
| Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
| Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
| Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
| Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
| L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
| Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
| MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
| mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
| Medium Essential Medium Eagle - MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
| Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
| Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 - 1L | |
| Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
| Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
| Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
| Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
| Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
| Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
| Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
| Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
| Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
| Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
| Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
| Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
| Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
| The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |
References
- Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes. Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).
- Hashimoto, N., Kishimoto, T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation. Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes. Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).
- Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes. Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).
- Schuh, M., Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).
- Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. Pericentriolar material. Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).
- Hinchcliffe, E. H. The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other. Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes. Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).
- Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
- Clift, D., Schuh, M. A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes. Nature Communications. 6, 7217 (2015).
- Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis. Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Breuer, M., et al. HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells. Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).
- Londoño-Vásquez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes. Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).
- Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses. Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).
- Pavin, N., Tolic, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).
- Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study. Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).
- Bennabi, I., Manil-Segalen, M. Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).
- Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells. Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).
- Warzych, E., Lipinska, P. Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation. Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
