Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल दबाव अधिभार कार्डियक हाइपरट्रॉफी को प्रेरित करने के लिए चूहों में महाधमनी बैंडिंग की एक नई तकनीक का वर्णन करता है। बैंडिंग के लिए, एक निश्चित आंतरिक व्यास के साथ एक रबर रिंग का उपयोग किया जाता है। यह नई तकनीक भविष्य के प्रयोगों के लिए कम विचरण और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा का वादा करती है।
Abstract
चूहों में महाधमनी बैंडिंग कार्डियक प्रेशर ओवरलोड-प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रॉफी और दिल की विफलता के प्रेरण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले प्रयोगात्मक मॉडल में से एक है। पहले इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक स्टेनोसिस बनाने के लिए एक कुंद 27 जी सुई पर बंधे महाधमनी आर्क के चारों ओर एक थ्रेडेड सीवन पर आधारित है। यह विधि सर्जन द्वारा धागे को मैन्युअल रूप से कसने पर निर्भर करती है और इस प्रकार, व्यास के आकार में उच्च भिन्नता की ओर ले जाती है। मेलेबी एट अल द्वारा वर्णित एक नई परिष्कृत विधि सर्जरी के बाद कम विचरण और अधिक प्रजनन क्षमता का वादा करती है। नई तकनीक, ओ-रिंग-महाधमनी बैंडिंग (ओआरएबी), एक धागे के साथ एक सीवन के बजाय एक गैर-स्लिप रबर रिंग का उपयोग करती है, जिसके परिणामस्वरूप दबाव अधिभार और कार्डियक हाइपरट्रॉफी के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फेनोटाइप में भिन्नता कम हो जाती है। सर्जरी के दौरान, ओ-रिंग को ब्राचियोसेफेलिक और बाएं कैरोटिड धमनियों के बीच रखा जाता है। इकोकार्डियोग्राफी द्वारा सफल कसना की पुष्टि की जाती है। 1 दिन के बाद, अंगूठी के सही प्लेसमेंट के परिणामस्वरूप ओ-रिंग-प्रेरित स्टेनोसिस पर अनुप्रस्थ महाधमनी में प्रवाह वेग में वृद्धि होती है। 2 सप्ताह के बाद, बिगड़ा हुआ हृदय समारोह कम इजेक्शन अंश और दीवार की मोटाई में वृद्धि से साबित होता है। महत्वपूर्ण रूप से, व्यास के आकार में कम भिन्नता के अलावा, ओआरएबी अनुप्रस्थ महाधमनी कसना (टीएसी) की तुलना में कम इंट्रा-और पोस्ट-ऑपरेटिव मृत्यु दर से जुड़ा हुआ है। इस प्रकार, ओआरएबी आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली टीएसी सर्जरी के लिए एक बेहतर विधि का प्रतिनिधित्व करता है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम और आवश्यक जानवरों की संख्या में संभावित कमी होती है।
Introduction
जबकि शारीरिक कार्डियक हाइपरट्रॉफी को विकास, व्यायाम और गर्भावस्था के दौरान देखा जा सकता है, पैथोलॉजिकल कार्डियक हाइपरट्रॉफी हेमोडायनामिक तनाव स्थितियों जैसे धमनी उच्च रक्तचाप, वाल्वुलर हृदय रोग, या जीन उत्परिवर्तन का जवाब देती है। प्रारंभ में, हृदय कार्डियोमायोसाइट आकार में वृद्धि और हृदय समारोह1,2 को बनाए रखने के लिए वेंट्रिकुलर दीवारों के मोटे होने की विशेषता वाले रीमॉडेलिंग से गुजरता है। दूसरी ओर, पैथोलॉजिकल कार्डियक रीमॉडेलिंग अतालता, अचानक मृत्यु और उच्च मृत्यु दर के लिए बढ़ते जोखिम से जुड़ा हुआ है। अंत में, समय के साथ, इसके परिणामस्वरूप वेंट्रिकुलर फैलाव, सिकुड़ा हुआ कार्य में एक मजबूत कमी, और अंततः दिल की विफलता (एचएफ) की प्रगति होती है, जो उच्च रुग्णता, मृत्यु दर और सामाजिक लागतसे जुड़ी होती है। इसलिए, नई चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए आणविक पृष्ठभूमि को समझने की तत्काल आवश्यकताहै।
महाधमनी बैंडिंग एक मॉडल है जो चूहों में दबाव अधिभार-प्रेरित बाएं वेंट्रिकुलर (एलवी) हाइपरट्रॉफी और दिल की विफलता की नकल करताहै। इस विधि के साथ, विवो में दबाव अधिभार-प्रेरित कार्डियक रीमॉडेलिंग के पैथोमैकेनिज्म की जांच करना संभव है। चूहों में पहली महाधमनी बैंडिंग प्रक्रिया रॉकमैन एट अल.6 द्वारा रिपोर्ट की गई थी। दबाव अधिभार महाधमनी के चारों ओर एक धागा सीवन-आधारित बंधाव (ब्राचियोसेफेलिक और बाएं आम कैरोटिड धमनी के बीच) से प्रेरित होता है। 0.4 मिमी व्यास स्टेनोसिस बनाने के लिए, एक सीवन को 27 ग्राम सुई और महाधमनी के चारों ओर रखा जाता है। बंधाव के बाद, सुई को 6,7 हटा दिया जाता है।
भले ही सुई का व्यास तय हो, धागे की जकड़न सर्जन पर अत्यधिक निर्भर है और इसलिए, कार्डियक हाइपरट्रॉफी के प्रेरित फेनोटाइप को प्रभावित करती है। इसके अलावा, थ्रेड / सीवन-आधारित विधि में, सर्जरी के बाद स्टेनोसिस व्यास की एक चर डिग्री होती है, जो मृत्यु दर 8,9 में उच्च भिन्नता से जुड़ी होती है। इसके अलावा, इस विधि को प्रशिक्षित करना चुनौतीपूर्ण है, खासकर धागे को कसने में सही स्तर और स्थिरता खोजने के बारे में। अंत में, प्रशिक्षण की शुरुआत में, महाधमनी या अन्य ऊतक की चोट के विघटन के कारण उच्च इंट्रा-और पोस्ट-ऑपरेटिव मृत्यु दर होती है, साथ ही जीवित जानवरों में स्टेनोसिस की सीमा में उच्च भिन्नता होती है।
हाल ही में, महाधमनी बैंडिंग की एक अनुकूलित प्रक्रिया मेलेबी एट अल.10 द्वारा वर्णित की गई थी। उन्होंने 0.71 मिमी, 0.66 मिमी और 0.61 मिमी के निश्चित आंतरिक व्यास के साथ एक गैर-स्लिप रबर ओ-रिंग का उपयोग करके स्टेनोसिस में कम भिन्नता और दबाव अधिभार के अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्तरों के साथ ओआरएबी (ओ-रिंग महाधमनी बैंडिंग) विधि प्रस्तुत की। संक्षेप में, ओ-रिंग को खोला जाता है, आरोही मेहराब के चारों ओर रखा जाता है, और धागे द्वारा फिर से बंद किया जाता है। इन ओ-रिंग्स का उपयोग करने वाले अन्य वैज्ञानिकों ने प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रॉफी9 में कम परिवर्तनशीलता की सूचना दी। उन्होंने इंट्रा-और पोस्ट-ऑपरेटिव मृत्यु दर, साथ ही बेहतर प्रजनन क्षमता और प्रेरित हाइपरट्रॉफिक फेनोटाइप 9,11 में कम भिन्नता भी देखी। वर्तमान आलेख चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल में इस अद्वितीय रणनीति की प्रक्रिया का वर्णन करता है। इस रिपोर्ट में साझा की गई विशेषज्ञता अन्य वैज्ञानिकों को इस क्षेत्र में अपनी तकनीकों को बेहतर बनाने में मदद करेगी।
कार्डियक हाइपरट्रॉफी को प्रेरित करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप 6 सप्ताह के बाद दिल की विफलता होती है, 12 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 एन नर चूहों को सर्जरी के लिए अनुशंसित किया जाता है। माउस सबस्ट्रेन C57BL/6N और C57BL/6J के बीच महाधमनी बैंडिंग के 2 सप्ताह बाद एक तुलना में गंभीर कार्डियक डिसफंक्शन और C57BL/6N चूहों में मृत्यु दर में वृद्धि देखी गई। इसलिए, ये दिल की विफलता12 के मॉडल के लिए बेहतर अनुकूल हैं। बारह सप्ताह के नर और मादा चूहों में महाधमनी के संपर्क और विशेष उपकरणों के साथ ओ-रिंग के प्लेसमेंट के लिए एक इष्टतम आकार होता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
पशु प्रयोगों को क्षेत्रीय समिति के सिद्धांतों के तहत किया गया था (मिनिस्टरियम फ्यूर एनर्जीवेंडे, लैंडविर्टशाफ्ट, उम्वेल्ट, नेचुर और डिजिटलिसियरुंग डेस लैंड्स श्लेस्विग-होलस्टीन, अनुमति संख्या: वी 242-21249/2020 [38-4/20])। वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग किए गए चूहों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। जानवरों को 12 घंटे प्रकाश, 12 घंटे रात चक्र के साथ मानक परिस्थितियों में रखा गया था; पानी और भोजन की पेशकश लिबिटम के माध्यम से की गई थी।
1. पशु देखभाल
- चूहों को बिस्तर, घोंसले की सामग्री, छिपने की जगह और पीने के पानी और भोजन तक उचित पहुंच के साथ विशेष पिंजरों में रखें।
- जानवरों को निरंतर विशेष पशु चिकित्सा नियंत्रण और उपचार के तहत रखें।
नोट: बाहरी आपूर्तिकर्ताओं द्वारा आदेशित चूहों के लिए, कृपया प्रक्रिया शुरू करने से पहले 7 दिनों के अनुकूलन का आश्वासन दें।
2. ओ-रिंग की तैयारी
नोट: 2 सप्ताह के बाद कार्डियक हाइपरट्रॉफी को प्रेरित करने के लिए 0.4 मिमी के निश्चित व्यास के साथ एक ओ-रिंग की सिफारिश की जाती है। प्रेरित कार्डियक फेनोटाइप की सीमा और गंभीरता ओ-रिंग व्यास के आकार पर निर्भर करती है।
- सबसे पहले, महाधमनी के चारों ओर प्लेसमेंट को सक्षम करने के लिए कैंची या स्केलपेल का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के नीचे ओ-रिंग ( सामग्री की तालिका देखें) का एक कट करें (चित्रा 1 ए, बी)।
- कट के करीब प्रत्येक रिंग साइड को 8-0 से जुड़ी सुई से छेदें गैर-अवशोषित सीवन और धागे को खींचें। अंतिम चरण में महाधमनी के चारों ओर ओ-रिंग को बांधने के लिए एक तरफ 2-3 सेमी और दूसरी तरफ 2 सेमी काटें और छोड़ दें (चित्रा 1 सी, डी)।
- सर्जरी से पहले, बंधाव सहायता (प्रजाति उपकरण, सामग्री की तालिका देखें) लें और कसना के छेद के माध्यम से एक रिंग साइड के धागे (जो लंबे समय तक रखा जाता है) के अंत को खींचें (चित्रा 1 ई, एफ)। संलग्न ओ-रिंग के साथ बंधाव सहायता को निम्नलिखित चरण (चरण 6) में प्लेसमेंट के लिए अलग रखें।
- धागे के साथ अंगूठी के कीटाणुशोधन के लिए, अंगूठी को आधे घंटे के लिए अल्कोहल के घोल में रखें। बाद में, इसे सूखने के लिए सेल्यूलोज पर रखें। सूखे अंगूठी को एक बंद टब या केस में उपयोग होने तक रखें। सर्जरी के दौरान, बंधाव सहायता के माध्यम से धागे को खींचने के बाद, अंगूठी को उपयोग होने तक एक साफ सतह पर रखें।
चित्र 1: बंधाव के लिए ओ-रिंग तैयारी करना। (A) एक निश्चित व्यास वाली ओ-रिंग को कैंची या एक तरफ स्केलपेल से काटा जाता है। (बी) एक ओ-रिंग की छवि। (C) प्रत्येक ओ-रिंग साइड को 8-0 से छेदा जाता है प्रोलीन थ्रेड. (डी) ओ-रिंग को दो धागे से छेदा गया। (ई) ओ-रिंग के एक रिंग साइड के धागे को लिगेशन सहायता के छेद के माध्यम से खींचा जाता है। (एफ) प्लेसमेंट से पहले अंतिम स्थिति: एक तरफ के धागे को बंधाव सहायता के छेद के माध्यम से रखा जाता है, जबकि दूसरी तरफ के धागे ढीले रखे जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
3. चूहों का पूर्व-समर्पण और ऑपरेटिंग क्षेत्र की तैयारी
- सर्जरी के दौरान पर्याप्त एनाल्जेसिया प्राप्त करने के लिए, सर्जरी के लिए आगे बढ़ने से 20 मिनट पहले एनाल्जेसिक ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा, सामग्री की तालिका देखें) इंट्रापरिटोनियल इंजेक्ट करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, दर्द की दवा का उपयोग गेसेलशाफ्ट फ्यूर वर्सचस्टियरकुंडे / सोसाइटी ऑफ लेबोरेटरी एनिमल साइंस (जीवी-एसओएलएएस) की सिफारिशों के बाद किया गया था। - प्रीमेडिकेशन के बाद, माउस को 2% -4% आइसोफ्लुरेन के साथ 100% ओ2 के 0.5-1.0 एल / मिनट के साथ मिश्रित एक प्रेरण कक्ष में एनेस्थेटाइज करें।
- बेहोश माउस के बाईं छाती की तरफ फर को शेव करें। शेविंग के बाद, माउस को आइसोफ्लुरेन से भरे कक्ष में वापस रखें और जानवर को इंजेक्शन देने से पहले पर्याप्त बेहोश करने की प्रतीक्षा करें।
नोट: बेहोश करने की क्रिया का सही समय बिंदु धीमी सांस लेने को दर्शाता है लेकिन स्नैप श्वास से बचता है। आइसोफ्लुरेन गैस सेटिंग के आधार पर, बेहोश करने की क्रिया के सही स्तर को प्राप्त करने में 2-3 मिनट लगते हैं। - जानवर के शरीर के तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) को बनाए रखने के लिए सर्जरी से पहले हीटिंग पैड चालू करें। माउस के शरीर के तापमान को स्वचालित रूप से बनाए रखने के लिए हीटिंग पैड को एक रेक्टल प्रोब ( सामग्री की तालिका देखें) से कनेक्ट करें।
4. चूहों का इंटुबैशन
- आवश्यक उपकरण तैयार करें (चित्रा 2 ए)। सर्जरी से पहले लैरींगोस्कोप को लगभग 1-3 मिनट के लिए अल्कोहल में रखकर कीटाणुरहित करें और फिर इसे रात भर सूखने के लिए रखें।
- प्लेट पर सामने के दांतों के साथ माउस को ठीक करने के लिए हीटिंग पैड के चारों ओर एक रबर बैंड फैलाएं। हीटिंग पैड पर बेहोश माउस को लापरवाह स्थिति में रखें।
- प्लेट पर गर्दन का विस्तार करने के लिए जानवर के सामने के दांतों पर रबर बैंड रखें।
- एंडोट्राचेल इंटुबैशन के लिए श्वासनली के उद्घाटन की अच्छी दृश्यता के लिए गले पर एक प्रकाश स्रोत पर ध्यान केंद्रित करें (चित्रा 2 बी)।
- एक हाथ से एक इंटुबैशन सहायता (हस्तनिर्मित लैरींगोस्कोप, सामग्री की तालिका देखें) (चित्रा 2 ए[3]) की स्थिति के साथ धीरे से मुंह खोलें।
- दूसरे हाथ और छोटे बल के साथ, श्वासनली के उद्घाटन को साफ करने के लिए जीभ को धीरे से हिलाएं।
- श्वासनली में एंडोट्राचेल ट्यूब को पेश करने के लिए भी इस हाथ का उपयोग करें। दूसरी ओर, अभी भी इंटुबैशन सहायता रखें। इंटुबैशन के लिए, 22 जी कैनुला का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें) (चित्रा 2 ए[1])।
- सही एंडोट्राचेल ट्यूब स्थिति (एंडोट्राचेल) की पुष्टि करने के लिए चूहों के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक के माध्यम से एंडोट्राचेल ट्यूब की स्थिति को वेंटिलेटर ( सामग्री की तालिका देखें) से कनेक्ट करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार सही वेंटिलेशन की निगरानी करें (200 μL की ज्वारीय मात्रा और 100-150 सांस / मिनट के बीच श्वसन दर) (चित्रा 2 सी)।
- पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स चेक (कोई रिफ्लेक्स प्रतिक्रिया नहीं) द्वारा पर्याप्त एनेस्थेटिक गहराई की पुष्टि करें।
- एनेस्थीसिया सेटिंग को 0.5-1.0 एल/मिनट 100% ओ 2 के साथ मिश्रित2% आइसोफ्लुरेन में बदलें।
- सर्जरी के दौरान सूखापन से बचने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
- एक कपास के स्वैब का उपयोग करके, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कीटाणुनाशक समाधान के साथ सर्जरी क्षेत्र को 3 बार कीटाणुरहित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
चित्र 2: माउस का इंटुबैशन। (ए) इंटुबैशन उपकरण: (1) ए 22 जी यानी कैनुला का उपयोग एंडोट्रेकियल ट्यूब (मंदारिन के बिना) के रूप में किया जाता है; (2) फोर्सप्स; (3) हस्तनिर्मित लैरींगोस्कोप (लकड़ी की छड़ों और टेप से चिपके हुए विकृत / चपटे कैनुला)। (बी) तैनात हीटिंग पैड पर इंटुबैशन करना। (सी) वेंटिलेटर से जुड़ा हुआ इंटुबेटेड माउस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
5. सर्जरी और रिंग पोजिशनिंग की तैयारी
नोट: संक्रमण से बचने के लिए बाँझ सामग्री और उपकरणों का उपयोग करें।
- जाइफाइड प्रक्रिया और बाएं एक्सिला के बीच एक रेखा के बीच में 0.5-1 सेमी लंबा त्वचा चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। अंतर्निहित पसलियों से मांसपेशियों की परत को अलग करने के लिए बल का उपयोग करें और पसली पिंजरे को उजागर करने के लिए चीरा में दो रिट्रैक्टर (5 मिमी लंबाई, सामग्री की तालिका देखें) रखें।
- बाएं थोराकोटॉमी शुरू करने के लिए, माइक्रो स्प्रिंग कैंची का उपयोग करके दूसरी और तीसरी पसली के बीच इंटरकोस्टल मांसपेशियों में एक छोटा सा चीरा (~ 1-2 मिमी) करें। वक्ष गुहा खोलें और चीरा को 45° कोण वाले बल के साथ फैलाएं।
- विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार के लिए थोरैसिक कैविटी खोलने के लिए चीरा में तीन छाती वापसी (1.0-2.5 मिमी लंबाई) रखें।
- महाधमनी आर्क को उजागर करने के लिए, थाइमस और वसा ऊतक को आर्क से उठाने और धीरे से अलग करने की कोशिश करें।
6. ओ-रिंग के साथ अनुप्रस्थ महाधमनी का बंधाव
- महाधमनी आर्क को एक हाथ में 45 ° कोण वाले बल के साथ उजागर करें। स्थिति, दूसरी ओर, एक तरफ के धागे के माध्यम से बंधाव सहायता से जुड़ी ओ-रिंग (चरण 2)।
- महाधमनी मेहराब के नीचे बंधाव सहायता का उपयोग करके धागों को पुच्छल पक्ष से ब्राचियोसेफेलिक और बाएं आम कैरोटिड धमनियों के बीच अनुप्रस्थ महाधमनी के कपाल पक्ष तक पारित करें (चित्रा 3 ए)।
- बंधाव सहायता और महाधमनी चाप के बीच दोनों धागे को सावधानी से लें। बंधाव सहायता को वापस लें और हटा दें और प्रत्येक तरफ धागे खींचकर धीरे से मेहराब के चारों ओर ओ-रिंग को रखें (चित्रा 3 बी)।
- सफल स्थिति के बाद, ओ-रिंग को धागे और एक सर्जिकल गाँठ के साथ ठीक करें। प्रत्येक तरफ गाँठ खोलने से बचने के लिए एक अतिरिक्त बनाएं (चित्रा 3 सी)।
चित्र 3: ओ-रिंग प्रत्यारोपण करना। (A) महाधमनी चाप 1.0-2.5 मिमी के तीन रिट्रैक्टर्स द्वारा उजागर किया जाता है। एक रिंग साइड के दोनों लंबे धागे महाधमनी के नीचे पारित किए जाते हैं। (बी) ओ-रिंग को धीरे से अंगूठी को धक्का देकर और धागे खींचकर रखा जाएगा। (C) is o-रिंग सही स्थिति में है, और एक कपाल धागा प्रत्येक तरफ पुच्छल धागे से गाँठ किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
7. सीवन और पोस्ट-ऑपरेटिव रिकवरी
- चीरा से तीन छाती वापस लेने वालों (2.5 मिमी लंबाई) को हटा दें।
- यदि आवश्यक हो, तो गर्म 0.9% आइसोटोनिक नमक समाधान के साथ भरकर वक्ष से अवशिष्ट हवा को समाप्त करें।
- सीवन के लिए वक्ष चीरा को उजागर करने के लिए, त्वचा को साइड में पकड़ने के लिए फिर से दो रिट्रैक्टर (5 मिमी लंबाई) लें।
- दो या तीन 6-0 गैर-अवशोषित सीवन के साथ वक्ष को बंद करें ( सामग्री की तालिका देखें) और फेफड़ों को फिर से फुलाने के लिए वेंटिलेटर के बहिर्वाह को 2 सेकंड के लिए बंद करें।
- दो रिट्रैक्टर्स को हटा दें और त्वचा को तीन से पांच 4-0- अवशोषित सीवन के साथ बंद करें।
- आइसोफ्लुरेन को बंद करें और मॉनिटर करें। जब जानवर आत्म-श्वास लेना शुरू करता है, तो मूंछें चलती हैं, और पैर की अंगुली चुटकी सजगता को ट्रिगर किया जा सकता है, माउस को बाहर निकाला जा सकता है। माउस को अपनी देखभाल इकाई में हीट लैंप के नीचे बाईं ओर रखें और इसे तब तक देखें जब तक कि यह पूरी तरह से जाग न जाए।
- एक जानवर को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह पर्याप्त होश में न आ जाए।
नोट: एक जानवर जो सर्जरी से गुजरा है, उसे बेहतर वसूली के लिए अपनी देखभाल इकाई (पिंजरे) मिलनी चाहिए। - 7 दिनों के लिए पीने के पानी में ट्रामाडोल (1 मिलीग्राम / एमएल) और जरूरत पड़ने पर सर्जरी के बाद 3 दिनों के लिए इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा, 3x दैनिक) के साथ दर्द प्रबंधन करें।
नोट: पोस्टऑपरेटिव एनाल्जेसिया के लिए स्थानीय पशु नैतिकता समिति की सिफारिशों का पालन करें। - रोजाना पानी की बोतलों को तौलकर दवा की जांच करें और जानवर के व्यवहार को देखें।
8. रिंग की सफल कसना और सही स्थिति की पुष्टि
- सर्जरी के एक दिन बाद, स्टेनोसिस पर अधिकतम प्रवाह वेग को मापकर अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके स्टेनोसिस को सत्यापित करें।
- माप के लिए, एक अल्ट्रासाउंड प्रणाली के साथ इकोकार्डियोग्राफी और 30 मेगाहर्ट्ज की आवृत्ति के साथ ट्रांसड्यूसर जांच का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- जैसा कि ऊपर वर्णित है, 100% ओ 2 के 0.5-1.0 एल / मिनट के साथ 1.5% -2% आइसोफ्लुरेन पर मास्क का उपयोग करके संज्ञाहरण बनाएरखें।
- एनेस्थेटाइज्ड जानवर को हीटिंग पैड पर लापरवाह स्थिति में रखें। शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस ± 1 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए हीटिंग पैड को रेक्टल प्रोब से कनेक्ट करें, और चार माउस पंजा सेंसर का उपयोग करके ईसीजी के साथ हृदय गति की निगरानी करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, डिपिलेशन क्रेम का उपयोग करें।
- एक सफलतापूर्वक किए गए ओआरएबी के परिणामस्वरूप अल्ट्रासाउंड (~ 2,400 मिमी / एस) (चित्रा 4 सी) द्वारा मापा गया स्टेनोसिस पर प्रवाह वेग में वृद्धि होती है। इस माप के लिए, ट्रांसड्यूसर सिर को दो-आयामी (2 डी) इमेजिंग ("बी-मोड") द्वारा महाधमनी आर्क को स्थानीयकृत करने के लिए दाईं वक्ष की ओर पैरास्टर्नल रूप से रखें।
- महाधमनी में रक्त प्रवाह की कल्पना करने के लिए रंग डॉपलर का उपयोग करें और स्टेनोसिस पर स्पंदित तरंग डॉपलर रक्त प्रवाह वेग के साथ मापें।
नोट: शाम-संचालित चूहे (कसना के बिना नियंत्रण सर्जरी) ~ 600-900 मिमी / सेकंड का रक्त प्रवाह वेग दिखाते हैं। इसके अलावा, एक सफल ओआरएबी के परिणामस्वरूप माउस में दाएं कैरोटिड (~ 150 मिमी / एस) (आरसी, चित्रा 4 ए) और बाएं कैरोटिड (~ 300 मिमी / एस) एलसी, चित्रा 4 बी) के बीच वेग प्रवाह अनुपात में वृद्धि होती है।
- महाधमनी में रक्त प्रवाह की कल्पना करने के लिए रंग डॉपलर का उपयोग करें और स्टेनोसिस पर स्पंदित तरंग डॉपलर रक्त प्रवाह वेग के साथ मापें।
- दो-आयामी (2 डी) इमेजिंग (बी-मोड) द्वारा दाएं और बाएं धमनी कैरोटिस इंटर्ना की कल्पना करें। ट्रांसड्यूसर सिर को गर्दन के बाईं और दाईं ओर क्षैतिज रूप से 45 ° कोण पर रखें और रक्त प्रवाह वेग निर्धारित करने के लिए स्पंदित तरंग डॉपलर का उपयोग करें।
नोट: शाम-संचालित चूहों में, दोनों धमनियों में वेग प्रवाह समान है।
चित्र 4: कैरोटिड धमनियों में पल्स वेव डॉप्लर वेग माप का उपयोग करके अनुप्रस्थ महाधमनी बंधाव की पुष्टि। (ए) दाईं कैरोटिड धमनी के प्रतिनिधि स्पंदित तरंग डॉपलर वेग संकेत। (बी) स्टेनोसिस के परिणामस्वरूप बाईं ओर की तुलना में दाईं कैरोटिड धमनी में उच्च प्रवाह वेग होता है। (सी) कसना से प्रेरित स्टेनोसिस के परिणामस्वरूप 2,400 मिमी / सेकंड से अधिक की अवरोही महाधमनी में प्रवाह वेग होता है। शाम चूहे 600-900 मिमी / सेकंड का प्रवाह वेग दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
आम तौर पर, महाधमनी बैंडिंग मानव महाधमनी स्टेनोसिस की नकल करती है और चूहों में कार्डियक हाइपरट्रॉफी को प्रेरित करती है। एक सफल प्रक्रिया हृदय के ऊतक ों के रीमॉडेलिंग की विशेषता है जो कार्डियक हाइपरट्रॉफी और कम हृदय समारोह 5,6 द्वारा परिलक्षित होती है।
ऑपरेशन के सीधे 1 दिन बाद, अनुप्रस्थ महाधमनी के ओ-रिंग कसना का प्रभाव इकोकार्डियोग्राफी13 द्वारा विवो में निर्धारित किया जा सकता है। महाधमनी स्टेनोसिस का सफल प्रेरण स्पंदित तरंग डॉपलर अल्ट्रासाउंड (चित्रा 4 सी) द्वारा मापा गया महाधमनी में स्टेनोसिस पर रक्त प्रवाह वेग में वृद्धि से दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, जैसा कि ऊपर वर्णित है, हम ओआरएबी (चित्रा 4 ए, बी) के कार्यात्मक मार्कर के रूप में दाएं और बाएं आंतरिक कैरोटिड धमनियों के बीच रक्त प्रवाह वेग अनुपात निर्धारित करते हैं।
0.4 मिमी ओ-रिंग रखने के दो सप्ताह बाद, कार्डियक हाइपरट्रॉफी का सफल प्रेरण इकोकार्डियोग्राफी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। दो-आयामी (2 डी) समय-गति मोड (एम-मोड) विज़ुअलाइज़ किए गए हृदय संरचनाओं को प्रदर्शित करता है क्योंकि वे हृदय चक्र में बदलते हैं। सर्जरी के दो सप्ताह बाद, डायस्टोलिक में बाएं वेंट्रिकुलर (एलवी) पीछे की दीवार (एलवीपीडब्ल्यू) और इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम (आईवीएस) व्यास में वृद्धि देखी जा सकती है (चित्रा 5 बी)। इसके अतिरिक्त, बाएं वेंट्रिकुलर इजेक्शन अंश (एलवीईएफ) में कमी को मापकर कार्डियक फ़ंक्शन के प्रगतिशील बिगड़ने का दस्तावेजीकरण किया जा सकता है।
चित्रा 5: इकोकार्डियोग्राफी द्वारा सर्जरी के 2 सप्ताह बाद प्रेरित कार्डियक हाइपरट्रॉफी की पुष्टि। (ए) सर्जरी के 2 सप्ताह बाद शाम-संचालित माउस की प्रतिनिधि एम-मोड छवि। (बी) ओआरएबी संचालित माउस की एम-मोड इमेजिंग सर्जरी के 2 सप्ताह बाद डायस्टोलिक में बाएं वेंट्रिकुलर पश्चवर्ती दीवार (एलवीपीडब्ल्यू) और इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम (आईवीएस) व्यास में वृद्धि के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
सीवन-आधारित महाधमनी बैंडिंग का उपयोग चूहों में दबाव-अधिभार कार्डियक हाइपरट्रॉफी को प्रेरित करने के लिए कई वर्षों से किया गया है। यह विवो में कार्डियक रीमॉडेलिंग और रोग की प्रगति के पैथोमैकेनिज्म की जांच करने के लिए एक स्थापित विधि है। सीमाएं स्टेनोसिस की डिग्री में अपेक्षाकृत उच्च भिन्नता हैं और, परिणामस्वरूप, रीमॉडेलिंग। हाल ही में शुरू की गई ओराब तकनीक पहली बार मेलेबी एट अल.10 द्वारा वर्णित रबर ओ-रिंग का उपयोग करके पारंपरिक विधि का अनुकूलन करती है।
इस तकनीक का सबसे मूल्यवान लाभ ओ-रिंग का निश्चित व्यास है, जो स्टेनोसिस की डिग्री में कम परिवर्तनशीलता की ओर जाता है और परिणामस्वरूप, सर्जरी के बाद कार्डियक हाइपरट्रॉफी के अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फेनोटाइप ्स की ओर जाता है। एक और लाभ इस पद्धति में तेजी से सीखने और आसान प्लेसमेंट है। सीवन-आधारित प्रक्रिया के साथ, महाधमनी के चारों ओर बंधाव की सही डिग्री खोजने में आमतौर पर समय और अनुभव लगता है। इसके विपरीत, यह निश्चित व्यास या ओ-रिंग के कारण ओ-रिंग दृष्टिकोण के साथ उसी हद तक आवश्यक नहीं है।
ओआरएबी तकनीक में ओपन चेस्ट सर्जरी एक महत्वपूर्ण बिंदु है, जो जानवर के लिए दर्दनाक है लेकिन ओ-रिंग लिगेशन के लिए आवश्यक है। बेहतर वसूली प्राप्त करने और एटेलेक्टेसिस की घटना से बचने के लिए, फेफड़ों की चोट को रोकना और वेंटिलेटर के माध्यम से वेंटिलेशन की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। सीवन-आधारित विधि के लिए, न्यूनतम इनवेसिव तकनीक का अवसर है। इस प्रक्रिया में, ऊतक को केवल महाधमनी 7,13 के चारों ओर धागा डालने के लिए बल की एक जोड़ी के साथ फैलाया जाता है। हालांकि, इस प्रक्रिया का नुकसान अभी भी बंधाव के कारण महाधमनी की संभावित चोट है।
हाल ही में, नाकाओ एट अल.9 ने ओआरएबी दृष्टिकोण के समान तकनीक की सूचना दी। तथाकथित ओ-रिंग-प्रेरित ट्रांसवर्स महाधमनी कसना (ओटीएसी) इंटुबैशन के बिना मिनी-स्टीरियोटॉमी के साथ किया जाता है। वर्तमान अध्ययन के समान, परिणाम उच्च प्रजनन क्षमता दिखाते हैं। हालांकि, चूहों में स्टर्नोटॉमी जानवरों के लिए वापस लेने वालों के साथ ऊतक फैलाने की तुलना में अधिक दर्दनाक हो सकता है।
अद्वितीय ओआरएबी तकनीक थ्रेड / सीवन-आधारित तकनीक में एक सुधार है। ओ-रिंग के निश्चित व्यास के साथ, स्टेनोसिस और बाद में कार्डियक हाइपरट्रॉफी की परिवर्तनशीलता कम होती है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम होते हैं। इसके अलावा, प्रक्रिया में प्रशिक्षण के लिए कम चूहों की आवश्यकता होती है। इस पद्धति की कम मृत्यु दर से पता चलता है कि यह थ्रेड / सीवन टीएसी मॉडल के लिए एक संभावित बेहतर विकल्प है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को बुंडेसमिनिस्टेरियम फर बिलडुंग एंड फोर्सचुंग (बीएमबीएफ) द्वारा एल.एल., एन.एफ., और ओ.जे.एम. (आईवोलैडएमटी-एचएफ) द्वारा समर्थित किया गया था। FKZ 01KC2006A)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
References
- Frey, N., Olson, E. N. Cardiac hypertrophy: The good, the bad, and the ugly. Annual Review of Physiology. 65, 45-79 (2003).
- Bui, A. L., Horwich, T. B., Fonarow, G. C. Epidemiology and risk profile of heart failure. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 30-41 (2011).
- Bolli, R. New initiatives to improve the rigor and reproducibility of articles published in Circulation Research. Circulation Research. 121 (5), 472-479 (2017).
- Dunlay, S. M., Weston, S. A., Jacobsen, S. J., Roger, V. L. Risk factors for heart failure: A population-based case-control study. The American Journal of Medicine. 122 (11), 1023-1028 (2009).
- Riehle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Circulation Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Hu, P., et al. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (3), 1261-1269 (2003).
- Mohammed, S. F., et al. Variable phenotype in murine transverse aortic constriction. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 188-198 (2012).
- Nakao, Y., et al. O-ring-induced transverse aortic constriction (OTAC) is a new simple method to develop cardiac hypertrophy and heart failure in mice. Scientific Reports. 12, 85 (2022).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Lindsey, M. L., Kassiri, Z., Virag, J. A. I., de Castro Bras, L. E., Scherrer-Crosbie, M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 733-752 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (38), e1729 (2010).
