يصف البروتوكول الحالي استخراج اللوميكان من الغشاء الأمنيوسي (AM) وظروف تخزينه كمستخلص AM (AME) عند -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 6 و 12 و 20 و 32 يوما لتحديد بروتيناته وتركيز اللوميكان.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخلاص اللوميكان من الغشاء الأمنيوسي وتحديد درجة حرارة تخزينه
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Lumican هو بروتيوغليكان صغير غني بالليوسين في الغشاء الأمنيوسي البشري (AM) الذي يعزز ظهارة القرنية وتنظيم ألياف الكولاجين ، والحفاظ على شفافية القرنية. في العمل الحالي ، تم اقتراح طريقة لاستخراج البروتين من AM للحصول على lumican. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقييم استقرار lumican في مستخلص AM (AME) المخزن في درجات حرارة وفترات زمنية مختلفة. تم إذابة 100 ملغ من AM وإزالة الظهارة الميكانيكية. تم تجميد AM المنزوع الظهارة وسحقه حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم ، والذي تم إذابته ب 2.5 مل من المحلول الملحي مع مثبطات الأنزيم البروتيني والطرد المركزي لاستخراج البروتين. تم جمع المادة الطافية وتخزينها في -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 6 و 12 و 20 و 32 يوما. بعد ذلك ، تم تحديد كمية lumican في كل AME. تسمح هذه التقنية ببروتوكول يمكن الوصول إليه واكتسابه لاستخراج اللوميكان من AM. تأثر تركيز اللوميكان بوقت التخزين وظروف درجة الحرارة. كان Lumican في AME لمدة 12 يوما مخزنا عند -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية أعلى بكثير من AME الأخرى. يمكن أن يكون استخراج اللوميكان هذا مفيدا لتطوير العلاجات والحلول الصيدلانية. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد استخدامات AME lumican في عملية إعادة الاندمال وشفاء الجروح.
المقدمة
واحدة من العلاجات الأكثر استخداما لأمراض القرنية هو زرع الغشاء الأمنيوسي. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، ظهرت مقترحات جديدة لاستخدام مكونات مختلفة من الأنسجة الأمنيوسية كعلاجات بديلة ومساعدة. من بين المكونات الأكثر دراسة من AM هي تلك التي تم الحصول عليها من استخراج AM (AME)1،2،3،4،5،6،7. يحتوي AM على العديد من العوامل القابلة للذوبان مثل البروتينات المضادة لتولد الأوعية ، والإنترلوكينات (IL) ، ومثبطات الأنسجة للبروتينات المعدنية (TIMPs) ،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (رقم المشروع. CEI-2020/06/04). تم الحصول على AM من Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amnion bank (من أشخاص مجهولي الهوية) ، والذي تم إعداده كما وصفه شافيز غارسيا وآخرون 17.
1. إعداد مستخلص الغشاء الأمنيوسي
- الحصول على 100 ملغ من AM من بنك السلى.
ملاحظة: وفقا لتقرير سابق ، يفرز 50 مجم من AM ما مجموعه 10 نانوغرام / مل من اللوميكان14. للحصول على تركيز أعلى من lumican ، استخدم 100 ملغ من AM ، أي ما يعادل مساحة إجمالية قدرها 32 سم2. - إذا تم تجميد AM ، قم بإذابته في در....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم الإبلاغ عن النتائج كقيمة متوسطة ± الانحراف المعياري (SD). تم إجراء اختبارات t للطالب وتحليل التباين (ANOVA). اعتبرت قيم P < 0.05 ذات دلالة إحصائية. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج إحصائي (انظر جدول المواد).
تأثرت كمية البروتين الإجمالية في AME بالوقت وظروف التخزين. كان تركيز البروتين القاعدي مشابها بين جميع AME. كان نطاق البروتين الكلي 2.7 ± 0.3 ميكروغرام / مل دون فرق كبير بين العينات التي تم تقييمها. ومع ذلك ، عندما تم تخزين العينات لمدة 12 .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الدراسة ، تم تحليل وجود lumican في AME وعلاقته المباشرة مع ثباته في ظل ظروف التخزين المختلفة. ومن المثير للاهتمام ، عندما تم تحديد تركيز البروتين الكلي في AME ، زاد تركيز البروتين بعد التخزين. تشير الدلائل إلى ثلاث آليات يمكن أن تغير تركيز البروتين في التخزين المجمد: التمسخ البارد ، والتركيز المجمد للمواد المذابة ، والتكشف الجزئي الناجم عن الجليد لبنية البروتين19. يمكن أن تؤثر عملية التجميد على تركيز البروتين في عينات التخزين بسبب تبلور الطور السائل في العينة. تشير النتائج إلى أن هذا يمكن أ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تم تمويل الدراسة من قبل برنامج دعم مشاريع البحث والابتكار التكنولوجي التابع للجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (رقم المنحة. PAPIIT IN203821) ، ووزارة التعليم والعلوم والتكنولوجيا والابتكار (رقم المنحة. SECTEI 250/2019).
شكر وتقدير
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 N H2SO4 stop solution | R& D Systems | DY994 | |
| 100 & L ماصة دقيقة | Eppendorf | ||
| 1000 & mu ؛ L ماصة دقيقة | Eppendorf | ||
| 15 مم طبق بتري | Symlaboratorios | ||
| 18 جم إبرة (1.2 مم × 40 مم) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 مل أنبوب الطرد المركزي | الدقيق Eppendorf | Z606340 | |
| 20 مل حقنة بلاستيكية ؛ | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 & L ماصة دقيقة | Eppendorf | ||
| 20-200 & mu ؛ L ماصة دقيقة | Eppendorf | ||
| 5 مل أنبوب الطرد المركزي | الدقيق Eppendorf | 30119401 | |
| 96 بئر صفيحة | دقيقة SARSTEDT | 821581 | |
| رقائق الألومنيوم | N / A | N / A | |
| غشاء أمينوتي | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 مجم | |
| محلول ملح متوازن | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| دورق | N / A | N / A | |
| BioRender ؛ | BioRender | ||
| الروك المضغوط | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| كامل ، خالي من EDTA ، مثبط البروتياز أقراص كوكتيل | Roche | 11 873 580 001 | مثبط البروتياز |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. ، INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| مطياف لوحة ELISA | Thermo Labsystems& نب سب. | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | الإصدار 9 | التحليل الإحصائي والبرنامج الرسومي |
| مجموعة اللوميكان الثنائي البشري ELISA | R & تتضمن D Systems | DY2846-05 | الأجسام المضادة لالتقاط Lumican |
| البشري ؛ | فورما العلمية | 3326 S / N 36481-7002 | |
| مجهر الضوء المقلوب | أوليمبوس ؛ | 6A13921 | لتأكيد إزالة الظهارة Mod.CK2 |
| غطاء التدفق الصفحي | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| النيتروجين السائل | N / A | N / A | |
| ملاط | N / A | / A | |
| ماصة متعددة القنوات | Eppendorf | ||
| خزان النيتروجين | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| مناشف ورقية | N / A | N / A | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات | R & D Systems | DY006 | |
| بيرس تعديل لوري بروتين فحص كيت | الحرارية العلمية | 23240 | |
| ألواح السدادة | R & D Systems | DY992 | |
| كاشف مخفف | R & D Systems | DY995 | 1٪ BSA في PBS ، درجة الحموضة 7.2-7.4 ، 0.2 مو ؛ م مرشحة |
| المبردة الطرد المركزي | centurion scientific Ltd & nbsp ؛ | 15877 | وزارة الدفاع. K2015R |
| مكشطة خلية شرطي | مطاطية NEST | 710001 | لإزالة الظهارة الميكانيكية |
| سكين مشرط | Braun | BB521 | رقم 10 أو 21 |
| Streptavidin-HRP 40 ضعفا مركزة ؛ | R & D أنظمة | الجزء 893975 | |
| الركيزة tetramethylbenzidine (TMB) حل | R & D Systems | DY999 | |
| ملاقط مسننة | اختراع ألمانيا | 6b | inox |
| المياه فائقة النقاء | PISA | ||
| غسل العازلة | R & D Systems | WA126 | 0.05٪ Tween 20 في PBS ، درجة الحموضة 7.2-7.4 |
المراجع
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
