Summary
Het huidige protocol beschrijft de extractie van lumican uit het vruchtwatermembraan (AM) en hun opslagcondities als AM-extract (AME) bij -20 °C, 4 °C en kamertemperatuur (RT) gedurende 6, 12, 20 en 32 dagen om de eiwitten en lumicanconcentratie te kwantificeren.
Abstract
Lumican is een klein leucine-rijk proteoglycaan in het menselijk vruchtwatermembraan (AM) dat cornea-epithelisatie en de organisatie van collageenvezels bevordert, waardoor de transparantie van het hoornvlies behouden blijft. In het huidige werk wordt een methode voor eiwitextractie uit AM voorgesteld om lumican te verkrijgen. Daarnaast wordt de stabiliteit van lumican in het AM-extract (AME) opgeslagen bij verschillende temperaturen en tijdsperioden geëvalueerd. 100 mg AM werd ontdooid en mechanisch gedepitheliseerd. De gedepitheliseerde AM werd ingevroren en geplet totdat een fijn poeder werd verkregen, dat werd opgelost met 2,5 ml zoutoplossingsbuffer met proteaseremmers en gecentrifugeerd voor eiwitextractie. Het supernatant werd verzameld en bewaard bij -20 °C, 4 °C en kamertemperatuur (RT) gedurende 6, 12, 20 en 32 dagen. Daarna werd lumican in elke AME gekwantificeerd. Deze techniek maakt een toegankelijk en acquireerbaar protocol mogelijk voor lumican extractie uit AM. De Lumican-concentratie werd beïnvloed door de opslagtijd en temperatuuromstandigheden. Lumican in de AME van 12 dagen bewaard bij -20 °C en 4 °C was significant hoger dan andere AME. Deze lumican-extractie kan nuttig zijn voor het ontwikkelen van behandelingen en farmaceutische oplossingen. Verdere studies zijn nodig om het gebruik van AME lumican in re-epithelisatie en wondgenezingsproces te bepalen.
Introduction
Een van de meest gebruikte behandelingen voor cornea-aandoeningen is vruchtwatermembraantransplantatie; in de afgelopen jaren zijn er echter nieuwe voorstellen ontstaan voor het gebruik van verschillende componenten van vruchtwater als alternatieve en adjuvante behandelingen. Een van de meest bestudeerde componenten van AM zijn die verkregen uit het AM-extract (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM bevat meerdere oplosbare factoren zoals antiangiogene eiwitten, interleukines (IL), weefselremmers van metalloproteinasen (TIMPs), ontstekingsremmende eiwitten gemedieerd door TSG-6 die neutrofiele extracellulaire vallen remmen, groeifactoren: epidermale groeifactor (EGF), transformerende groeifactor (TGF) (alfa en bèta), keratinocytengroeifactor (KGF), hepatocytengroeifactor (HGF) en lumican, die de transparantie van het hoornvlies handhaaft door collageenfibrillogenesete reguleren 1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican is een kleine leucinerijke proteoglycaan (SLRP), een van de belangrijkste extracellulaire componenten van interstitieel collagenase in de corneastromamamatrix, verantwoordelijk voor het organiseren van collageenvezels en het handhaven van corneatransparantie 4,10,11. Proteoglycanen zijn moleculen in de extracellulaire matrix (ECM), die de belangrijkste zijn bij het uitvoeren van celsignalering en het handhaven van intracellulaire homeostase12. Van ECM-eiwitten is gemeld dat ze de cellulaire processen van proliferatie, differentiatie en migratie tijdens wondgenezing stimuleren11.
Er zijn aanwijzingen voor de mogelijke deelname van lumican aan het proces van cornea-re-epithelisatie. Saika et al., in een studie, toonden aan dat na een hoornvliesletsel, lumican kon worden gedetecteerd in corneale keratocyten tussen de eerste 8 uur en tot 3 dagen na het letsel. Met de hoogste concentratie lumican op de tweede en derde dag, is dit proteoglycaan vervolgens niet detecteerbaar op de zevende dag13. Deze gegevens suggereren de deelname van lumican aan de activering van het cornea-epithelisatieproces. Aan de andere kant werd in een andere studie gemeld dat de afwezigheid van lumican de re-epithelisatie vertraagt; interessant is dat het toevoegen van lumican het re-epithelisatieproces zou kunnen versnellen 4,11,13. Evenzo heeft een recente studie gemeld dat lumican de ontstekingsfuncties van corneale limbus fibroblasten14 kan moduleren, wat een rol suggereert voor lumican als modulator van de inflammatoire, antifibrotische en re-epithelialiserende respons. Op dezelfde manier kan lumican de cornearespons moduleren door interactie met signaalmoleculen zoals Fas-FasL. Ook toonde de afwezigheid van lumican in een knock-out Lum-/- muismodel aan dat het ontbreken van lumican-signalering een adequate hoornvliesreparatie verhindert15.
In de eerste plaats is deze methode bedoeld om een haalbare en toegankelijke manier te demonstreren om lumican uit AM te extraheren. Met deze voordelige methode van lumican-extractie is het mogelijk om vergelijkbare concentraties eiwitten te verkrijgen, waardoor de verwerkingstijd wordt verkort en het voor onderzoekers gemakkelijker wordt in vergelijking met de vorige studies16. Bovendien kan deze AME-lumican worden gebruikt als adjuvans voor corneaherstel en re-epithelisatieprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Review Board (Project No. CEI-2020/06/04). De AM werd verkregen van het Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amnion bank (van gedeïdentificeerde menselijke proefpersonen), die wordt bereid zoals beschreven door Chávez-García et al.17.
1. Bereiding van het vruchtwatermembraanextract
- Verkrijg 100 mg AM van de amnionbank.
OPMERKING: Volgens een eerder rapport scheidt 50 mg AM in totaal 10 ng / ml lumican14 uit. Om een hogere concentratie lumican te verkrijgen, gebruikt u 100 mg AM, wat overeenkomt met een totale oppervlakte van 32 cm2. - Als de AM bevroren is, ontdooi deze dan bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Voer de volgende procedures uit onder een laminaire stromingskap klasse II B. - Was de AM in een petrischaaltje met 10 ml steriele gebalanceerde zoutoplossing (BSS, zie Materiaaltabel) gedurende 2 min.
- Giet de BSS in een bekerglas.
- Herhaal stap 3 en bevestig visueel dat glycerolmedium niet aanwezig is in petrischaal BSS.
OPMERKING: Herhaal stap 3. indien nodig totdat glycerolmedium niet aanwezig is in petrischaal BSS.
- Incubeer de AM met 10 ml dispase II (1,7 IE/ml, zie materiaaltabel) bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Dispase II is een neutraal protease met zachte activiteit boven epitheelcellen. Dit enzym scheidt effectief de intacte epidermis van de dermis en isoleert intacte epithelial sheets18. - Voer na dispase incubatie een mechanische de-epithelisatie14 uit met een rubberen politieagent (zie Materiaaltabel). Bevestig de-epithelisatie door microscopievisualisatie.
OPMERKING: Het proces van de-epithelisatie wordt bevestigd in een omgekeerde microscoop met behulp van 4x en 20x objectieven. Visualiseer het weefsel om de aanwezigheid van een cellulaire laag uit te sluiten. - Was de AM in een petrischaaltje met 10 ml BSS gedurende 2 min. Giet de BSS in een bekerglas.
- Plaats de gedepitheliseerde AM (dAM) in een microcentrifugebuis van 2 ml. Dompel de dAM gedurende 40 minuten onder in vloeibare stikstof.
- Maal de bevroren dAM gedurende 2-3 minuten handmatig in een voorgekoelde mortel bij -85 °C totdat een fijn poeder is verkregen.
- In de mortel, solubiliteer het dAM-poeder met 2,5 ml proteaseremmeroplossing (BSS met proteaseremmers).
OPMERKING: Elke tablet proteaseremmer bestaat uit het volgende mengsel van enzymen: pancreasextract (0,02 mg / ml), thermolysine (metalloprotease) (0,0005 mg / ml), chymotrypsine (0,002 mg / ml), trypsine (0,02 mg / ml) en papaïne (0, 33 mg / ml) (zie materiaaltabel). - Verzamel het mengsel met een micropipette en reinig de mortelwanden met behulp van een scalpelmes. Doe het mengsel in een tube van 5 ml.
- Meng goed met de vortex gedurende 30 s.
- Homogeniseer het weefselmengsel door gedurende 20 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 34 x g en centrifugeer onmiddellijk bij 3360 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Het verzamelde supernatant is de AME (figuur 1). Bewaar 0,7 ml van elke AME in verschillende microcentrifugebuizen van 2 ml gedurende 6, 12, 20 en 33 dagen bij de verschillende temperatuuromstandigheden van -20 °C, 4 °C en kamertemperatuur (RT).
Figuur 1: Proces van AME-bereiding en lumicanconcentratiemeting. 100 mg AM werd geïncubeerd met dispase II bij 37 °C gedurende 30 minuten en mechanisch gedepitheliseerd. De gedepitheliseerde AM werd gewassen en ondergedompeld in vloeibare stikstof gedurende 40 minuten en vervolgens geplet totdat een fijn poeder werd verkregen, dat werd opgelost met 2,5 ml zoutoplossingsbuffer met proteaseremmers en gecentrifugeerd. Het supernatant werd verzameld en bewaard bij -20 °C, 4 °C en RT gedurende 6, 12, 20 en 32 dagen tot de totale eiwit- en lumicankwantificering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. AME-eiwitkwantificering
OPMERKING: De kwantificering van het totale eiwit in de AME moet onmiddellijk na obtentie worden uitgevoerd. Kwantificeer eiwitten met behulp van Lowry-eiwittest en volg de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Het wordt aanbevolen om alle normen en monsters in drievoud te testen.
- Pipetteer 40 μL van elk monster AME in een 96-well microplaat.
- Bereid een standaardcurve in dezelfde microplaat met behulp van runderserumalbumine (BSA) standaard voor een uiteindelijke BSA-concentratie van 0-1.500 μg / ml (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1.000 en 1.500 μg / ml).
- Pipetteer 200 μL van het gemodificeerde Lowry-reagens naar elke put. Meng het onmiddellijk op een plaatmixer gedurende 30 s.
- Bedek de microplaat met aluminiumfolie en incubeer deze gedurende 10 minuten op RT.
- Pipetteer 20 μL 1x Folin-Ciocalteu reagens naar elk putje. Meng het onmiddellijk op een plaatmixer gedurende 30 s.
OPMERKING: Om 1x Folin-Ciocalteu reagens te bereiden, verdun 2x (2N) reagens 1:1 met ultrapuur water. Bereid 1x Folin-Ciocalteu-reagens op dezelfde dag van gebruik omdat het verdunde reagens onstabiel is. - Bedek de microplaat van licht met aluminiumfolie en incubeer deze gedurende 30 minuten op RT.
- Meet de absorptie van monsters bij 660 nm in een ELISA-platenspectrometer (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Kleur kan worden gemeten bij golflengten tussen 650 nm en 750 nm. - Gemiddelde de absorptiewaarde van 660 nm van de standaard blanco monsters en trek deze af van andere 660 nm-waarden van standaard en onbekende monsters.
- Meet de absorptie met een ELISA-platenspectrometer in een eindpuntmodus met weinig schudden gedurende 10 s.
- Gebruik de standaardcurve om de eiwitconcentratie van elk onbekend monster te bepalen.
- Bepaal voor de berekening van eiwitten de concentratie uit een lineale regressiegrafiek met behulp van de absorptiewaarden op de Y-as tegen de concentraties in mg / ml op de X-as van elke standaard BSA-curve.
- Verkrijg de vergelijking van lineaire regressie en r-waarde om de eiwitconcentratie te berekenen.
OPMERKING: De resultaten worden uitgedrukt als genormaliseerde relatieve concentratiewaarden van het totale eiwit ten opzichte van mg AM (μg/ml eiwit/mg AM-weefsel).
- Verkrijg de vergelijking van lineaire regressie en r-waarde om de eiwitconcentratie te berekenen.
3. Kwantificering van Lumican in AME
OPMERKING: De concentratie lumican moet worden gemeten in de AME die is opgeslagen onder verschillende opslagomstandigheden en tijdsperioden. Kwantificeer lumican met behulp van sandwich ELISA en volg de instructies van de fabrikant. Het wordt aanbevolen om alle normen en monsters in tweevoud te testen.
- Verdun het humaan lumicanvangstantilichaam (zie Materiaaltabel) tot de gebruikte concentratie in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
OPMERKING: De injectieflacon met het opvangantilichaam bevat 120 μg antilichaam. Verdun na reconstitutie met 0,5 ml PBS het opvangantilichaam met een werkoplossing van 2 μg/ml.- Pipetteer onmiddellijk 100 μL per putje van het verdunde opvangantilichaam naar een 96-well microplaat. Sluit het bord om en incubeer het een nacht bij RT.
- Adem elke put op en was deze door te pipetteren met 300 μL wasbuffer: 0,05% polyoxyethyleensorbitaanmonolauraat 20 in PBS, pH 7,2-7,4 (zie Materiaaltabel) met behulp van een meerkanaals pipettor. Herhaal dit drie keer.
OPMERKING: Verwijder na de laatste wasbeurt de resterende wasbuffer door het bord te ringen en tik het voorzichtig tegen papieren handdoeken. - Blok platen door toevoeging van 300 μL reagensverdunningsmiddel: 1% BSA in PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μm gefilterd (zie Materiaaltabel) aan elk putje. Incubeer bij RT gedurende 1 uur.
- Herhaal stap 2.
- Bereid een standaardcurve voor in een 96-well microplaat met behulp van tweevoudige seriële verdunningen van 0-8.000 pg / ml voor eindconcentraties van 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000 en 8.000 pg / ml. De ELISA lumican kit bevat een recombinante lumican standaard van 75 ng (zie Materiaaltabel).
- Voeg 100 μL monsters toe en de standaardcurve in de met vangstantilichaam gecoate 96-well microplaat.
- Bedek de microplaat en incubeer gedurende 2 uur op RT met lage roering in een compacte rocker die de snelheid tussen 2-3 tpm handhaaft.
- Herhaal stap 2.
- Voeg 100 μL van het antilichaam met biotinyleringsdetectie (zie materiaaltabel) toe aan elk putje. Bedek van licht en incubeer 2 uur bij RT met lage agitatie in een compacte rocker die de snelheid tussen 2-3 tpm handhaaft.
OPMERKING: De injectieflacon met biotinyleerd detectieantilichaam bevat 24 μg antilichaam. Verdun na reconstitutie met 1,0 ml reagensverdunningsmiddel het antilichaam met biotinyldetectie met een werkoplossing van 400 ng/ml. - Herhaal stap 2.
- Voeg 100 μL van de werkverdunning van streptavidin-mierikswortelperoxidase (HRP, zie Materiaaltabel) toe aan elk putje. Bedek de microplaat van licht en incubeer gedurende 20 minuten op RT.
OPMERKING: De reactieve streptavidin-HRP was 40-voudig geconcentreerd. De werkoplossing 1x streptavidin- HRP is gemaakt met reagensverdunningsmiddel.
OPMERKING: Plaats de plaat niet in direct licht. - Herhaal stap 2.
- Voeg ten slotte 100 μL substraat tetramethylbenzidine (TMB, zie Materiaaltabel) oplossing toe aan elke put.
OPMERKING: Bereid de TMB-oplossing met een gelijk volume gestabiliseerde waterstofperoxide 30% -oplossing in de kit.
OPMERKING: Bereid de oplossing onmiddellijk voor gebruik en houd deze op kamertemperatuur. - Incubeer gedurende 30 minuten bij RT op een donkere plaats.
OPMERKING: Plaats de plaat niet in direct licht. Giet de TMB-oplossing niet aan, omdat er geen verdere wasbeurt nodig is. - Voeg 50 μL 1N H2SO4 stop oplossing toe om de colorimetrische reactie te stoppen. Tik zachtjes op de plaat om een grondige menging te garanderen.
- Bepaal onmiddellijk de absorptie van elke put met behulp van een microplaatlezer ingesteld op 450 nm in een ELISA-platenspectrometer.
- Meet de absorptie met een ELISA-platenspectrometer in een eindpuntmodus met weinig schudden gedurende 10 s.
- Gemiddelde de absorptiewaarde van 450 nm van de standaard blanco monsters en trek deze af van andere 450 nm-waarden van standaard en onbekende monsters.
- Gebruik de standaardcurve om de lumicanconcentratie van elk onbekend monster te bepalen.
- Maak voor de berekening van de lumicanconcentratie een lineale regressiegrafiek met behulp van de absorptiewaarden op de Y-as tegen de concentraties in pg/ml op de X-as van elke standaard lumicancurve.
- Verkrijg de vergelijking van lineaire regressie en r-waarde om de lumicanconcentratie te berekenen.
OPMERKING: De concentratie lumican werd genormaliseerd met betrekking tot de mg geëxtraheerd weefsel. De resultaten worden uitgedrukt als genormaliseerde relatieve concentratiewaarden van lumican tot mg AM (ng/ml lumican/mg AM-weefsel).
- Verkrijg de vergelijking van lineaire regressie en r-waarde om de lumicanconcentratie te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten worden gerapporteerd als de gemiddelde waarde ± standaarddeviatie (SD). De t-tests van de student en de variantieanalyse (ANOVA) werden uitgevoerd. P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van statistische software (zie Tabel van materialen).
De totale eiwithoeveelheid in de AME werd beïnvloed door tijd en opslagomstandigheden. De basale eiwitconcentratie was vergelijkbaar bij alle AME; het bereik van het totale eiwit was 2,7 ± 0,3 μg/ml zonder een significant verschil tussen de geëvalueerde monsters. Toen de monsters echter 12, 20 en 32 dagen werden bewaard, werd variabiliteit in eiwitconcentratie ten opzichte van de basale concentratie waargenomen. Interessant is dat de eiwitconcentratie in de AME steeg bij 4 °C en -20 °C ten opzichte van de RT op alle momenten van opslag.
Evenzo, wanneer de eiwitconcentratie werd vergeleken tussen opslagtijden, veranderde deze na 12, 20 en 32 dagen. Een significant verschil (p < 0,05) werd gevonden in de AME van 32 en 20 dagen bij 4 °C en -20 °C in vergelijking met de RT-conditie (figuur 2), wat suggereert dat temperatuur belangrijk is voor eiwitbehoud in de verschillende verkregen AME.
Figuur 2: Totale eiwitconcentratie in AME beïnvloed door tijd en opslagtemperatuur. De concentratie van eiwitextractie op AME werd gekwantificeerd voor en na temperatuur- en tijdopslagomstandigheden. De geëvalueerde bewaartijd was 6 dagen (zwarte driehoeken), 12 dagen (roze driehoeken), 20 dagen (paars vierkant) en 32 dagen (bruine cirkels) in vergelijking met drie verschillende temperatuuromstandigheden (RT °C, 4 °C en -20 °C). De basale eiwitconcentratie was vergelijkbaar bij alle AME. Er was een significant verschil in eiwitconcentratie in de AME van 20 en 32 dagen met betrekking tot de basale eiwitconcentratie bij verschillende temperatuuromstandigheden. In elke toestand n = 3. De gegevens worden uitgedrukt als mediaan van μg/ml eiwit ± SE *p < 0,05 (S1 32 dagen vs. S1 20, 12 en 6 dagen bij 4 °C); (S1 32 dagen vs. S1 20, 12 en 6 dagen bij -20 °C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De Lumican-concentratie werd beïnvloed door de opslagtijd en temperatuuromstandigheden. Er werd minder concentratie lumican gevonden in de AME die 6, 20 en 32 dagen werd bewaard, vergeleken met 12 dagen opslag. Significant was dat de AME van 12 dagen een hogere concentratie lumican had dan 20 en 32 dagen opslag (p < 0,05).
Wanneer de lumicanconcentratie in de AME werd vergeleken tussen opslagtemperaturen, werd een hogere concentratie lumican gevonden bij opslag bij -20 °C en 4 °C gedurende 12 dagen (figuur 3). Interessant is dat zelfs een hogere (p < 0,05) concentratie lumican werd gevonden in de 12 dagen AME indien bewaard bij -20 °C in vergelijking met 4 °C.
Dit suggereert dat de concentratie lumican wordt beïnvloed door temperatuuromstandigheden en opslagtijd, wat suggereert dat de juiste opslagtijd en temperatuur om de hoogste concentratie lumican te bereiken 12 dagen bij -20 °C is.
Figuur 3: Totale lumicanconcentratie in AME beïnvloed door tijd en opslagtemperatuur. De Lumican-concentratie werd beïnvloed door de opslagtijd en temperatuuromstandigheden. De concentratie van lumican in AME werd gekwantificeerd voor en na temperatuur- en tijdopslagomstandigheden. De geëvalueerde bewaartijd was 6 dagen (zwarte driehoeken), 12 dagen (roze driehoeken), 20 dagen (paars vierkant) en 32 dagen (bruine cirkels) in vergelijking met drie verschillende temperatuuromstandigheden (RT °C, 4 °C en -20 °C). Lumican in de AME van 12 dagen was significant hoger in vergelijking met de AME van 32, 20 en 6 dagen, bij temperatuuromstandigheden van -20 °C en 4 °C. *p < 0,05 (S1 12 dagen vs. S1 32, 20 en 6 dagen bij 4 °C); p < 0,001 (S1 12 dagen vs. S1 32, 20 en 6 dagen bij -20°C). De hoogste concentratie lumican in AME was na 12 dagen bewaard bij -20 °C. ++p < 0,01 (S1 12 dagen 4 °C vs. S1 12 dagen -20 °C). Er was geen significant verschil tussen lumican in de AME van 32 en 20 dagen in vergelijking met opslagtemperatuurcondities (n.s). In elke toestand (n = 3) worden gegevens uitgedrukt als de mediaan van ng/ml eiwit. Gegevens werden genormaliseerd met betrekking tot mg weefsel ± SE. (n.s.) niet statistische significantie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werd de aanwezigheid van lumican in de AME geanalyseerd en de directe correlatie met de stabiliteit onder verschillende opslagomstandigheden. Interessant is dat wanneer de totale eiwitconcentratie in AME werd gekwantificeerd, de eiwitconcentratie na opslag toenam. Er zijn aanwijzingen voor drie mechanismen die de eiwitconcentratie in bevroren opslag kunnen veranderen: koude denaturatie, de bevroren concentratie van opgeloste stoffen en door ijs geïnduceerde gedeeltelijke ontplooiing van eiwitstructuur19. Het bevriezingsproces kan de eiwitconcentratie op opslagmonsters beïnvloeden als gevolg van de kristallisatie van de vloeibare fase in het monster. De resultaten suggereren dat dit kan zijn gebeurd als een proces van het bevriezen van de concentratie, beïnvloed door de opslagtijd in de vriezer. Een hogere concentratie eiwitten werd waargenomen bij langere opslagmomenten (32 en 20 dagen) en bij de koudste temperaturen (4 °C en -20 °C). De periode met de hoogste concentratie eiwit had echter niet de hoogste concentratie lumican; dit suggereert dat lumican kan worden beïnvloed door bevroren temperaturen en tijdsomstandigheden.
Volgens de resultaten was de lumicanconcentratie hoger en stabieler na 12 dagen opslag bij 4 °C en -20 °C. Niettemin werd een lagere concentratie lumican gevonden na 6 dagen in vergelijking met 12 dagen. Sommige rapporten suggereren dat de eiwitconcentratie kan veranderen na bevroren opslagomstandigheden20. De resultaten kunnen worden veroorzaakt door een thermodynamisch mechanisme genaamd ijs-geïnduceerde gedeeltelijke ontplooiing van de eiwitstructuur, wat gebeurt tijdens het bevriezen van monsters. De interactie van eiwitten met water in de waterige oplossingen vermindert hun interacties met andere moleculen. Het kristallisatieproces van water onder bevroren omstandigheden stelt eiwitten en sommige functionele gebieden in staat om te interageren met andere moleculen19. Door het bovenstaande, na 12 dagen invriezen van lumican in een waterige oplossing, zou het in staat kunnen zijn om te interageren met de antilichamen die aanwezig zijn in de ELISA-kwantificeringskit om te resulteren in een hogere concentratie. Aan de andere kant, waarschijnlijk op de zesde dag, had de lumican afgezonderd kunnen zijn in de waterige oplossing.
Bij het bevorderen van innovaties is het gebruik van AM de state-of-the-art behandeling voor cornea-re-epithelisatie, ongeacht de etiologie. Zoals eerder vermeld, zijn de voordelen van AM enorm 21,22,23,24,25,26. Veel auteurs hebben de voordelen van lumican in AME aangetoond, waardoor het een betaalbaar alternatief is specifiek voor ontwikkelingslanden 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Momenteel zijn er veel voordelen van lumican in AME; het gebruik ervan als behandeling bevordert corneale re-epithelisatie en verbetert de prognose van hoornvlieszweren 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. AM-transplantatie (AMT) is een behandeling geworden met grote voordelen voor het verbeteren van verschillende hoornvliesaandoeningen24,25. Er zijn echter enkele chronische aandoeningen van het hoornvliesweefsel, zoals aanhoudende epitheliale defecten (PED) en limbale stamceldeficiënties (LESCD), die een constante behandeling en onderhoud van de aanwezigheid van biologische factoren vereisen die het hoornvlies helpen herstellen21,24. Momenteel zijn er geen adjuvante behandelingen die langdurig onderhoud mogelijk maken van de factoren die door AMT op het hoornvliesoppervlak worden vrijgegeven. Een constante vervanging van de AMT kon echter niet worden aanbevolen voor de patiëntveiligheid26. Om deze reden is het noodzakelijk om alternatieven te ontwikkelen die de functies van AMT in staat stellen om te helpen en helpt de aanwezigheid van factoren die door AM in het hoornvliesweefsel worden vrijgegeven voor een langere tijd te behouden, met de bedoeling de behandeling van aanhoudende problemen van het hoornvlies te bevorderen27.
Lumican is een van de factoren die aanwezig zijn in AM met ontstekingsremmende en antifibrotische functies, waarvan is gemeld dat het functies heeft in het hoornvliesherstelproces 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Daarom stelt lumican voor om een goede kandidaat te zijn om te helpen bij de behandeling van cornea-aandoeningen; er is echter aanvullend onderzoek nodig om de werkzaamheid van lumican in AME te bepalen om cornea-re-epithelisatie te bereiken.
Lumican is een proteoglycaan waarvan is aangetoond dat het de afscheiding van extracellulaire matrixverbindingen als collageen reguleert; ook is het betrokken bij fibroblastactivering en modulatie van ontstekingscellen en het angiogeneseproces, dat een belangrijke rol speelt bij wondgenezing. Volgens de resultaten kan lumican worden geëxtraheerd uit AM-weefsel. Therapeutische toepassingen van lumican zijn talrijk; het gebruik van lumican in de AME maakt een haalbare therapeutische optie voor oogaandoeningenmogelijk 4,13. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van AME is dat het een eenvoudige toepassing biedt als een actuele behandeling voor het oculaire oppervlak, gezien de waterige samenstelling. Evenzo kunnen andere eiwitten met ontstekingsremmende en immunoregulerende kenmerken worden gevonden in de componenten die uit het AM-weefsel worden geëxtraheerd, wat een groter voordeel zou kunnen bieden bij de behandeling van de-epithelisatieproblemen in het oog. Bijvoorbeeld, andere ontstekingsremmende factoren zoals TSG-6 aanwezig in de AM en cellulaire componenten zijn eerder gemeld om immunoregulerende eigenschappen te hebben8. Hierbij zou een gecombineerde therapie van lumican en andere extracellulaire matrixverbindingen en immunomodulerende moleculen in de AME nuttig kunnen zijn bij het re-epithelisatie- en wondgenezingsproces.
Deze methode is bedoeld om een eenvoudige techniek voor eiwitextractie te demonstreren, nuttig voor de obtention van overvloedige eiwitten en factoren. Een van de kritische overwegingen voor deze methode is het gebruik van proteaseremmers, omdat het fundamenteel is voor succesvolle eiwitextractie, omdat de AM een weefsel is met veel enzymatische verbindingen om eiwitafbraak te voorkomen27. Er zijn aanwijzingen dat het gebruik van eiwitremmers samen met een waterige oplossing de extractie van andere factoren, zoals HGF, in AM-weefselverhoogt 26. De obtentie van een fijn poeder na het invriezen en aarden van de AM is noodzakelijk voor de optimale obtentie van AME, omdat dit proces geschikt is voor weefsel- en cellulaire verstoring van structuren die nodig zijn voor de extractie van cytosolische en andere nucleaire verbindingen28,29.
Een paar beperkingen van deze extractiemethode zijn dat de gebruikte AM-hoeveelheid geen grootschalige extractie mogelijk maakte. Dit protocol maakt eiwitextractie uit een beperkte hoeveelheid weefsel mogelijk; omdat er geen bewijs is dat deze methode het mogelijk maakt om een grotere hoeveelheid eiwit uit een groter weefselgebied te verkrijgen. Probleemoplossing die moet worden overwogen in vergelijking met andere extractiemethoden is het gebruik van een geschikte concentratie proteaseremmer en incubatietijd, omdat de overtollige enzymen eiwitten30 kunnen beïnvloeden en de werkzaamheid van de techniek kunnen verminderen.
Een deel van deze techniek is aangepast van die gerapporteerd door Mahbod et al.16, die beschrijft dat het herhalen van het centrifugatie- en extractieproces de eiwitextractie verhoogt. In tegenstelling tot Mahbod rapporteerden de resultaten geen eiwitconcentratie na drie cycli van centrifugatie. Wanneer de totale eiwitconcentratie werd bepaald, daalde deze met 80% in een tweede extractie en tot 97% in een derde extractie. Het uitvoeren van slechts één extractie vermindert de verwerkingstijd en vermindert de hoeveelheid totaal eiwit niet. Met het voorgaande vereist de hier gerapporteerde extractiemethode slechts één centrifugatiestap met gunstige resultaten.
Deze techniek kan worden gebruikt om andere factoren en eiwitten die aanwezig zijn in de AM te extraheren en verder, om factoren uit andere bronnen zoals dieren of groenten te verkrijgen. Het kan ook een toepassing hebben voor het verkrijgen van eiwitten om fundamenteel onderzoek uit te voeren of zelfs de ontwikkeling van formuleringen en behandelingen.
Deze resultaten suggereren dat lumican kan worden geëxtraheerd uit AM en gedurende 12 dagen kan worden bewaard als AME onder zowel -20 °C als 4 °C temperatuuromstandigheden. Het is belangrijk om de halfwaardetijd te overwegen om de therapeutische effecten van lumican als AME te bereiken. Verdere studies zijn nodig om de rol van AME lumican in cornea-epitheelcellen te bepalen en om de ideale dosis lumican voor cornea-re-epithelisatie te bepalen.
Concluderend suggereren de resultaten dat het verkrijgen van factoren zoals lumican in de AME mogelijk is. Evenzo beïnvloeden temperatuur- en opslagtijdomstandigheden de concentratie lumican in de AME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De studie werd gefinancierd door het ondersteuningsprogramma voor onderzoeks- en technologische innovatieprojecten van de Universidad Nacional Autonoma de Mexico (grant no. PAPIIT IN203821) en het ministerie van Onderwijs, Wetenschap, Technologie en Innovatie (grant nr. SECTEI 250/2019).
Acknowledgments
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
References
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
- Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
- Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479 (2005).
- Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
- Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426 (2017).
- Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
- Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
- Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
- Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
- Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
- Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
- Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
- Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
- Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88 (2005).
- Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
- Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
- McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292 (2019).
- Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
- Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
- Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
- Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
- Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
- Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
- Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
- Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).
