Summary
Het huidige werk beschrijft een nieuw experimenteel protocol dat een 3D-geprinte houder gebruikt om live cell imaging met hoge resolutie van enucleated globes mogelijk te maken. Via dit protocol kan de cellulaire calciumsignaleringsactiviteit in gewond hoornvliesepitheel van ex vivo globes in realtime worden waargenomen.
Abstract
Cornea-epitheliale wondgenezing is een migratieproces dat wordt geïnitieerd door de activering van purinerge receptoren die tot expressie komen op epitheelcellen. Deze activering resulteert in calciummobilisatiegebeurtenissen die zich van cel naar cel voortplanten, die essentieel zijn voor het initiëren van cellulaire beweeglijkheid in het wondbed, waardoor efficiënte wondgenezing wordt bevorderd. Het Trinkaus-Randall-lab heeft een methodologie ontwikkeld voor het in beeld brengen van de genezingsrespons van de hoornvlieswond in ex vivo muizenbollen in realtime. Deze aanpak omvat het enucleren van een intacte wereldbol van een muis die volgens vastgestelde protocollen is geëuthanaseerd en onmiddellijk de wereld incuberen met een calciumindicatorkleurstof. Een counterstain die andere kenmerken van de cel kleurt, kan in dit stadium worden toegepast om te helpen bij beeldvorming en cellulaire oriëntatiepunten te tonen. Het protocol werkte goed met verschillende levende celkleurstoffen die worden gebruikt voor counterstaining, waaronder SiR-actine om actine te kleuren en dieprode plasmamembraanvlek om het celmembraan te kleuren. Om de reactie op een wond te onderzoeken, wordt het hoornvliesepitheel verwond met behulp van een naald van 25 G en worden de bollen in een 3D-geprinte houder geplaatst. De afmetingen van de 3D-geprinte houder zijn gekalibreerd om immobilisatie van de wereldbol gedurende de duur van het experiment te garanderen en kunnen worden aangepast aan ogen van verschillende groottes. Live cell imaging van de wondrespons wordt continu uitgevoerd op verschillende diepten in het weefsel in de loop van de tijd met behulp van confocale microscopie. Dit protocol stelt ons in staat om beelden van hoge resolutie, publicatiekwaliteit te genereren met behulp van een 20x luchtdoel op een confocale microscoop. Voor dit protocol kunnen ook andere doelstellingen worden gebruikt. Het vertegenwoordigt een aanzienlijke verbetering van de kwaliteit van live cell imaging in ex vivo muizenbollen en maakt de identificatie van zenuwen en epitheel mogelijk.
Introduction
Hoornvlies
Het hoornvlies is een heldere, avasculaire structuur die het voorste oppervlak van het oog bedekt en die licht breekt om het zicht mogelijk te maken en het binnenste van het oog beschermt tegen schade. Omdat het hoornvlies wordt blootgesteld aan de omgeving, is het gevoelig voor schade door zowel mechanische oorzaken (krabben) als door infectie. Een hoornvliesletsel bij een verder gezonde patiënt geneest meestal binnen 1-3 dagen. Bij patiënten met onderliggende aandoeningen, waaronder limbale stamceldeficiëntie en diabetes type II, kan het genezingsproces van de hoornvlieswond echter sterk worden verlengd1. Omdat het hoornvlies sterk geïnnerveerd is, zijn deze niet-genezende hoornvlieszweren en terugkerende cornea-erosies zeer pijnlijk en verminderen ze de kwaliteit van leven van patiënten die ze ervarensterk 1.
Cel signalering
Wanneer een verder gezond hoornvlies gewond raakt, gaan calciumsignaleringsgebeurtenissen in de cellen naast de wond vooraf aan en leiden cellulaire migratie naar het wondbed, waar ze het letsel sluiten zonder het risico op littekens 2,3. Deze signaleringsgebeurtenissen zijn goed gekarakteriseerd in cornea-epitheelcelkweekmodellen met behulp van live cell imaging2. Voorlopige experimenten tonen significant meer calciumsignalering na verwonding in niet-diabetische cellen in vergelijking met diabetische cellen. De karakterisering van de celsignaleringsgebeurtenissen in ex vivo globes is echter een technische uitdaging gebleken.
Live cel beeldvorming
Eerdere studies hebben met succes calciumsignaleringsgebeurtenissen geregistreerd uit in vitro celkweekmodellen van corneawondgenezing 4,5,6. Het ontwikkelen van een methodologie om beelden van hoge kwaliteit te produceren van deze signaleringsgebeurtenissen in ex vivo weefsel is van groot belang omdat het de studie van deze gebeurtenissen in een complexer en levensecht systeem mogelijk zou maken. Eerdere benaderingen betroffen dissectie van het hoornvlies gevolgd door immobilisatie in een UV-geïnduceerde PEG-gel 7,8,9. Immobilisatie is een essentiële maar uitdagende stap bij het werken met levend weefsel, omdat het levensvatbaar en gehydrateerd moet blijven in de loop van het experiment. Bovendien mag immobilisatie het weefsel niet beschadigen. Hoewel de PEG-oplossing het weefsel immobiliseerde, waren de resolutie en kwaliteit van de geproduceerde beelden niet consistent. Daarom zijn 3D-geprinte houders ontwikkeld om intacte bollen te immobiliseren om beelden van hogere kwaliteit te produceren met minder risico op weefselschade.
De aanpak
Een unieke 3D-geprinte houder werd ontwikkeld om intacte ex vivo globes te immobiliseren voor live cell imaging. Deze houder voorkomt schade door twee belangrijke bronnen: het maakt beeldvorming van een enucleated bol mogelijk zonder de noodzaak om het hoornvlies te ontleden, en het elimineert blootstelling aan UV-licht. Zonder deze bronnen van schade gaven de verkregen beelden nauwkeuriger de reactie weer op de krasblessures die experimenteel werden gemaakt. Bovendien werd de 3D-geprinte houder gekalibreerd op de precieze afmetingen van het muizenoog. Dit zorgde voor een veel betere pasvorm dan immobilisatie in peg-oplossing, wat leidde tot een beeld van hogere kwaliteit bij lagere vermogens als gevolg van verminderde weefselbeweging. Een afdekbalk die aan de bovenkant van de houder is bevestigd, zorgt ervoor dat de wereldbol gedurende de hele duur van het experiment onbeweeglijk blijft en dat er geen verplaatsing van de aardbol plaatsvindt wanneer groeimedia worden aangebracht om de hydratatie en levensvatbaarheid te behouden. De mogelijkheid om de houder op precieze afmetingen te printen, stelt ons ook in staat om een optimale pasvorm te genereren voor muizenogen van verschillende groottes vanwege de leeftijd of ziektestatus. Deze technologie kan breder worden toegepast om houders voor de ogen van verschillende soorten te ontwikkelen op basis van hun afmetingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedures met betrekking tot dierlijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research en het Boston University IACUC-protocol (201800302).
1. Ontwerpen van de 3D-geprinte houders en cover bar
- Ontwerp de 3D-geprinte houders en de afdekbalk rekening houdend met de gemiddelde diameter van muisbollen en 3D-print het ontwerp (figuur 1A, B).
- Houd de diameter van de binnenwand van de houder iets groter dan de gemiddelde diameter van de wereldbol om rekening te houden met de verschillende groottes van individuele muizen. Houd de hoogte van de houder op ongeveer de helft van de diameter van de wereldbol, zodat de wereldbol nauw aansluit wanneer deze wordt vastgezet door de 3D-geprinte afdekbalk.
- Pas de afdekbalk van de houder aan de lengte van de buitendiameter van de houder aan met een breedte van 1/4 tot 1/2 van de diameter van de houder. De afdekbalk is zo groot dat deze toegang heeft tot de wereldbol wanneer deze in de houder is bevestigd voor hydratatie en het verwijderen van het oog aan het einde van het experiment.
- Druk de houder en de afdekbalk af.
2. Monsterverzameling
- Euthanasie muizen (mannelijke C57BL/6 muizen van 9-12 weken en 27 weken oud werden gebruikt voor deze studie) met behulp van gevestigde protocollen in overeenstemming met institutionele richtlijnen. Voer voor dit protocol euthanasie uit met koolstofdioxide gevolgd door onthoofding.
- Verwijder de muiskop en plaats deze onmiddellijk op ijs om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. Enucleate de bollen met behulp van dissectietools en voorkom weefselschade.
- Proptose de wereldbol met behulp van een pincet. Knip de oogzenuw met behulp van een dissectieschaar net onder de plek waar deze door het pincet wordt vastgehouden.
OPMERKING: Voer voor verdere voorzorgsmaatregelen de volgende stappen uit in een laminaire stromingskap. - Incubeer de bollen in 2 ml medium in een p35 celkweekschaal inclusief een calciumindicator en/of celmembraanvlek gedurende 1 uur in een 37 °C, 5% CO2-incubator met weinig licht. Zorg ervoor dat de bollen worden ondergedompeld in het kleuringsmedium voor uniforme kleuring.
- Gebruik voor de experimenten die hier worden uitgevoerd de calciumindicator, Fluo4-AM (1:100)2, en celmembraantellervlek, dieprode plasmamembraanvlek (1:10.000)2, met een eindconcentratie van 1% (v/v) DMSO en 0,1% (w/v) pluroninezuur in 2 ml keratinocytenserumvrij medium (KSFM) met de volgende groeisupplementen: 25 μg/ml runderknoefyse-extract, 0,02 nM epidermale groeifactor, 0,3 mM CaCl2 en penicilline-streptomycine (respectievelijk 100 eenheden /ml en 100 μg / ml).
OPMERKING: De incubatieomstandigheden en -tijden zijn variabel, afhankelijk van de calciumindicator, het weefseltype en het monstervolume. Bij het gebruik van pluroninezuur is voorzichtigheid geboden omdat het weefseldoorlatend maakt. Dit protocol vraagt om 10% pluroninezuur. Lagere concentraties pluroninezuur zijn experimenteel vastgesteld om niet effectief te zijn en hogere concentraties riskeren schade aan het weefsel.
- Gebruik voor de experimenten die hier worden uitgevoerd de calciumindicator, Fluo4-AM (1:100)2, en celmembraantellervlek, dieprode plasmamembraanvlek (1:10.000)2, met een eindconcentratie van 1% (v/v) DMSO en 0,1% (w/v) pluroninezuur in 2 ml keratinocytenserumvrij medium (KSFM) met de volgende groeisupplementen: 25 μg/ml runderknoefyse-extract, 0,02 nM epidermale groeifactor, 0,3 mM CaCl2 en penicilline-streptomycine (respectievelijk 100 eenheden /ml en 100 μg / ml).
3. Voorbereiding van de monsterhouders
- Hecht de houders aan een schone glazen bodemafdekking met lijm die nog niet eerder is gebruikt. De lijm die in dit protocol wordt gebruikt, is afkomstig van containers voor eenmalig gebruik om steriliteit te garanderen en er wordt elke keer een nieuwe, ongeopende container gebruikt.
- Was de houder in 70% ethanol. Plaats lijm op de houder en bevestig de houder aan de glazen bodemafdekking. Zorg ervoor dat er geen lijm in het binnenste gedeelte van de houder zit, omdat lijm kan fluoresceren, wat de beeldvorming bemoeilijkt.
- Wacht tot de lijm stolt. Controleer of de houder veilig is tegen de coverslip.
OPMERKING: P35-celplaten met deksels met glazen bodem werden gebruikt voor de experimenten die in dit manuscript worden gepresenteerd. Andere glasbodemplaten en/of platen kunnen worden vervangen op basis van de behoeften van het experiment.
4. Verwonding van de oogbollen
- Verwijder de bollen van de kleuringsoplossing met behulp van steriele oogdruppels en zorg ervoor dat weefselschade aan het betreffende gebied wordt voorkomen. Was de bollen gedurende 5 minuten op kamertemperatuur met behulp van steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing om overtollige vlekken te verwijderen en plaats de bollen in het medium voor transport naar de microscoop.
- Wond de bollen met een steriele naald van 25 G in het interessante gebied.
- Pak met behulp van een steriele oogdruppel de wereldbol op en houd deze vast vanaf de achterkant van het oog. Dit houdt de wereldbol stabiel, voorkomt dat deze rolt en maakt het mogelijk om consistente wonden te maken. Met behulp van deze opstelling bevindt de oogzenuw zich in het mondstuk van de oogdruppel en is het hoornvlies naar buiten gericht.
- Beweeg voor een krabwond voorzichtig een steriele naald van 25 G over het blootgestelde hoornvlies. Voor een prikwond drukt u de naald voorzichtig rechtstreeks in het centrale hoornvlies. Zorg ervoor dat de wond het hoornvlies niet doorboort.
OPMERKING: Sla deze stap over als een wondreactie of gewonde omgeving niet vereist is voor het experiment. Eerdere studies hebben aangetoond dat zowel krabwonden als prikwonden aan muizenhoornvliezen die met deze methode zijn gemaakt, consistent zijn in zowel diameter als diepte10. Bevestiging van de wondafmetingen tussen onafhankelijke globes werd uitgevoerd met behulp van een regio van belanganalyse.
5. Monsterplaatsing op de houder
- Plaats het hoornvlies of limbale gebied op de coverslip in het binnenste gedeelte van de houder en stabiliseer met behulp van de 3D-geprinte omslag (figuur 1C-H).
- Controleer of de wereldbol correct is geplaatst en of de interessante plaats in contact staat met de glazen afdekplaat. Zodra de bol in de houder is geplaatst, probeer dan niet om de bol te verwijderen, omdat dit weefselschade kan veroorzaken.
- Bevestig de 3D-geprinte hoes met lijm aan de houder, waardoor stabilisatie wordt gegarandeerd. Zorg ervoor dat de afdekbalk aan de houder hecht en niet aan de wereldbol.
OPMERKING: Het gebied dat moet worden afgebeeld, wordt naar beneden geplaatst omdat het protocol is geschreven voor gebruik op een omgekeerde microscoop. Het protocol kan worden aangepast voor rechtopstaande microscopen met behulp van houders met een kleinere binnenradius en het verwijderen van de afdekbalk. Dit zal resulteren in minder globestabilisatie.
6. Voorbeeld beeldvorming
- Schakel de microscoop en omgevingskamer in en controleer of de kamer is bevochtigd. Stel de omgevingskamer in op 35 °C en 5% CO2 voor de duur van het experiment.
OPMERKING: Microscopen met omgevingskamers hebben de voorkeur voor deze procedure om uitdroging te voorkomen en om de aardbol op optimale temperaturen te houden, maar zijn niet vereist. - Plaats de coverslip, houder en gestabiliseerde bol op het microscoopstadium in de omgevingskamer en afbeelding met behulp van live cell imaging-technieken9.
- Pipetteer extra groeimedia op de coverslip om uitdroging te voorkomen en de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. Zorg ervoor dat er voldoende medium in de put zit om de wereldbol in de houder te bedekken. Afhankelijk van de duur van de beeldvorming, voeg nieuw medium toe wanneer dat nodig is tijdens het experiment.
- Begin met experimenten met behulp van live cell imaging technieken en protocollen. Gebruik laserinstellingen met een laag vermogen om het weefsel te behouden en weefselschade te voorkomen in langdurige experimenten. Gebruik geschikte doelstellingen voor lange werkafstanden. De experimenten in dit manuscript werden uitgevoerd met behulp van een 20x-objectief.
OPMERKING: Het laservermogen en de versterking, de experimentele duur, de locatie en het beeldvlak zijn allemaal variabelen, afhankelijk van de experimentele parameters. Beeldexperimenten op intacte bollen variërend van 1 uur tot 4 uur duur zijn met succes uitgevoerd in eerdere publicaties10. - Record en sla gegevens op in de gewenste bestandsindeling. De software die door de microscoop wordt gebruikt, produceert .czi-bestanden voor gegevensregistratie.
- Gooi de globes weg volgens de standaard institutionele protocollen aan het einde van het protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol is gebruikt om consistent gegevens en afbeeldingen van publicatiekwaliteit te produceren10. De verkregen beelden vertegenwoordigen een aanzienlijke verbetering in vergelijking met eerdere benaderingen (figuur 2). Met behulp van de 3D-geprinte houder kunnen beelden worden vastgelegd in de lagen van het hoornvlies en kan calciummobilisatie in verschillende z-vlakken worden waargenomen (figuur 3). Deze benadering is gebruikt om celcelsignalering te vergelijken tussen apicale en basale cellagen aan een wond bij jonge en oude muizen10.
De verbeterde stabiliteit heeft het ook mogelijk gemaakt om globes aanzienlijk langer in beeld te brengen dan voorheen mogelijk was. Hierdoor konden studies van cellulaire migratie naar het wondbed met enkele uren worden verlengd dan eerdere mogelijkheden. Met deze verlengde tijdlijn kunnen substantiële verschillen in cellulair gedrag worden waargenomen tijdens de wondgenezingsreactie tussen jonge en oude muizen na hoornvliesletsel10. Voor dit protocol werden gedurende 4 uur elke 5 min gegevens verzameld. Bij gebruik van de houder werd in de loop van het experiment geen significante drift waargenomen in de x-, y- of z-vlakken (figuur 4, video 1).
Een voordeel van dit protocol is dat hiermee verschillende gebieden van het hoornvlies in beeld kunnen worden gebracht op basis van de plaatsing van de bol in de houder. In een recente publicatie werd van deze functie gebruik gemaakt om afbeeldingen te verzamelen, zowel bij het centrale hoornvlies als in het cornea-limbale gebied (figuur 5)10. Een verwonding aan het centrale hoornvlies bleek calciumsignaleringsgebeurtenissen te produceren in cellen naast de zenuwen in het limbale gebied10. De veelzijdigheid van de houder gaat verder dan het stabiliseren van de wereldbol voor beeldvormingsexperimenten en is gebruikt voor verschillende toepassingen. Door het hoornvlies met de voorkant naar boven in de houder te plaatsen, werden nano-indentatie-experimenten uitgevoerd om de stijfheid van het hoornvliesepitheel, het keldermembraan en stroma bij jonge en oude muizen10,11 te meten.
Figuur 1: Schema's en opstelling van de 3D-geprinte houder. (A) Ontwerp van de 3D-geprinte houder met geannoteerde hoogte- en breedteafmetingen. (B) Afbeelding van een representatief CAD-bestand van de 3D-printersoftware. C) Representatieve afbeelding van de houder met de bijgevoegde omslag met een muizenbol. (D) Steriele lijm voor eenmalig gebruik wordt aangebracht op de onderkant van de 3D-geprinte houder. (E) De 3D-geprinte houder is bevestigd aan een p35-celkweekschaal met glazen bodem. (F) Een enucleated bol wordt met behulp van een steriele oogdruppel hoornvlies in de houder geplaatst. (G) De afdekbalk is bevestigd aan de bovenkant van de 3D-geprinte houder om immobilisatie van de wereldbol te garanderen. (H) De glasbodemplaat met een verkleefde houder en wereldbol wordt op het microscooppodium geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het gebruik van gespecialiseerde 3D-geprinte houders om de wereldbol te stabiliseren en beeldgegevens van hogere kwaliteit van meerlagige structuren te produceren. (A) en (B) vertegenwoordigen typische live imaging-gegevens van een gewond ex vivo hoornvlies gestabiliseerd zonder en met een 3D-geprinte houder, respectievelijk. Calciumsignaleringsgebeurtenissen (groen) en celtellerstain (dieprode plasmamembraankleuring) kunnen duidelijk worden geïdentificeerd in de apicale, basale en stromale lagen van het hoornvlies in (B) maar niet in (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Z-stack van een hoornvlies geïmmobiliseerd in de 3D-geprinte houder. Representatieve afbeeldingen van een z-stapel genomen door de lagen van het hoornvlies bij een kraswond (aangeduid met een wit sterretje). Het monster is gekleurd met dieprode plasmamembraanvlek om de celmembranen te visualiseren en Fluo4-AM (groen) om calciumsignalering te visualiseren. (A) De apicale cellaag, (B) apicale en basale cellen, (C) basale cellaag en (D) stroma zijn te zien in het wondbed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatief 4 uur tijdreeksexperiment van een hoornvlies dat weinig beweging van de aardbol in de x-, y- of z-richting onthult. De afbeelding is van een kraswondletsel (aangeduid met een wit sterretje) bij het centrale hoornvlies van een ex vivo muizenbol. De wereldbol is gekleurd met dieprode plasmamembraanvlek om de celmembranen te visualiseren en Fluo4-AM (groen) om calciumsignaleringsgebeurtenissen te visualiseren. De wereldbol wordt geïmmobiliseerd met behulp van een 3D-geprinte houder. De foto's zijn 1 uur na elkaar genomen, beginnend 5 minuten na het letsel. In de loop van het experiment werd weinig drift in de x-, y- of z-richting waargenomen met behulp van deze beeldvormingsopstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Diagram van beeldlocaties op een intacte wereldbol. De 3D-geprinte houder maakt beeldvorming van een intacte ex vivo wereldbol op verschillende locaties mogelijk. De houder werd gebruikt om beelden te verzamelen van zowel de centrale als de limbale regio's van het hoornvlies. Globes zijn gekleurd met dieprode plasmamembraanvlek om de celmembranen te detecteren en Fluo4-AM (groen) om calciumsignalering te detecteren. (A) Representatief beeld van het centrale hoornvlies bij een krabwond. (B) Representatief beeld van het limbale gebied van het hoornvlies na een verwonding aan het centrale hoornvlies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Film van een wereldbol geïmmobiliseerd in een 3D-geprinte houder gedurende 4 uur. Een wereldbol werd geïmmobiliseerd met de 3D-geprinte houder en gekleurd met dieprode plasmamembraanvlek (rood) om de celmembranen te visualiseren en Fluo4-AM (groen) om calciumsignaleringsgebeurtenissen te visualiseren. Een foto werd elke 5 minuten gedurende 4 uur gemaakt, beginnend 5 minuten na het letsel. In de loop van het experiment werd weinig drift in de x-, y- of z-richting waargenomen met behulp van deze beeldvormingsopstelling. De afspeelsnelheid is 30 frames per seconde. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een live cell imaging-techniek die een 3D-geprinte houder gebruikt om intacte dierenogen te stabiliseren en te immobiliseren. Het is ontworpen om verschillende belangrijke nadelen te omzeilen die worden erkend met eerdere live cell imaging-protocollen van ex vivo hoornvliesweefsel. Dit protocol biedt veel voordelen voor de live cell imaging van intacte globes. Het vermindert aanzienlijk onnodige weefselschade die de wondgenezingsreactie op experimenteel geïnduceerde kraswonden zou kunnen verstoren. Dit omvat schade aan de zenuwen en het epitheel door dissectie en blootstelling aan UV-licht. Bovendien vergemakkelijkt dit protocol weefselhydratatie en levensvatbaarheid door het weefsel te immobiliseren op een manier die het mogelijk maakt om het groeimedium periodiek toe te passen zonder verstoring van de experimenten. Door de oriëntatie van het oog in de houder te veranderen, maakt het protocol de beeldvorming van verschillende regio's op de wereldbol mogelijk. Het gebruik van confocale microscopie samen met dit protocol maakt de beeldvorming van verschillende gebieden van de wereld mogelijk, waardoor de observatie van interacties tussen weefselstructuren mogelijk is. Het protocol is zeer veelzijdig en kan worden aangepast aan globes van verschillende groottes van muizen en andere soorten. De houders en deksels kunnen eenvoudig uit de beeldvormende putten worden verwijderd, gesteriliseerd en hergebruikt. Het 3D-printprotocol is efficiënt en tijdbesparend, waardoor het gemakkelijk is om veel houders tegelijk te maken. De bollen kunnen in de houders worden bevestigd als de monsters op een later tijdstip moeten worden bewaard en opnieuw in beeld gebracht. Vast weefsel behoudt dieprode plasmamembraanvlekken en Fluo4-AM-vlekken gedurende enkele weken na fixatie, die kunnen worden gebruikt als markers bij het kleuren voor een specifiek eiwit of de specifieke eiwitten.
Eerdere protocollen riepen op tot dissectie van het oog en het daaropvolgende gebruik van een UV-geactiveerde PEG-gel om het hoornvlies te immobiliseren voor beeldvorming 7,8,9. Schade aan het weefsel opgelopen door deze technieken kan de experimentele resultaten verstoren. Dit is vooral belangrijk om te overwegen bij het bestuderen van de cellulaire en weefselprocessen die betrokken zijn bij wondgenezing, omdat deze extra schade buiten de experimenteel aangebrachte wonden de wondgenezingsrespons kan veranderen 4,12. De invoer van sensorische corneazenuwen zal worden beïnvloed door het vorige protocol, omdat het dissectieproces de zenuwen van hun cellichamen in het trigeminusganglion13 doorsnijdt. Bovendien zou de dissectie van het hoornvlies zelf een letselrespons veroorzaken, omdat oplosbare factoren die vrijkomen uit een verwonding verantwoordelijk zijn voor de wondgenezingsreactie4. Deze nieuwe procedure pakt deze zwakheden aan door de bollen intact in beeld te brengen. Met behulp van deze methodologie is schade aan het oog beperkt tot het snijden van de oogzenuw bij enucleatie en handhaaft de levensvatbaarheid van de cel in het hoornvlies gedurende langere tijd. Samen zorgen deze verbeteringen voor een betere simulatie van de wondrespons.
Immobilisatie is een essentiële maar uitdagende stap bij het werken met levend weefsel, omdat het levensvatbaar en gehydrateerd moet blijven in de loop van het experiment. Hoewel de hoornvliezen en bollen kunnen worden vastgezet met UV-geïnduceerde PEG-gel, vereist de procedure UV-bestraling na het plaatsen van het weefsel in de houder8. Er werd waargenomen dat de bestraling die nodig is om de PEG te polymeriseren de cellulaire responsiviteit verminderde. Bovendien verlaagde de PEG de resolutie van de beelden en was de AiryScan-functie nodig om celsignalering te observeren. In dit nieuwe protocol zijn de afmetingen van de houder geoptimaliseerd om precies op de bollen te passen en biedt de afdekbalk een extra immobilisatielaag. De houder en de afdekbalk elimineren de noodzaak om PEG te gebruiken, die beelden van hogere kwaliteit en een hogere resolutie produceert met realtime beelden van het wondgenezingsproces. Een oplossing voor de bovengenoemde problemen zou zijn om volledig af te zien van live cell imaging en de bollen te fixeren in paraformaldehyde (4%) op vooraf bepaalde tijden na letsel. Met vast weefsel kunnen echter lopende cellulaire processen zoals calciumsignalering en de effecten van deze processen op fysieke veranderingen in het weefsel niet worden waargenomen. Voor groepen die geïnteresseerd zijn in het registreren en kwantificeren van communicatiegebeurtenissen tussen cellen in het hoornvliesepitheel, maken de limieten opgelegd door weefselfixatie deze techniek onpraktisch voor dergelijke doeleinden.
Dit nieuwe protocol kent twee belangrijke stappen: (1) euthanasie en onmiddellijke globe enucleatie, en (2) positionering en oriëntatie van de globe binnen de houder. Het snijden van de oogzenuw en enucleatie van de bol moet zorgvuldig worden uitgevoerd door het oog te proptoeren zonder een brace te plaatsen om de interne en externe structuren te behouden. Positionering en oriëntatie zijn noodzakelijk voor de beeldvorming van de sites van belang en ervoor zorgen dat een zo groot mogelijk gezichtsveld in focus is met voldoende detail. Correcte plaatsing van de wereldbol is noodzakelijk voordat de afdekbalk op de houder wordt aangebracht.
Verschillende variabelen van het protocol kunnen worden aangepast afhankelijk van de vereisten van de experimentele parameters. De houders kunnen in verschillende formaten worden bedrukt om plaats te bieden aan globes van verschillende volumes. De parameters met betrekking tot de diameter en hoogte van de houder ten opzichte van de grootte van de wereldbol blijven hetzelfde voor alle groottebereiken. Als de gebruiker drift in het z-vlak ervaart, kan de mogelijke reden zijn dat het weefsel niet is geïmmobiliseerd en dat de houder opnieuw moet worden vervaardigd. De kleuring van de intacte bollen kan worden aangepast afhankelijk van de experimentele parameters, de gebruikte vlekken en de optimale omgeving en concentraties voor het weefsel van belang. De experimentele duur kan worden aangepast zolang de levensvatbaarheid van het weefsel behouden blijft. Kortdurende experimenten met 1 uur constante beeldvorming van het weefsel en langetermijnexperimenten met beeldvorming van het weefsel met regelmatige tussenpozen in de loop van 4 uur zijn beide met succes uitgevoerd. Deze experimenten werden uitgevoerd op een omgekeerde microscoop en dit protocol is ontworpen voor optimaal gebruik met een vergelijkbare beeldvormingsopstelling. Zodra de bol is gestabiliseerd en in de houder is geplaatst, kan het verwijderen van de bol leiden tot weefselschade; daarom zijn een optimale positionering en oriëntatie van de wereldbol voordat de afdekbalk wordt bevestigd essentieel. De bollen kunnen worden gefixeerd in 4% paraformaldehyde terwijl ze nog steeds binnen de houders zijn voor verdere analyse van eiwitlokalisatie. Voorlopige gegevens hebben aangetoond dat dieprode plasmamembraanvlek en Fluo4-AM-kleuring beide behouden blijven tijdens het fixatieproces.
Hoewel dit protocol veel voordelen heeft ten opzichte van eerdere protocollen, zijn er een paar beperkingen aan deze experimentele aanpak. Een nadeel is dat het moeilijk is om de bol van de houder te verwijderen zonder het hoornvliesepitheel te beschadigen. De wereldbol moet dus in de houder worden gefixeerd voor herbeeldvorming met behulp van eiwit- of RNA-lokalisatiemethoden op een later tijdstip. Dit kan vervolgonderzoeken beperken. Een ander nadeel van dit protocol tijdens langdurige beeldvormingsprotocollen is dat de hydratatie moet worden gehandhaafd. De noodzaak om de media handmatig opnieuw aan te brengen met regelmatige tussenpozen vereist dat iemand het beeldvormingsproces actief controleert op de omvang van het experiment. Dit kan logistiek een uitdaging zijn voor uitgebreide beeldvormingsprotocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
We willen de NIH bedanken voor de volgende subsidiesteun: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) en 5T32GM008541-24 (KS). We willen ook het Massachusetts Lions Eye Research Fund en het New England Corneal Transplant Fund erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
