Summary
वर्तमान कार्य एक नए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो एक 3 डी मुद्रित धारक का उपयोग करता है ताकि एन्यूक्लिएटेड ग्लोब के उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव सेल इमेजिंग को सक्षम किया जा सके। इस प्रोटोकॉल के माध्यम से, पूर्व विवो ग्लोब से घायल कॉर्नियल एपिथेलियम में सेलुलर कैल्शियम सिग्नलिंग गतिविधि वास्तविक समय में देखी जा सकती है।
Abstract
कॉर्नियल उपकला घाव भरने एक प्रवासी प्रक्रिया है जो उपकला कोशिकाओं पर व्यक्त प्यूरीनेर्जिक रिसेप्टर्स के सक्रियण से शुरू होती है। इस सक्रियण के परिणामस्वरूप कैल्शियम जुटाने की घटनाएं होती हैं जो कोशिका से कोशिका तक फैलती हैं, जो घाव बिस्तर में सेलुलर गतिशीलता शुरू करने के लिए आवश्यक हैं, कुशल घाव भरने को बढ़ावा देती हैं। ट्रिंकॉस-रैंडल प्रयोगशाला ने वास्तविक समय में विवो म्यूरिन ग्लोब में कॉर्नियल घाव भरने की प्रतिक्रिया की इमेजिंग के लिए एक पद्धति विकसित की है। इस दृष्टिकोण में एक माउस से एक बरकरार ग्लोब को एन्यूक्लिएटिंग करना शामिल है जिसे स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार इच्छामृत्यु दी गई है और तुरंत कैल्शियम इंडिकेटर डाई के साथ ग्लोब को इनक्यूबेट करना शामिल है। एक काउंटरस्टेन जो सेल की अन्य विशेषताओं को दागता है, इस स्तर पर इमेजिंग में सहायता करने और सेलुलर लैंडमार्क दिखाने के लिए लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल ने काउंटरस्टेनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले कई अलग-अलग लाइव सेल रंगों के साथ अच्छी तरह से काम किया, जिसमें एक्टिन को दागने के लिए एसआईआर एक्टिन और कोशिका झिल्ली को दागने के लिए गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली का दाग शामिल है। घाव की प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए, कॉर्नियल एपिथेलियम को 25 जी सुई का उपयोग करके घायल किया जाता है, और ग्लोब को 3 डी मुद्रित धारक में रखा जाता है। प्रयोग की अवधि के दौरान दुनिया के स्थिरीकरण को सुनिश्चित करने के लिए 3 डी मुद्रित धारक के आयामों को कैलिब्रेट किया जाता है और विभिन्न आकारों की आंखों को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। घाव प्रतिक्रिया की लाइव सेल इमेजिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके समय के साथ ऊतक में विभिन्न गहराई पर लगातार की जाती है। यह प्रोटोकॉल हमें कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर 20x वायु उद्देश्य का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन, प्रकाशन-गुणवत्ता वाली छवियों को उत्पन्न करने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के लिए अन्य उद्देश्यों का भी उपयोग किया जा सकता है। यह एक्स विवो म्यूरिन ग्लोब में लाइव सेल इमेजिंग की गुणवत्ता में एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है और नसों और उपकला की पहचान की अनुमति देता है।
Introduction
कार्निया
कॉर्निया आंख की पूर्ववर्ती सतह को कवर करने वाली एक स्पष्ट, संवहनी संरचना है जो दृष्टि को सक्षम करने के लिए प्रकाश को अपवर्तित करती है और आंख के इंटीरियर को नुकसान से बचाती है। जैसा कि कॉर्निया पर्यावरण के संपर्क में है, यह यांत्रिक कारणों (खरोंच) और संक्रमण दोनों से नुकसान के लिए अतिसंवेदनशील है। एक अन्यथा स्वस्थ रोगी में कॉर्नियल की चोट आमतौर पर 1-3 दिनों के भीतर ठीक हो जाती है। हालांकि, लिम्बल स्टेम सेल की कमी और टाइप 2 मधुमेह सहित अंतर्निहित स्थितियों वाले रोगियों में, कॉर्नियल घाव भरने की प्रक्रियाबहुत लंबी हो सकती है। चूंकि कॉर्निया अत्यधिक आंतरिक है, ये गैर-उपचार कॉर्नियल अल्सर और आवर्तक कॉर्नियल क्षरण बहुत दर्दनाक हैंऔर उन्हें अनुभव करने वाले रोगियों के जीवन की गुणवत्ता को बहुत कम करते हैं।
सेल सिग्नलिंग
जब एक अन्यथा स्वस्थ कॉर्निया घायल हो जाता है, तो घाव से सटे कोशिकाओं में कैल्शियम सिग्नलिंग की घटनाएं घाव के बिस्तर में सेलुलर प्रवास से पहले और प्रेरित करती हैं, जहां वे 2,3 के जोखिम के बिना चोट को बंद कर देते हैं। लाइव सेल इमेजिंग 2 का उपयोग करके कॉर्नियल एपिथेलियल सेल कल्चर मॉडल में इन सिग्नलिंग घटनाओं को अच्छी तरह से चित्रित किया गयाहै। प्रारंभिक प्रयोगों में मधुमेह कोशिकाओं की तुलना में गैर-मधुमेह कोशिकाओं में चोट के बाद काफी अधिक कैल्शियम सिग्नलिंग का प्रदर्शन किया गया है। हालांकि, एक्स विवो ग्लोब्स में सेल सिग्नलिंग घटनाओं का लक्षण वर्णन एक तकनीकी चुनौती साबित हुआ है।
लाइव सेल इमेजिंग
पिछले अध्ययनों ने कॉर्नियल घाव भरने के इन विट्रो सेल कल्चर मॉडल से कैल्शियम सिग्नलिंग घटनाओं को सफलतापूर्वक दर्ज किया है। पूर्व विवो ऊतक में इन सिग्नलिंग घटनाओं की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों का उत्पादन करने के लिए एक पद्धति विकसित करना बहुत रुचि का है क्योंकि यह इन घटनाओं के अध्ययन को अधिक जटिल और सच्चे-से-जीवन प्रणाली में अध्ययन करने की अनुमति देगा। पिछले दृष्टिकोणों में कॉर्निया का विच्छेदन शामिल है, जिसके बाद यूवी-प्रेरित पीईजी जेल 7,8,9 में स्थिरीकरण होता है। जीवित ऊतक के साथ काम करते समय स्थिरीकरण एक आवश्यक लेकिन चुनौतीपूर्ण कदम है, क्योंकि यह प्रयोग के दौरान व्यवहार्य और हाइड्रेटेड रहना चाहिए। इसके अलावा, स्थिरीकरण ऊतक को नुकसान नहीं पहुंचाना चाहिए। जबकि पीईजी समाधान ने ऊतक को स्थिर कर दिया, उत्पादित छवियों का संकल्प और गुणवत्ता सुसंगत नहीं थी। इसलिए, ऊतक क्षति के कम जोखिम के साथ उच्च गुणवत्ता वाली छवियों का उत्पादन करने के लिए बरकरार ग्लोब को स्थिर करने के लिए 3 डी मुद्रित धारकों को विकसित किया गया था।
दृष्टिकोण
लाइव सेल इमेजिंग के लिए बरकरार पूर्व विवो ग्लोब को स्थिर करने के लिए एक अद्वितीय 3 डी मुद्रित धारक विकसित किया गया था। यह धारक दो प्रमुख स्रोतों से क्षति को रोकता है: यह कॉर्निया को विच्छेदित करने की आवश्यकता के बिना एक एन्यूक्लिएटेड ग्लोब की इमेजिंग की अनुमति देता है, और यह यूवी प्रकाश के संपर्क को समाप्त करता है। क्षति के इन स्रोतों के बिना, प्राप्त छवियों ने प्रयोगात्मक रूप से किए गए खरोंच की चोटों की प्रतिक्रिया का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व किया। इसके अलावा, 3 डी मुद्रित धारक को मुराइन आंख के सटीक आयामों के लिए कैलिब्रेट किया गया था। इसने पीईजी समाधान में स्थिरीकरण की तुलना में बहुत बेहतर फिट प्रदान किया, जिससे ऊतक आंदोलन में कमी के कारण कम शक्ति वाले उद्देश्यों पर उच्च गुणवत्ता वाली छवि बनी। धारक के शीर्ष से जुड़ी एक कवर पट्टी यह सुनिश्चित करती है कि प्रयोग की अवधि के दौरान ग्लोब स्थिर रहता है और जब हाइड्रेशन और व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए विकास मीडिया लागू किया जाता है तो ग्लोब का कोई विस्थापन नहीं होता है। सटीक आयामों पर धारक को प्रिंट करने की क्षमता भी हमें उम्र या बीमारी की स्थिति के कारण विभिन्न आकारों की मुराइन आंखों के लिए एक इष्टतम फिट उत्पन्न करने की अनुमति देती है। इस तकनीक को उनके आयामों के आधार पर विभिन्न प्रजातियों की आंखों के लिए धारकों को विकसित करने के लिए अधिक व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।
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Protocol
पशु विषयों से जुड़ी प्रक्रियाओं को ओप्थाल्मिक केयर एंड विजन रिसर्च में जानवरों के उपयोग के लिए एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी और बोस्टन यूनिवर्सिटी आईएसीयूसी प्रोटोकॉल (201800302) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. 3 डी मुद्रित धारकों और कवर बार को डिजाइन करना
- माउस ग्लोब के औसत व्यास के लिए 3 डी मुद्रित धारकों और कवर बार को डिजाइन करें और 3 डी प्रिंट डिजाइन (चित्रा 1 ए, बी)।
- अलग-अलग चूहों के विभिन्न आकारों के लिए धारक की आंतरिक दीवार का व्यास ग्लोब के औसत व्यास से थोड़ा बड़ा रखें। होल्डर की ऊंचाई ग्लोब व्यास के लगभग आधे पर रखें, 3 डी मुद्रित कवर बार द्वारा सुरक्षित होने पर ग्लोब का एक तंग फिट सुनिश्चित करें।
- धारक कवर पट्टी को धारक के बाहरी व्यास की लंबाई तक आकार दें, जिसकी चौड़ाई धारक व्यास की 1/4 से 1/2 है। कवर बार का आकार हाइड्रेशन के लिए धारक में सुरक्षित होने और प्रयोग के समापन पर आंख को हटाने पर ग्लोब तक पहुंच की अनुमति देने के लिए किया जाता है।
- धारक और कवर बार प्रिंट करें।
2. नमूना संग्रह
- संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करके यूथेनाइज़ चूहों (9-12 सप्ताह और 27 सप्ताह की आयु के पुरुष सी 57बीएल / 6 चूहों का उपयोग इस अध्ययन के लिए किया गया था)। इस प्रोटोकॉल के लिए, कार्बन डाइऑक्साइड के साथ इच्छामृत्यु करें और उसके बाद डिकैपिटेशन करें।
- ऊतक की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए माउस सिर को हटा दें और इसे तुरंत बर्फ पर रखें। ऊतक क्षति को रोकने के दौरान विच्छेदन उपकरणों का उपयोग करके ग्लोब को एन्यूक्लिएट करें।
- चिमटी का उपयोग करके ग्लोब को प्रोपटोज़ करें। ऑप्टिक तंत्रिका को विच्छेदन कैंची का उपयोग करके क्लिप करें जहां इसे चिमटी द्वारा रखा जाता है।
नोट: आगे की सावधानियों के लिए, लैमिनार प्रवाह हुड में निम्नलिखित चरणों का पालन करें। - कम प्रकाश की स्थिति वाले 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए कैल्शियम संकेतक और / या कोशिका झिल्ली दाग सहित पी 35 सेल कल्चर डिश में 2 एमएल माध्यम में ग्लोबको इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि ग्लोब समान धुंधला होने के लिए धुंधला माध्यम में डूबे हुए हैं।
- यहां किए गए प्रयोगों के लिए, कैल्शियम संकेतक, फ्लू4-एएम (1: 100)2, और सेल झिल्ली काउंटर दाग, गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली दाग (1: 10,000)2 का उपयोग करें, जिसमें 1% (v / v) DMSO और 0.1% (w / v) प्लूरोनिक एसिड की अंतिम सांद्रता के साथ केराटिनोसाइट सीरम-मुक्त माध्यम (KSFM) निम्नलिखित विकास पूरक के साथ: 25 μg / mL बोवाइन पिट्यूटरी अर्क, 0.02 एनएम एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर, 0.3 एमएम सीएसीएल2, और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (क्रमशः 100 यूनिट / एमएल और 100 μg / mL)।
नोट: कैल्शियम संकेतक, ऊतक प्रकार और नमूना मात्रा के आधार पर इनक्यूबेशन की स्थिति और समय परिवर्तनशील हैं। प्लूरोनिक एसिड का उपयोग करते समय, सावधानी बरतने की सलाह दी जाती है क्योंकि यह ऊतक को पारगम्य बनाता है। यह प्रोटोकॉल 10% प्लूरोनिक एसिड के लिए कहता है। प्लूरोनिक एसिड की कम सांद्रता को प्रयोगात्मक रूप से अप्रभावी होने के लिए निर्धारित किया गया है, और उच्च सांद्रता ऊतक को नुकसान का खतरा है।
- यहां किए गए प्रयोगों के लिए, कैल्शियम संकेतक, फ्लू4-एएम (1: 100)2, और सेल झिल्ली काउंटर दाग, गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली दाग (1: 10,000)2 का उपयोग करें, जिसमें 1% (v / v) DMSO और 0.1% (w / v) प्लूरोनिक एसिड की अंतिम सांद्रता के साथ केराटिनोसाइट सीरम-मुक्त माध्यम (KSFM) निम्नलिखित विकास पूरक के साथ: 25 μg / mL बोवाइन पिट्यूटरी अर्क, 0.02 एनएम एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर, 0.3 एमएम सीएसीएल2, और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (क्रमशः 100 यूनिट / एमएल और 100 μg / mL)।
3. नमूना धारकों की तैयारी
- धारकों को गोंद के साथ एक साफ ग्लास-बॉटम कवरस्लिप का पालन करें जिसका उपयोग पहले नहीं किया गया है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला गोंद बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए एकल-उपयोग वाले कंटेनरों से आता है और हर बार एक नया, खुला कंटेनर उपयोग किया जाता है।
- धारक को 70% इथेनॉल में धो लें। धारक पर गोंद रखें और धारक को ग्लास बॉटम कवरस्लिप से चिपकाएं। सुनिश्चित करें कि कोई गोंद धारक के आंतरिक क्षेत्र के भीतर नहीं है क्योंकि गोंद फ्लोरेस कर सकता है, इमेजिंग को जटिल बना सकता है।
- गोंद के जमने तक प्रतीक्षा करें। पुष्टि करें कि धारक कवरस्लिप के खिलाफ सुरक्षित है।
नोट: ग्लास-बॉटम कवरलिप्स के साथ पी 35 सेल प्लेटों का उपयोग इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रयोगों के लिए किया गया था। प्रयोग की आवश्यकताओं के आधार पर अन्य ग्लास-बॉटम स्लाइड और / या प्लेटों को प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
4. आंखों के ग्लोब का घाव
- बाँझ आंख ड्रॉपर्स का उपयोग करके धुंधला घोल से ग्लोब को हटा दें, रुचि के क्षेत्र में ऊतक क्षति को रोकने के लिए ध्यान रखें। अतिरिक्त दाग को हटाने के लिए बाँझ फॉस्फेट-बफर ्ड सलाइन का उपयोग करके कमरे के तापमान पर ग्लोब को 5 मिनट के लिए धोएं, और माइक्रोस्कोप में परिवहन के लिए ग्लोब को माध्यम में रखें।
- रुचि के क्षेत्र में बाँझ 25 ग्राम सुई का उपयोग करके ग्लोब को घाव दें।
- एक बाँझ आई ड्रॉपर का उपयोग करके, आंख के पीछे से ग्लोब को उठाएं और पकड़ें। यह ग्लोब को स्थिर रखेगा, इसे लुढ़कने से रोकेगा, और लगातार घाव बनाने की अनुमति देगा। इस सेटअप का उपयोग करके, ऑप्टिक तंत्रिका आंख ड्रॉपर नोजल के अंदर होगी, और कॉर्निया बाहर की ओर होगा।
- खरोंच के घाव के लिए, धीरे से उजागर कॉर्निया के पार एक बाँझ 25 ग्राम सुई ले जाएं। पंचर घाव के लिए, धीरे से सुई को सीधे केंद्रीय कॉर्निया में दबाएं। सुनिश्चित करें कि घाव कॉर्निया को पंक्चर न करे।
नोट: यदि प्रयोग के लिए घाव प्रतिक्रिया या घायल वातावरण की आवश्यकता नहीं है तो इस चरण को छोड़ दें। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इस विधि का उपयोग करके बनाए गए मुराइन कॉर्निया के खरोंच के घाव और पंचर घाव दोनों व्यास और गहराई10 में सुसंगत हैं। स्वतंत्र ग्लोब के बीच घाव आयामों की पुष्टि रुचि विश्लेषण के क्षेत्र का उपयोग करके की गई थी।
5. धारक पर नमूना प्लेसमेंट
- कॉर्निया या लिम्बल क्षेत्र को धारक के आंतरिक क्षेत्र में कवरस्लिप पर रखें और 3 डी मुद्रित कवर (चित्रा 1 सी-एच) का उपयोग करके स्थिर करें।
- पुष्टि करें कि ग्लोब सही ढंग से स्थित है और रुचि की साइट ग्लास कवरस्लिप के संपर्क में है। एक बार ग्लोब को धारक में रख दिया गया है, तो ग्लोब को हटाने की कोशिश न करें क्योंकि इससे ऊतक क्षति हो सकती है।
- स्थिरीकरण सुनिश्चित करते हुए गोंद का उपयोग करके धारक को 3 डी मुद्रित कवर का पालन करें। सुनिश्चित करें कि कवर बार धारक का पालन करता है न कि ग्लोब का।
नोट: छवि बनाए जाने वाले क्षेत्र को नीचे रखा गया है क्योंकि प्रोटोकॉल एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर उपयोग के लिए लिखा गया है। प्रोटोकॉल को छोटे आंतरिक त्रिज्या वाले धारकों का उपयोग करके सीधे माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और कवर बार को हटा दिया जा सकता है। इसके परिणामस्वरूप कम ग्लोब स्थिरीकरण होगा।
6. नमूना इमेजिंग
- माइक्रोस्कोप और पर्यावरण कक्ष चालू करें और सत्यापित करें कि कक्ष आर्द्र है। प्रयोग की अवधि के लिए पर्यावरण कक्ष को 35 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेट करें।
नोट: निर्जलीकरण को रोकने और ग्लोब को इष्टतम तापमान पर रखने के लिए इस प्रक्रिया के लिए पर्यावरणीय कक्षों के साथ माइक्रोस्कोप बेहतर हैं लेकिन आवश्यक नहीं हैं। - लाइव सेल इमेजिंगतकनीकों का उपयोग करके पर्यावरण कक्ष और छवि के भीतर माइक्रोस्कोप चरण पर कवरस्लिप, धारक और स्थिर ग्लोब रखें।
- निर्जलीकरण को रोकने और ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए कवरस्लिप पर अतिरिक्त विकास मीडिया का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि धारक में ग्लोब को कवर करने के लिए कुएं में पर्याप्त माध्यम है। इमेजिंग की अवधि के आधार पर, पूरे प्रयोग में आवश्यकता होने पर ताजा माध्यम जोड़ें।
- लाइव सेल इमेजिंग तकनीकों और प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रयोग शुरू करें। ऊतक को संरक्षित करने और लंबी अवधि के प्रयोगों में ऊतक क्षति को रोकने के लिए कम शक्ति लेजर सेटिंग्स का उपयोग करें। लंबी कार्य दूरी के लिए उपयुक्त उद्देश्यों का उपयोग करें। इस पांडुलिपि में प्रयोग 20x उद्देश्य का उपयोग करके किए गए थे।
नोट: लेजर शक्ति और लाभ, प्रयोगात्मक अवधि, स्थान और इमेजिंग के विमान प्रयोगात्मक मापदंडों के आधार पर सभी चर हैं। 1 घंटे से 4 घंटे की अवधि तक के बरकरार ग्लोब पर इमेजिंग प्रयोग पिछले प्रकाशनों में सफलतापूर्वक किए गएहैं। - डेटा को पसंदीदा फ़ाइल स्वरूप में रिकॉर्ड करें और सहेजें. माइक्रोस्कोप द्वारा उपयोग किया जाने वाला सॉफ़्टवेयर डेटा रिकॉर्डिंग के लिए .czi फ़ाइलों का उत्पादन करता है।
- प्रोटोकॉल के अंत में मानक संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार ग्लोब का निपटान करें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग लगातार प्रकाशन-गुणवत्ता डेटा और छवियों10 का उत्पादन करने के लिए किया गया है। प्राप्त चित्र पिछले दृष्टिकोणों (चित्रा 2) की तुलना में एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करते हैं। 3 डी मुद्रित धारक का उपयोग करके, कॉर्निया की परतों में छवियों को कैप्चर किया जा सकता है, और विभिन्न जेड-विमानों में कैल्शियम जुटाना देखा जा सकता है (चित्रा 3)। इस दृष्टिकोण का उपयोग युवा और पुराने चूहों में घाव पर एपिकल और बेसल सेल परतों के बीच सेल-सेल सिग्नलिंग की तुलना करनेके लिए किया गया है।
बेहतर स्थिरता ने ग्लोब की इमेजिंग के लिए पहले से संभव की तुलना में काफी लंबे समय तक अनुमति दी है। इसने घाव के बिस्तर में सेलुलर प्रवास के अध्ययन को पिछली क्षमताओं से परे कई घंटों तक विस्तारित करने की अनुमति दी है। इस विस्तारित समयरेखा के साथ, कॉर्नियल चोट10 के बाद युवा और पुराने चूहों के बीच घाव भरने की प्रतिक्रिया के दौरान सेलुलर व्यवहार में पर्याप्त अंतर देखा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, डेटा 4 घंटे के लिए हर 5 मिनट में एकत्र किया गया था। धारक का उपयोग करते समय, प्रयोग के दौरान एक्स, वाई, या जेड विमानों में कोई महत्वपूर्ण बहाव नहीं देखा गया (चित्रा 4, वीडियो 1)।
इस प्रोटोकॉल का एक लाभ यह है कि यह धारक में ग्लोब के प्लेसमेंट के आधार पर कॉर्निया के विभिन्न क्षेत्रों को चित्रित करने की अनुमति देता है। हाल ही के प्रकाशन में, इस सुविधा का लाभ केंद्रीय कॉर्निया और कॉर्नियल-लिम्बल क्षेत्र (चित्रा 5)10 दोनों में छवियों को इकट्ठा करने के लिए उठाया गया था। केंद्रीय कॉर्निया की चोट लिम्बल क्षेत्र10 में नसों से सटे कोशिकाओं में कैल्शियम सिग्नलिंग घटनाओं का उत्पादन करने के लिए पाई गई थी। धारक की बहुमुखी प्रतिभा इमेजिंग प्रयोगों के लिए ग्लोब को स्थिर करने से परे है और इसका उपयोग कई अलग-अलग अनुप्रयोगों के लिए किया गया है। होल्डर में कॉर्निया को फेस-अप रखकर, युवा औरपुराने चूहों में कॉर्नियल एपिथेलियम, बेसमेंट झिल्ली और स्ट्रोमा की कठोरता को मापने के लिए नैनोइंडेंटेशन प्रयोग किए गए थे।
चित्र 1: 3D मुद्रित धारक की योजनाबद्धता और सेटअप. (A) एनोटेटेड ऊंचाई और चौड़ाई आयामों के साथ 3D मुद्रित धारक का डिज़ाइन. (बी) 3 डी प्रिंटर सॉफ्टवेयर से प्रतिनिधि सीएडी फाइल छवि। (सी) धारक की प्रतिनिधि छवि जिसमें संलग्न कवर होता है जिसमें एक मुराइन ग्लोब होता है। (डी) बाँझ, एकल-उपयोग गोंद 3 डी मुद्रित धारक के निचले भाग पर लागू किया जाता है। (ई) 3 डी मुद्रित धारक को ग्लास-बॉटम पी 35 सेल कल्चर डिश का पालन किया जाता है। (च) बाँझ आई ड्रॉपर का उपयोग करके धारक में कॉर्निया-नीचे एक न्यूक्लियेटेड ग्लोब रखा जाता है। (छ) ग्लोब स्थिरीकरण सुनिश्चित करने के लिए कवर बार का पालन 3 डी मुद्रित धारक के शीर्ष पर किया जाता है। (H) एक पालन धारक और ग्लोब के साथ ग्लास-बॉटम प्लेट माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखी गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: ग्लोब को स्थिर करने और बहु-स्तरीय संरचनाओं के उच्च गुणवत्ता वाले इमेजिंग डेटा प्राप्त करने के लिए विशेष 3 डी मुद्रित धारकों का उपयोग करना। (ए) और (बी) क्रमशः 3 डी मुद्रित धारक के बिना और उसके साथ स्थिर एक घायल पूर्व विवो कॉर्निया के विशिष्ट लाइव इमेजिंग डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं। कैल्शियम सिग्नलिंग घटनाओं (हरे) और सेल काउंटरस्टेन (गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली दाग) को स्पष्ट रूप से (बी) में कॉर्निया के एपिकल, बेसल और स्ट्रोमल परतों में पहचाना जा सकता है, लेकिन (ए) में नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: 3 डी मुद्रित धारक में एक कॉर्निया का जेड-स्टैक स्थिर हो गया। खरोंच घाव पर कॉर्निया की परतों के माध्यम से लिए गए जेड-स्टैक की प्रतिनिधि छवियां (सफेद तारांकन के साथ चिह्नित)। नमूने को कोशिका झिल्ली की कल्पना करने के लिए गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली के दाग से दाग दिया जाता है और कैल्शियम सिग्नलिंग की कल्पना करने के लिए फ्लू4-एएम (हरा) होता है। (ए) एपिकल सेल परत, (बी) एपिकल और बेसल कोशिकाएं, (सी) बेसल सेल परत, और (डी) स्ट्रोमा घाव बिस्तर में देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: कॉर्निया का प्रतिनिधि 4 घंटे की समय श्रृंखला प्रयोग एक्स, वाई या जेड दिशाओं में ग्लोब की थोड़ी गति को प्रकट करता है। यह तस्वीर एक पूर्व विवो म्यूरिन ग्लोब के केंद्रीय कॉर्निया में खरोंच घाव की चोट (सफेद तारांकन चिह्न के साथ चिह्नित) की है। कोशिका झिल्ली की कल्पना करने के लिए ग्लोब को गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली दाग से दाग दिया जाता है और कैल्शियम सिग्नलिंग घटनाओं की कल्पना करने के लिए फ्लू4-एएम (हरा) होता है। ग्लोब को 3 डी मुद्रित धारक का उपयोग करके स्थिर किया जाता है। तस्वीरों को 1 घंटे की दूरी पर लिया गया था, चोट के 5 मिनट बाद शुरू हुआ। प्रयोग के दौरान इस इमेजिंग सेटअप का उपयोग करके एक्स, वाई, या जेड दिशाओं में थोड़ा बहाव देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: एक बरकरार ग्लोब पर इमेजिंग स्थानों का आरेख। 3 डी मुद्रित धारक विभिन्न स्थानों पर एक बरकरार पूर्व विवो ग्लोब की इमेजिंग की अनुमति देता है। होल्डर का उपयोग कॉर्निया के केंद्रीय और लिम्बल दोनों क्षेत्रों से छवियों को एकत्र करने के लिए किया गया था। कोशिका झिल्ली का पता लगाने के लिए ग्लोब को गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली के दाग से दाग दिया जाता है और कैल्शियम सिग्नलिंग का पता लगाने के लिए फ्लू4-एएम (हरा) होता है। (ए) खरोंच घाव पर केंद्रीय कॉर्निया की प्रतिनिधि छवि। (बी) केंद्रीय कॉर्निया में चोट के बाद कॉर्निया के लिम्बल क्षेत्र की प्रतिनिधि छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 1: एक ग्लोब की फिल्म 4 घंटे के लिए 3 डी मुद्रित धारक में स्थिर हो गई। एक ग्लोब को 3 डी मुद्रित धारक के साथ स्थिर किया गया था और कोशिका झिल्ली की कल्पना करने के लिए गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली दाग (लाल) और कैल्शियम सिग्नलिंग घटनाओं की कल्पना करने के लिए फ्लू4-एएम (हरा) से दाग दिया गया था। चोट लगने के 5 मिनट बाद शुरू होने वाले 4 घंटे के लिए हर 5 मिनट में एक छवि ली गई थी। प्रयोग के दौरान इस इमेजिंग सेटअप का उपयोग करके एक्स, वाई, या जेड दिशाओं में थोड़ा बहाव देखा गया था। प्लेबैक की गति 30 फ्रेम प्रति सेकंड है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल एक लाइव सेल इमेजिंग तकनीक का वर्णन करता है जो बरकरार पशु आंखों को स्थिर और स्थिर करने के लिए 3 डी मुद्रित धारक का उपयोग करता है। यह पूर्व विवो कॉर्नियल ऊतक के पिछले लाइव सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल के साथ मान्यता प्राप्त कई महत्वपूर्ण नुकसानों को दरकिनार करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह प्रोटोकॉल बरकरार ग्लोब के लाइव सेल इमेजिंग के लिए कई फायदे प्रदान करता है। यह अनावश्यक ऊतक क्षति को काफी कम कर देता है जो प्रयोगात्मक रूप से प्रेरित खरोंच घावों के लिए घाव भरने की प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप कर सकता है। इसमें विच्छेदन और यूवी प्रकाश के संपर्क में आने से नसों और उपकला को नुकसान शामिल है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल ऊतक को इस तरह से स्थिर करके ऊतक जलयोजन और व्यवहार्यता की सुविधा प्रदान करता है जो प्रयोगों के व्यवधान के बिना समय-समय पर विकास माध्यम को लागू करने की अनुमति देता है। धारक में आंख के अभिविन्यास को बदलकर, प्रोटोकॉल दुनिया पर विभिन्न क्षेत्रों की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग दुनिया के विभिन्न विमानों की इमेजिंग की अनुमति देता है, जिससे ऊतक संरचनाओं के बीच बातचीत के अवलोकन की अनुमति मिलती है। प्रोटोकॉल अत्यधिक बहुमुखी है और चूहों और अन्य प्रजातियों से विभिन्न आकारों के ग्लोब के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। धारकों और कवर को इमेजिंग कुओं से आसानी से हटाया जा सकता है, निष्फल किया जा सकता है, और पुन: उपयोग किया जा सकता है। 3 डी प्रिंटिंग प्रोटोकॉल कुशल और समय प्रभावी है, जिससे एक समय में कई धारकों के सुविधाजनक निर्माण की अनुमति मिलती है। ग्लोब धारकों के भीतर तय किए जा सकते हैं यदि नमूनों को बाद की तारीख में फिर से रखने और छवि बनाने की आवश्यकता होती है। स्थिर ऊतक निर्धारण के बाद कई हफ्तों तक गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली दाग और फ्लू4-एएम दाग को बरकरार रखता है, जिसका उपयोग एक विशिष्ट प्रोटीन (ओं) के लिए धुंधला होने पर मार्कर के रूप में किया जा सकता है।
पिछले प्रोटोकॉल ने आंख के विच्छेदन और इमेजिंग 7,8,9 के लिए कॉर्निया को गतिहीन करने के लिए यूवी-सक्रिय पीईजी जेल के बाद के उपयोग का आह्वान किया। इन तकनीकों के माध्यम से ऊतक को नुकसान प्रयोगात्मक परिणामों को भ्रमित कर सकता है। घाव भरने में शामिल सेलुलर और ऊतक प्रक्रियाओं का अध्ययन करते समय यह विचार करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि प्रयोगात्मक रूप से लागू घावों से परे यह अतिरिक्त क्षति घाव भरने की प्रतिक्रिया को बदल सकती है 4,12. संवेदी कॉर्नियल नसों का इनपुट पिछले प्रोटोकॉल से प्रभावित होगा, क्योंकि विच्छेदन प्रक्रिया ट्राइजेमिनल गैंग्लियन13 में उनके सेल शरीर से नसों को अलग करती है। इसके अलावा, कॉर्निया का विच्छेदन स्वयं एक चोट प्रतिक्रिया का कारण होगा, क्योंकि चोट से जारी घुलनशील कारक घाव भरनेकी प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार हैं। यह नई प्रक्रिया ग्लोब को बरकरार रखते हुए इमेजिंग करके इन कमजोरियों को संबोधित करती है। इस पद्धति का उपयोग करके, आंख को नुकसान न्यूक्लियेशन पर ऑप्टिक तंत्रिका को काटने तक सीमित है और विस्तारित अवधि के लिए कॉर्निया के भीतर सेल व्यवहार्यता बनाए रखता है। साथ में, ये सुधार घाव प्रतिक्रिया का बेहतर अनुकरण बनाते हैं।
जीवित ऊतक के साथ काम करते समय स्थिरीकरण एक आवश्यक लेकिन चुनौतीपूर्ण कदम है, क्योंकि यह प्रयोग के दौरान व्यवहार्य और हाइड्रेटेड रहना चाहिए। जबकि कॉर्निया और ग्लोब को यूवी-प्रेरित पीईजी जेल के साथ सुरक्षित किया जा सकता है, प्रक्रिया को धारक8 में ऊतक रखने के बाद यूवी विकिरण की आवश्यकता होती है। यह देखा गया कि पीईजी को पॉलीमराइज़ करने के लिए आवश्यक विकिरण ने सेलुलर प्रतिक्रिया को कम कर दिया। इसके अलावा, पीईजी ने छवियों के रिज़ॉल्यूशन को कम कर दिया, और सेल सिग्नलिंग का निरीक्षण करने के लिए एयरीस्कैन फ़ंक्शन की आवश्यकता थी। इस नए प्रोटोकॉल में, धारक के आयामों को ग्लोब को ठीक से फिट करने के लिए अनुकूलित किया जाता है, और कवर बार स्थिरीकरण की एक अतिरिक्त परत प्रदान करता है। धारक और कवर बार पीईजी का उपयोग करने की आवश्यकता को समाप्त करते हैं, जो घाव भरने की प्रक्रिया के वास्तविक समय के फुटेज के साथ उच्च गुणवत्ता वाली, उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन करता है। उपर्युक्त मुद्दों का एक समाधान लाइव सेल इमेजिंग को पूरी तरह से छोड़ना और चोट के बाद पूर्व निर्धारित समय पर पैराफॉर्मलडिहाइड (4%) में ग्लोब को ठीक करना होगा। हालांकि, निश्चित ऊतक के साथ, कैल्शियम सिग्नलिंग जैसी चल रही सेलुलर प्रक्रियाओं और ऊतक में शारीरिक परिवर्तनों पर इन प्रक्रियाओं के प्रभाव ों को नहीं देखा जा सकता है। कॉर्नियल एपिथेलियम में कोशिकाओं के बीच संचार घटनाओं को रिकॉर्ड करने और मात्रा निर्धारित करने में रुचि रखने वाले समूहों के लिए, ऊतक निर्धारण द्वारा लगाई गई सीमाएं इस तकनीक को ऐसे उद्देश्यों के लिए अव्यावहारिक बनाती हैं।
इस नए प्रोटोकॉल में दो प्रमुख चरण हैं: (1) इच्छामृत्यु और तत्काल ग्लोब न्यूक्लियेशन, और (2) धारक के भीतर ग्लोब की स्थिति और अभिविन्यास। ऑप्टिक तंत्रिका की कटाई और ग्लोब के न्यूक्लियेशन को आंतरिक और बाहरी संरचनाओं को संरक्षित करने के लिए ब्रेस लगाए बिना आंख को सहारा देकर सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। रुचि की साइटों की इमेजिंग के लिए स्थिति और अभिविन्यास आवश्यक हैं और यह सुनिश्चित करना कि देखने का सबसे बड़ा संभव क्षेत्र पर्याप्त विवरण के साथ ध्यान में है। धारक को कवर बार लागू करने से पहले ग्लोब का सही प्लेसमेंट आवश्यक है।
प्रोटोकॉल के कई चर प्रयोगात्मक मापदंडों की आवश्यकताओं के आधार पर समायोजित किए जा सकते हैं। विभिन्न संस्करणों के ग्लोब को समायोजित करने के लिए धारकों को विभिन्न आकारों में मुद्रित किया जा सकता है। ग्लोब के आकार के सापेक्ष धारक व्यास और ऊंचाई के बारे में पैरामीटर आकार श्रेणियों में समान रहते हैं। यदि उपयोगकर्ता जेड-प्लेन में बहाव का अनुभव करता है, तो संभावित कारण यह हो सकता है कि ऊतक स्थिर नहीं है, और धारक को फिर से निर्मित किया जाना चाहिए। बरकरार ग्लोब के धुंधलापन को प्रयोगात्मक मापदंडों, उपयोग किए गए दाग, और रुचि के ऊतक के लिए इष्टतम वातावरण और सांद्रता के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। प्रयोगात्मक अवधि को तब तक समायोजित किया जा सकता है जब तक ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखी जाती है। ऊतक की निरंतर इमेजिंग के 1 घंटे से जुड़े अल्पकालिक प्रयोग और 4 घंटे के दौरान नियमित अंतराल पर ऊतक की इमेजिंग से जुड़े दीर्घकालिक प्रयोग दोनों सफलतापूर्वक किए गए हैं। इन प्रयोगों को एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर किया गया था, और इस प्रोटोकॉल को एक समान इमेजिंग सेटअप के साथ इष्टतम उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया था। एक बार ग्लोब को स्थिर करने और धारक के भीतर तैनात करने के बाद, ग्लोब को हटाने से ऊतक क्षति हो सकती है; इस प्रकार, कवर बार संलग्न करने से पहले ग्लोब की इष्टतम स्थिति और अभिविन्यास आवश्यक है। प्रोटीन स्थानीयकरण के आगे के विश्लेषण के लिए धारकों के भीतर रहते हुए ग्लोब को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया जा सकता है। प्रारंभिक आंकड़ों से पता चला है कि गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली दाग और फ्लू4-एएम धुंधलापन दोनों को निर्धारण प्रक्रिया के माध्यम से बनाए रखा जाता है।
यद्यपि इस प्रोटोकॉल में पिछले प्रोटोकॉल पर कई फायदे हैं, लेकिन इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की कुछ सीमाएं हैं। एक नुकसान यह है कि कॉर्नियल एपिथेलियम को नुकसान पहुंचाए बिना धारक से ग्लोब को हटाना मुश्किल है। इस प्रकार, बाद की तारीख में प्रोटीन या आरएनए स्थानीयकरण विधियों का उपयोग करके पुन: इमेजिंग के लिए धारक में ग्लोब को तय किया जाना चाहिए। यह अनुवर्ती अध्ययनों को सीमित कर सकता है। लंबे समय तक इमेजिंग प्रोटोकॉल के दौरान इस प्रोटोकॉल का एक और नुकसान यह है कि हाइड्रेशन को बनाए रखा जाना चाहिए। नियमित अंतराल पर मीडिया को मैन्युअल रूप से पुन: लागू करने की आवश्यकता के लिए किसी को प्रयोग की सीमा के लिए इमेजिंग प्रक्रिया की सक्रिय रूप से निगरानी करने की आवश्यकता होती है। यह विस्तारित इमेजिंग प्रोटोकॉल के लिए तार्किक रूप से चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है।
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Disclosures
हमारे पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम निम्नलिखित अनुदान सहायता के लिए एनआईएच को स्वीकार करना चाहते हैं: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS), और 5T32GM008541-24 (KS)। हम मैसाचुसेट्स लायंस आई रिसर्च फंड और न्यू इंग्लैंड कॉर्नियल ट्रांसप्लांट फंड को भी स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
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