Настоящий протокол описывает пошаговую автофлуоресцентную визуализацию и оценку изменений фикобилипротеина у красных водорослей на основе спектрального анализа. Это безымянный и неразрушающий метод оценки клеточной адаптации к экстремальным местам обитания, когда доступен только дефицитный материал, а клетки растут медленно или вообще не растут в лабораторных условиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Автофлуоресцентная визуализация для оценки физиологии красных водорослей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Красные водоросли (Rhodophyta) содержат фикобилипротеины и колонизируют места обитания с тусклым светом, однако некоторые (например, некоторые виды Chroothece ) также могут развиваться при полном солнечном свете. Большинство родофитов красные, однако некоторые из них могут казаться голубоватыми, в зависимости от пропорции синих и красных билипротеинов (фикоцианина и фикоэритрина). Различные фикобилипротеины могут улавливать свет на разных длинах волн и передавать его хлорофиллу а, что делает возможным фотосинтез при самых разных условиях освещения. Эти пигменты реагируют на изменения среды обитания в свете, и их автофлуоресценция может помочь в изучении биологических процессов. Используя Chroothece mobilis в качестве модельного организма и режим спектрального лямбда-сканирования в конфокальном микроскопе, адаптация фотосинтетических пигментов к различным монохроматическим источникам света была изучена на клеточном уровне, чтобы угадать оптимальные условия роста вида. Результаты показали, что даже когда исследуемый штамм был изолирован из пещеры, он адаптировался как к тусклому, так и к среднему освещению. Представленный метод особенно полезен для изучения фотосинтезирующих организмов, которые не растут или растут очень медленно в лабораторных условиях, что обычно имеет место для тех, кто живет в экстремальных средах обитания.
Введение
Красные водоросли, такие как род Chroothece, могут расти в экстремальных местах обитания, где им часто приходится справляться с заметными изменениями окружающей среды1. Наводнения и засухи часты в полузасушливых регионах, где можно найти этот род, а некоторые виды были зарегистрированы в ручьях, скалах, пещерах или даже в термальных водах2. Однако в большинстве случаев биологические переменные, такие как конкуренция или выпас скота, низводят виды до неоптимальных условий для их роста. Поскольку эти организмы часто трудно культивировать и они либо не растут, либо растут очень медленно в лабораторных условиях, одн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Для настоящего исследования был использован вид водорослей Chroothece mobilis . Вид был получен из коллекции культур Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. Обзор протокола показан на рисунке 1.
Рисунок 1: Обзор исследования. Chroothece mobilis инкубируется в экстремальных условиях обитания, таких как различные монохроматические огни, в течение 2 недель. Влияние на физиологию Chroo....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Хлорофилл a обычно поглощает синие и красные длины волн видимого света, тогда как фикобилипротеины используют зеленые, желтые и оранжевые длины волн7. Автофлуоресценция этих пигментов делает возможным первый подход к изучению фикобилипротеинов и поведения хлорофилла в экспериментальных и полевых условиях.
Сравнивая полученные данные и нанося на разные графики, можно выделить значимые изменения средней интенсивности флуоресценции (MFI) (рис. 4
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Некоторые одноклеточные или колониальные красные водоросли, такие как Chroothece, медленно растут in vitro, но содержат несколько автофлуоресцентных соединений, которые могут быть проанализированы с помощью спектрального анализа под конфокальным микроскопом, где могут быть обнаружены различия в пиках излучения пигмента. Спектральная конфокальная флуоресцентная микроскопия позволила провести исследования in vivo для оценки адаптации или акклиматизации фотосинтезирующих организмов 8,10,17,18,19,2.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Благодарности
Это исследование было проведено в рамках проектов TIN2015-68454-R и 20961/PI/18, финансируемых Министерством экономики и конкурентоспособности Испании и Фондом Сенека региона Мурсия. Ирен Эрнандес Мартинес и Франсиско Хавьер Ибаньес Лопес из Секции статистической поддержки научно-исследовательской области Университета Мурсии (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (рис. 1 ) были нарисованы с использованием рисунков из Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier лицензируется лицензией Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| &микро;-Тарелка 35 мм, высокое стеклянное дно | Ibidi | 81158-24 | |
| черная пластина для лунок | Ibidi | 82406 | плоское и прозрачное дно для высокопроизводительной микроскопии |
| Инкубатор водорослей | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп | Leica Microsystems | SP8 TCS-Flask | |
| Fisher Scientific | 15380591 | Можно приобрести в местном круглосуточном магазине или интернет-магазинах. | |
| зеленый фильтр | PNTA, фильтры LEE | - | можно приобрести в местном круглосуточном магазине или интернет-магазинах. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Глицериновая иммерсивная линза |
| Программное обеспечение для получения изображений. LAS X | Leica Microsystems | SP8 | TCS-источник |
| света | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Квантовый фоторадиометр | ДельтаОм | DO 9721-R | |
| программное обеспечение | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | - T |
| красный фильтр | PNTA, фильтры LEE | - | можно приобрести в местном круглосуточном магазине или интернет-магазинах. |
| SWES medium | Университет Мурсии | - | |
| Тип G Иммерсионная жидкость | Leica Microsystems | 11513910 | глицерином |
Ссылки
- Vis, M. L., Necchi, O. Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , Springer Nature. (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
