Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), juntamente com o reconhecimento químico de multi-padrão de impressão digital, que fornece uma nova estratégia para identificar efetivamente as variedades genuínas de Clematidis Armandii Caulis e seus adulterantes.
Abstract
Um método para identificar materiais medicinais chineses e seus adulterantes relacionados foi construído tomando Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, uma medicina tradicional chinesa universalmente usada) como exemplo. Dez lotes de variedades genuínas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes relacionados foram analisados e comparados com base nas impressões digitais de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) combinadas com quimiometria, incluindo análise de cluster (CA), análise de componentes principais (PCA) e análise ortogonal parcial de discriminação de mínimos quadrados (OPLS-DA). Além disso, o teor de β-sitosterol foi determinado. A impressão digital química de controle de Chuanmutong foi estabelecida, e 12 picos comuns foram identificados. A semelhança entre a impressão digital de 10 lotes de variedades Chuanmutong genuínas e a impressão digital de controle foi de 0,910-0,989, enquanto a similaridade de cinco lotes de adulterantes foi de apenas 0,133-0,720. Com base nos picos comuns no cromatograma, 15 lotes de amostras foram classificados em três níveis de conteúdo por PCA, e foram agregados em quatro categorias por CA, alcançando uma clara distinção entre Chuanmutong autêntico e adulterantes de Chuanmutong. Além disso, sete componentes diferenciais que podem efetivamente identificar Chuanmutong autênticos e adulterantes de Chuanmutong foram encontrados através do OPLS-DA. O teor de β-sitosterol de 10 lotes de variedades genuínas de Chuanmutong foi de 97,53-161,56 μg/g, enquanto o teor de β-sitosterol dos cinco lotes de adulterantes variou muito, entre os quais o teor de β-sitosterol de Clematis peterae Hand.-Mazz. e Clematis gouriana Roxb. Fintii Rehd. et Wils. foi significativamente menor do que a das variedades autênticas de Chuanmutong. O conteúdo do componente do índice HPLC e o método de reconhecimento multipadrão de impressão digital química estabelecido neste estudo fornecem uma nova estratégia para identificar efetivamente materiais medicinais chineses autênticos e adulterantes relacionados.
Introduction
Chuanmutong, Caulis seco de Clematis armandii Franch. ou Clematis montana Buch.-Ham., é uma medicina tradicional chinesa comumente utilizada em clínicas 1,2,3. É utilizado para o tratamento de problemas urinários, edema, feridas na língua e na boca, diminuição da secreção de leite, rigidez articular e dores musculares causadas pelo calor úmido4. Chuanmutong sempre foi obtido a partir de variedades silvestres, distribuídas principalmente no sudoeste da China, especialmente em Sichuan, onde a melhor qualidade pode ser encontrada 5,6. É difícil distinguir entre variedades autênticas e seus adulterantes intimamente relacionados devido às suas características semelhantes 7,8,9,10. O padrão de qualidade de Chuanmutong na edição de 2020 da Farmacopeia Chinesa estipula apenas as propriedades, a identificação microscópica e a identificação de camada fina sem determinação de conteúdo, que não podem efetivamente identificar os adulterantes e, portanto, têm riscos potenciais. Além disso, há poucos relatos comparando e identificando Chuanmutong e plantas relacionadas. Consequentemente, um método de controle de qualidade para garantir a autenticidade de Chuanmutong é digno de um estudo mais aprofundado.
Os constituintes químicos do Chuanmutong são compostos principalmente de triterpenóides pentacíclicos do tipo oleanona e seus glicosídeos, flavonoides e ácidos orgânicos11,12,13,14. Dentre eles, o ácido oleanólico, o β-sitosterol, o estigmasterol e o ergosterol têm efeitos diuréticos de diferentes intensidades, o que pode ser potencial substância farmacodinâmica para promover a diurese e aliviar a estrangulia15,16. As impressões digitais químicas são obtidas separando e detectando muitos componentes químicos contidos em amostras por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia gasosa (GC), etc. A adoção de métodos de análise estatística adequados para analisar as características de Chuanmutong pode determinar o controle geral de qualidade e a identificação científica da medicina tradicional chinesa17,18,19.
Neste estudo, foram coletados 10 lotes de variedades autênticas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes. Sua qualidade foi comparada e analisada pelo método de impressão digital por HPLC combinado com reconhecimento de múltiplos padrões, incluindo análise de cluster (AC), análise de componentes principais (PCA), análise ortogonal parcial de discriminação de mínimos quadrados (OPLS-CA) e determinação de conteúdo do componente farmacodinâmico. Este protocolo estabelece um método para identificar variedades autênticas com alta especificidade, uma nova estratégia para a identificação científica de variedades autênticas e adulterantes de materiais medicinais chineses.
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Protocol
1. Métodos de detecção química de impressões digitais
- Condições cromatográficas
- Preparar a fase móvel acetonitrila (A)/água (B). Defina um programa de gradiente da seguinte forma no software HPLC: 0-20 min, 3%A-10%A; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.
- Manter a vazão da fase móvel em 1,0 mL/min.
- Efectuar a separação cromatográfica numa coluna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantida a 30 °C.
- Ajuste o volume de injeção para 10 μL.
- Detectar as amostras a um comprimento de onda de 205 nm.
NOTA: Para as configurações específicas das condições cromatográficas, consulte os procedimentos operacionais do software de trabalho de cromatografia líquida de alta eficiência (Tabela de Materiais).
- Preparação da solução da amostra
- Moer as matérias-primas para um tamanho de partícula uniforme, passando-as através de uma malha de nylon com um diâmetro interno de 850 μm ± 29 μm.
- Colocar 2 g da matéria-prima moída (ponderada com precisão) num balão cónico de 50 ml com uma rolha e adicionar 50 ml de metanol. Colocar a rolha no balão e o ultrassom (600 W, 40 kHz) durante 30 minutos.
- Em seguida, arrefecer o balão à temperatura ambiente (RT). Pese novamente as amostras e compense o peso inicial substituindo o extrator perdido.
- Deitar 4 ml da solução de metanol contendo os extractos medicinais num balão aferido de 10 ml. Adicione 6 mL de H2O, misture e deixe descansar por 10 min.
- Finalmente, filtre o sobrenadante através de uma membrana filtrante de 0,45 μm e coloque-o em modo de espera.
- Validação de métodos de detecção de impressões digitais
- Preparar a amostra conforme descrito acima (etapa 1.2) e submetê-la à análise por HPLC (etapa 1.1) seis vezes ao dia. Para avaliar a precisão, calcule o desvio padrão relativo (RSD) do tempo de retenção relativo e das áreas de pico relativas, conforme descrito na etapa 1.3.5.
- Avaliar a estabilidade da solução de amostra analisando a mesma solução de amostra armazenada no RT por 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 h, e calcular o RSD do tempo relativo de retenção e das áreas de pico relativas, conforme descrito na etapa 1.3.5.
- Recolher seis repetições da mesma amostra (CMT-4), preparar a solução da amostra de acordo com o procedimento acima referido (passo 1.2) e detectar a sua impressão digital em HPLC seguindo o passo 1.1. Calcule a DSR do tempo relativo de retenção e das áreas de pico relativas e avalie a sua repetibilidade conforme descrito no passo 1.3.5.
- Em seguida, use o pico número 10 na Figura 1B como o pico de referência e calcule o RSD do tempo de retenção relativo e da área de pico relativa de cada pico comum, conforme descrito na etapa 1.3.5.
- Use as fórmulas mencionadas abaixo para calcular o tempo de retenção relativo e a área de pico relativa de cada pico comum:
T re = T característica/Treferência
A re = Umacaracterística/Areferência
Onde T re = tempo de retenção relativo, T característica = tempo de retenção de pico característico, T referência = tempo de retenção de pico de referência, A re = área de pico relativa, A característica = área de pico característica e A referência = área de pico de referência.
NOTA: O estabelecimento de impressões digitais da medicina tradicional chinesa geralmente requer a seleção de um pico cromatográfico que seja fácil de obter e tenha alta resolução. Isso é usado como um pico de referência para identificar as impressões digitais e examinar sua estabilidade e reprodutibilidade.
2. Estabelecimento da impressão digital de Chuanmutong e análise de similaridade
- Use 10 lotes de amostras autênticas e cinco lotes de adulterantes, como Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. Fintii Rehd. et Wils (XS), e Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) como amostras para análise de impressões digitais.
- Preparar as soluções de exemplo conforme descrito na etapa 1.2. Efectuar a análise das impressões digitais de todas as soluções de amostras por HPLC de acordo com as condições descritas no passo 1.1.
- Importar os dados relevantes para o sistema de avaliação de similaridade de impressões digitais cromatográficas da medicina tradicional chinesa (SESCF-TCM, versão 2012). O sistema designará os picos com altura razoável e boa resolução nos cromatogramas de todas as amostras como picos comuns.
NOTA: O software SESCF-TCM pode ser descarregado após o registo no sítio Web da Comissão da Farmacopeia Chinesa (http://114.247.108.158:8888/login).- No software, clique no botão Definir espectro de referência no menu.
- Em seguida, na janela Configurações de parâmetro, defina a largura da janela de tempo como 0,5 e selecione Método de geração de espectro de controle como o método mediano.
- Clique em Calibração Multiponto no menu principal e selecione Correspondência de Pico como Correspondência de Pico de Espectro Completo.
- Finalmente, clique em Gerar Controle para gerar a impressão digital cromatográfica de referência da autêntica espécie de Chuanmutong.
- Importe o tempo de retenção e a área de pico de 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes para o SESCF-TCM para análise. As operações específicas são as seguintes:
- No software, clique no botão Definir espectro de referência no menu principal.
- Na janela Configurações de parâmetros , defina a impressão digital cromatográfica de referência da espécie autêntica de Chuanmutong como referência, selecione o Método de Geração de Espectro de Controle como o Método Mediano e defina a Largura da Janela de Tempo como 0,5.
- Clique em Calibração Multiponto no menu principal e selecione Correspondência de Pico como Correspondência de Pico de Espectro Completo.
- Finalmente, clique em Calcular Similaridade para calcular a semelhança com base nas impressões digitais de cromatograma de referência de Chuanmutong. Finalmente, calcule a semelhança das impressões digitais usando o Sistema de Avaliação Cromatográfica de Impressões Digitais da Medicina Chinesa (versão 2012).
NOTA: Para as operações específicas, consulte as especificações operacionais para o Sistema de Avaliação de Impressões Digitais Cromatográficas de Medicina Chinesa (versão 2012).
3. Análise de reconhecimento de múltiplos padrões da impressão digital de Chuanmutong
- Análise de cluster (AC)
- Use as áreas de pico de 12 picos comuns nas impressões digitais de 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong e seus cinco lotes de adulterantes como variáveis e insira-as em um software de análise estatística para análise sistemática de cluster (CA).
- Escolha o método Between-Groups e use o coeficiente de correlação de Pearson como base de classificação para desenhar um diagrama de análise de cluster de Chuanmutong e seus adulterantes. As operações específicas são as seguintes:
- No software de análise estatística, clique em Arquivo para importar dados.
- Clique em Análise no menu e, em seguida, clique em Clustering do Sistema em Classificação.
- Selecione a área de pico comum como uma variável e defina o número de clusters como quatro.
- Clique em Método, selecione o método de agrupamento como Conexão entre Grupos, selecione o intervalo de medição como Correlação de Pearson e clique em OK para desenhar o mapa da AC.
- Análise de componentes principais (ACP)
- Importe a área de pico comum relativa das variedades autênticas e seus adulterantes para o software de análise para análise de PCA e use o mapa de pontuação de PCA para avaliar o mapa de matriz de pontuação das diferenças amostrais. As operações específicas são as seguintes:
- Abra o software de análise de dados, clique em Arquivo no menu e crie um novo projeto regular. Importe a área de pico de 12 picos comuns em uma planilha (por exemplo, formato Excel) do sistema HPLC. Em seguida, clique em Concluir para concluir a importação de dados.
- Clique em Novo para criar um novo modelo para definir o tipo de modelo com PCA. Clique em Autofit e Add para ajustar os dados e, em seguida, clique em Scores para obter o mapa de pontuação PCA.
- Importe a área de pico comum relativa das variedades autênticas e seus adulterantes para o software de análise para análise de PCA e use o mapa de pontuação de PCA para avaliar o mapa de matriz de pontuação das diferenças amostrais. As operações específicas são as seguintes:
- Análise ortogonal parcial de discriminação de mínimos quadrados (OPLS-DA)
- Use o método de análise de discriminação de mínimos quadrados parciais ortogonais com modo de supervisão para analisar melhor os picos relativos da área de pico comum das variedades e adulterantes Chuanmutong autênticos e desenhar um mapa de pontuação de classificação OPLS-DA de todas as amostras. As operações específicas são as seguintes:
- No software de análise de dados, clique em Arquivo no menu para importar um arquivo e criar um novo projeto regular. Importe a área de pico de 12 picos comuns em uma planilha do sistema HPLC e clique em Concluir para concluir a importação de dados.
- Clique em Novo para criar um novo modelo para definir o tipo de modelo com PCA. Clique em Autofit e Add para ajustar os dados. Em seguida, clique em Pontuações para obter o mapa de pontuação PCA.
- Clique em Novo e escolha Novo como Modelo Um para definir o tipo de modelo com OPLS-DA.
- Clique em Dimensionar e defina o tipo com Par para Todos. Clique em Autofit primeiro e, em seguida, clique em Scores para obter o mapa de pontuação OPLS-DA.
- A fim de determinar a influência de cada pico comum em Chuanmutong em seus resultados de classificação e a diferença entre materiais autênticos de Chuanmutong e adulterantes relacionados, use a variável importância na projeção (VIP) para análise.
- Desenhe o mapa VIP dos diferentes componentes de Chuanmutong. Use o mapa VIP resultante para avaliar o impacto de cada variável na classificação e para filtrar os componentes que contribuem significativamente para as diferenças entre os grupos. As operações específicas são as seguintes:
- No software de análise de dados, clique em Analisar no menu e clique em Permutações, defina o número de permutações para 200 e obtenha o R 2 e o Q2 do mapa de pontuação OPLS-DA.
- Clique em VIP e escolha VIP Predictive para obter o mapa VIP.
- Use o método de análise de discriminação de mínimos quadrados parciais ortogonais com modo de supervisão para analisar melhor os picos relativos da área de pico comum das variedades e adulterantes Chuanmutong autênticos e desenhar um mapa de pontuação de classificação OPLS-DA de todas as amostras. As operações específicas são as seguintes:
4. Determinação do β-sitosterol em Chuanmutong por HPLC
- Condições cromatográficas (ver etapa 1.1)
- Prepare a fase móvel: metanol-água (97:3).
- Defina a taxa de fluxo da fase móvel para 1,0 mL/min.
- Efectuar a separação cromatográfica numa coluna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantida a 30 °C.
- Ajuste o volume de injeção para 10 μL.
- Detecte o componente em um comprimento de onda de 204 nm.
- Preparação da solução da amostra
- Preparar a solução-mãe padrão de β-sitosterol (0,1 mg/ml) dissolvendo uma quantidade ponderada com precisão do padrão de referência correspondente em metanol.
- Moer a amostra de análise da matéria-prima até uma granulometria uniforme, passando a amostra através da malha de nylon com um diâmetro interior de 180 μm ± 7,6 μm.
- Colocar 2 g da matéria-prima moída (pesada com precisão) num balão de fundo redondo e adicionar 50 ml de clorofórmio à mesma.
- Ligue o balão a um condensador de refluxo e aqueça-o em banho-maria fervente (ebulição moderada) durante 60 minutos. Filtrar a solução de extracção com um papel de filtro de 15-20 μm.
- Evaporar o filtrado até perto da secura em banho-maria fervente (ebulição moderada) por cerca de 10 min.
- Dissolva o resíduo e compense o volume para 5 mL usando metanol. Finalmente, passe o sobrenadante através de uma membrana filtrante de 0,45 μm e coloque-o em modo de espera.
- Validação do método
- Tomar a solução-mãe de β-sitosterol preparada na subetapa 4.2.1, diluí-la com metanol a 100% e preparar soluções com concentrações de 100 μg/mL, 80 μg/mL, 60 μg/mL, 50 μg/mL, 40 μg/mL, 30 μg/mL e 20 μg/mL.
- Injetar as amostras sob as condições cromatográficas descritas na etapa 4.1 para determinar a área de pico, realizar análise de regressão com a área de pico para o volume de injeção e obter a equação de regressão e o coeficiente de correlação para avaliar sua linearidade.
- Preparar as amostras conforme descrito acima (etapa 4.2) e submetê-las à análise por HPLC (etapa 4.1) seis vezes no mesmo dia. Em seguida, calcule o RSD das áreas de pico para avaliar a precisão.
- Avaliar a estabilidade da solução da amostra analisando as mesmas soluções de amostra armazenadas no RT por 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 h, conforme descrito na etapa 4.1. Em seguida, calcule a DSR das zonas de pico, tal como descrito no passo 1.3.5.
- Examinar a repetibilidade dissolvendo a mesma amostra (CMT-4) em sextuplicado, preparada conforme descrito no passo 4.2, e sujeitando-a à análise por HPLC, conforme descrito no passo 4.1. Em seguida, calcule o RSD do teor de β-sitosterol em seis amostras.
- Avalie a precisão do método empregando o método de adição padrão. Para isso, adicionar soluções de referência de β-sitosterol às amostras a 80%, 100% e 120% do teor de β-sitosterol e repetir cada condição três vezes, conforme descrito na etapa 4.1. Avalie a precisão do método calculando a recuperação média e o RSD.
Observação : A fórmula de cálculo da taxa de recuperação (RR) é a seguinte:
RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
Onde M t = a qualidade do β-sitosterol após a adição do padrão, M 0 = a qualidade da solução da amostra e Ms = a qualidade do β-sitosterol adicionado.
- Determinação do teor de β-sitosterol das amostras
- Tomar 10 lotes de materiais medicinais chineses autênticos e cinco lotes de adulterantes relacionados para preparar soluções de amostra de acordo com a etapa 4.2.
- Em seguida, injectar cada solução de amostra e solução de referência de β-sitosterol para determinar a área de pico nas condições descritas no passo 4.1 e calcular o teor de β-sitosterol de cada amostra utilizando o método de um ponto padrão externo.
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Representative Results
Impressão digital cromatográfica de Chuanmutong e análise de similaridade (SA)
Os valores de RSD do tempo relativo de retenção de precisão, repetibilidade e estabilidade foram inferiores a 0,46%, 1,65% e 0,53%, respectivamente; os valores de DSR da área de pico relativa foram inferiores a 4,23%, 3,56% e 3,96%, respectivamente. Como mostrado nas Figuras 1A,B, havia 12 picos comuns distintos (do pico 1 ao pico 12) nas impressões digitais de HPLC nas 10 amostras autênticas de Chuanmutong. Como a área de pico do número 10 era relativamente grande, a resolução era boa; por ser um componente presente em cada amostra, foi utilizado como pico de referência para investigar a estabilidade e reprodutibilidade da impressão digital. Em seguida, o pico nº 10 foi tomado como pico de referência (S), e o tempo relativo de retenção dos 11 picos restantes foi calculado.
Na análise de similaridade, quanto mais próximo o coeficiente de correlação for de 1, maior a similaridade entre as amostras. Conforme mostrado na Tabela 1, os graus de similaridade de 10 lotes de Chuanmutong foram de 0,910-0,989. Estes resultados mostraram que os 10 lotes de Chuanmutong apresentaram alta similaridade e boa consistência, o que pode ser usado para avaliar a qualidade geral de Chuanmutong. Como mostra a Figura 1C, foram obtidas as impressões digitais de cinco lotes de seus adulterantes. A semelhança entre as impressões digitais de cinco lotes de adulterantes e as impressões digitais de controle de Chuanmutong foi de apenas 0,133-0,720 (Tabela 1), indicando que existem diferenças óbvias entre as amostras autênticas e os adulterantes relacionados. As diferenças concentraram-se principalmente nos números de pico cromatográficos no cromatograma em 28-55 min. Assim, as impressões digitais de controle de Chuanmutong podem efetivamente distinguir as amostras autênticas dos adulterantes relacionados.
O software estatístico SPSS 26 foi utilizado para a análise de AC neste experimento (Figura 2A); 15 lotes de amostras foram divididos em duas categorias quando a distância de classificação foi de 20. A primeira categoria foi de 10 lotes de Chuanmutong e seus adulterantes habituais (CC). A segunda categoria foram os adulterantes de Chuanmutong, incluindo DC, DE, XS e SMT. Quando a distância de classificação foi de quatro, todas as amostras foram divididas em quatro categorias. A primeira categoria foi de 10 lotes de Chuanmutong, a segunda categoria foi CC, a terceira categoria foi SMT e XS, e a quarta categoria foi DC e DE. Os resultados da classificação mostraram que a qualidade das variedades autênticas de Chuanmutong era basicamente a mesma, e havia diferenças óbvias com todos os adulterantes. Ao mesmo tempo, em comparação com outros adulterantes, o CC estava mais próximo da autêntica variedade de Chuanmutong, mas ainda pode ser distinguido quando a distância de classificação é estreitada.
As áreas de pico comuns dos 15 lotes de amostras foram importadas para um software de análise de dados para análise de PCA, e a matriz de pontuação (R 2 x = 0,994, Q2 = 0,961) (Figura 2B) mostrou que o efeito de agrupamento dos 15 lotes de amostras foi pronunciado. No lado direito do eixo Y havia 10 lotes de Chuanmutong e CC. Entre eles, o CC estava localizado no primeiro quadrante, que é diferente das variedades autênticas de Chuanmutong. O lado esquerdo do eixo Y eram os adulterantes, incluindo SMT, XS, DE e DC. Dentre eles, SMT e XS estavam localizados no segundo quadrante, e DE e DC estavam localizados no terceiro quadrante. Ao comparar as variedades autênticas de Chuanmutong e os adulterantes convencionais, a diferença entre as variedades CC e autênticas é relativamente pequena, enquanto a diferença entre os autênticos e outros adulterantes é óbvia.
A área de pico comum de Chuanmutong e seus adulterantes foi utilizada como variável, importada para o software de análise de dados para OPLS-DA, e então a matriz de pontuação foi desenhada (Figura 3A). O R 2 x [1] do modelo OPLS-DA foi de 0,695, e o R 2 x [2] foi de 0,605, ambos maiores que 0,5, indicando que o modelo é estável e confiável e pode ser usado para distinguir amostras autênticas de adulterantes.
Pode-se observar na Figura 3A que os pontos amostrais dos autênticos e outros adulterantes estavam completamente separados, e não houve interseção entre os pontos amostrais. Todas as amostras foram divididas em três partes. As variedades autênticas de Chuanmutong e CC eram semelhantes. As amostras de XS, DC e DE foram agrupadas em uma classe, e a amostra de SMT foi a última classe. Além disso, o método de julgamento da variável importância na projeção (VIP) (Figura 3B) foi utilizado para rastrear os picos de diferentes componentes na impressão digital de cada amostra. O > VIP 1.0 foi tomado como padrão para triagem das variáveis seveb que contribuíram sobremaneira para a classificação entre os grupos amostrais. De acordo com os resultados da triagem, os principais componentes marcadores que causaram a diferença na composição entre amostras autênticas e os adulterantes foram os picos nº 9, nº 5, nº 7, nº 6, nº 10, nº 3 e nº 2. O valor VIP dos demais picos foi inferior a 1, o que teve pouco efeito sobre a discriminação das amostras.
A relação linear entre a área de pico β-sitosterol e sua concentração de solução foi encontrada por meio da análise de regressão. Essa dependência obedeceu a uma equação Y = 5,4918 X-4,5563, onde Y é a área de pico de β-sitosterol e X é o conteúdo de β-sitosterol em μg/mL. Simultaneamente, o coeficiente de correlação r = 0,9995, que atende aos requisitos. A DSR do teste de precisão, o teste de estabilidade e o teste de repetibilidade foram de 1,76%, 4,22% e 3,85%, respectivamente. Os resultados mostram que o método de determinação do teor de β-sitosterol apresentou boa linearidade, precisão e repetibilidade, e a solução da amostra mostrou-se estável em 24 h. O percentual médio de recuperação em três níveis foi de 101,50%, 101,90% e 100,72%; a DSR correspondente foi de 2,56%, 1,56% e 1,68%, respectivamente. Boas concordâncias entre os valores teóricos e reais determinados confirmaram a acurácia e aplicabilidade do método de análise. O cromatograma líquido de β-sitosterol é mostrado na Figura 4, e o teor de β-sitosterol em 15 lotes de amostras foi determinado (Tabela 2). Os resultados mostraram que a concentração de β-sitosterol em 10 lotes de amostras autênticas estava na faixa de 97,53-161,56 μg/g (relativamente estável). Este componente foi detectado em todos os cinco lotes de adulterantes, mas o conteúdo variou muito.
Figura 1: Impressões digitais de Chuanmutong e seus adulterantes. (A) Impressões digitais de 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). B) As impressões digitais de cromatograma de referência de amostras autênticas de Chuanmutong; os tempos relativos de retenção foram de 0,18 (Pico nº 1), 0,22 (Pico nº 2), 0,29 (Pico nº 3), 0,72 (Pico nº 4), 0,75 (Pico nº 5), 0,82 (Pico nº 6), 0,86 (Pico nº 7), 0,92 (Pico nº 8), 0,96 (Pico nº 9), 1,00 (Pico nº 10), 1,02 (Pico nº 11), 1,37 (Pico nº 12). (C) Impressões digitais de cinco lotes de adulterantes Chuanmutong (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). (D) Comparação entre as impressões digitais de cromatograma de referência de amostras autênticas de Chuanmutong e os cinco lotes dos seus adulterantes (S1: impressões digitais de cromatograma de referência, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise de CA e PCA de 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes. (A) Análise de CA. (B) Análise da ACP. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Mapa de pontuação OPLS-DA e mapa de pontuação VIP de 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes. (A) Mapa de pontuação OPLS-DA. (B) Mapa de pontuação VIP. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Cromatograma líquido de β-sitosterol. S1: β-sitosterol, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amostras | Nome | Similaridade |
| as variedades genuínas de Chuanmutong | CMT-1 | 0.947 |
| CMT-2 | 0.910 | |
| CMT-3 | 0.989 | |
| CMT-4 | 0.937 | |
| CMT-5 | 0.989 | |
| CMT-6 | 0.988 | |
| CMT-7 | 0.956 | |
| CMT-8 | 0.959 | |
| CMT-9 | 0.939 | |
| CMT-10 | 0.966 | |
| Adulterants | CC | 0.599 |
| DC | 0.720 | |
| DE | 0.133 | |
| XS | 0.694 | |
| SMT | 0.180 |
Tabela 1: Resultados da similaridade de 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong e seus adulterantes. Ao importar os dados relevantes para o Sistema de Avaliação de Impressões Digitais Cromatográficas da Medicina Chinesa, calculou-se a semelhança de 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes.
| Amostras | Nome | Conteúdo (μg/g) |
| as variedades genuínas de Chuanmutong | CMT-1 | 103.5 |
| CMT-2 | 124.6 | |
| CMT-3 | 131 | |
| CMT-4 | 121.1 | |
| CMT-5 | 97.5 | |
| CMT-6 | 113.8 | |
| CMT-7 | 105.6 | |
| CMT-8 | 161.6 | |
| CMT-9 | 118 | |
| CMT-10 | 123.5 | |
| Adulterants | CC | 157.4 |
| DC | 165.6 | |
| DE | 32.9 | |
| XS | 69.7 | |
| SMT | 192.2 |
Quadro 2: Resultados da determinação do teor de β-sitosterol nas amostras autênticas de Chuanmutong e seus adulterantes.
Figura 1 suplementar: Cromatografia líquida em diferentes condições de preparação de amostras e diferentes condições cromatográficas. (A) Os sistemas de fase móvel (S1: solução de acetonitrila-ácido fórmico a 0,1%, S2: solução de acetonitrila-ácido acético a 0,5%, S3: acetonitrila-água pura, S4: acetonitrila-solução de ácido fosfórico a 0,05%, S5: água pura de metanol). (B) Os comprimentos de onda de detecção (S1: 205 nm, S2: 230 nm, S3: 250 nm, S4: 300 nm). (C) As temperaturas da coluna (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). (D) Os caudais (S1: 0,8 mL/min, S2: 0,9 mL/min, S3: 1,0 mL/min). (E) Os métodos de extração (S1: extração ultra-sônica, S2: extração de refluxo). (F) Os solventes de extracção (S1: acetato de etilo, S2: etanol, S3: clorofórmio, S4: n-butanol, S5: metanol). (G) O tempo de extração (S1: 15 min, S2: 30 min, S3: 60 min). Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 Suplementar: O cromatograma líquido de ergosterol, estigmasterol e Chuanmutong autêntico. S1: estigmasterol, S2: ergosterol, S3: CMT-4. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A coleta de amostras para pesquisa é o primeiro passo fundamental para a construção do reconhecimento de vários padrões na identificação da autenticidade dos materiais medicinais chineses. Através de pesquisas de mercado, descobrimos que Sichuan Ya'an, Liangshan e Leshan são as principais áreas de produção de recursos selvagens de Chuanmutong. As variedades relacionadas do mesmo gênero também têm a mesma distribuição geográfica 6,20; CC, DC, DE, XS e SMT são frequentemente utilizados indevidamente como Chuangmutong16,21; portanto, neste estudo, 10 lotes de Chuanmutong autêntico e cinco lotes de amostras mistas foram coletados nos locais de origem acima mencionados, e a precisão das variedades foi confirmada.
O segundo passo fundamental é rastrear as condições de detecção da impressão digital HPLC, que pode exibir o máximo de informações possível sobre os componentes químicos. Neste estudo, como mostrado na Figura 1 Suplementar, o número e a área de picos cromatográficos foram obtidos sob diferentes condições de preparo, incluindo os métodos de extração, solventes de extração e tempo de extração. O método ótimo de preparação da solução de amostra de Chuanmutong foi determinado. Por outro lado, o número e a resolução dos picos cromatográficos das amostras sob diferentes condições cromatográficas foram comparados. Os sistemas de fase móvel, como acetonitrila-solução de ácido fórmico a 0,1%, acetonitrila-solução de ácido acético a 0,5%, acetonitrila-água pura, acetonitrila-0,05% de solução de ácido fosfórico e metanol-água pura, os comprimentos de onda de detecção, como 205 nm, 230 nm, 250 nm e 300 nm, as temperaturas da coluna, como 20 °C, 30 °C e 40 °C, e as taxas de fluxo, como 0,8-1,0 mL/min, foram investigados. As condições cromatográficas ideais para a análise das amostras de Chuanmutong foram determinadas. Além disso, sua viabilidade foi confirmada por validação metodológica, e o método de detecção da impressão digital por HPLC de Chuanmutong foi construído com sucesso.
O terceiro passo fundamental é analisar e encontrar as informações diferentes nas impressões digitais da autêntica medicina chinesa e seus adulterantes. Neste estudo, primeiramente, a similaridade das impressões digitais foi analisada por meio do SESCF-TCM (versão 2012). Verificou-se que a semelhança entre as impressões digitais de 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong e a impressão digital característica de controle era muito alta. Em comparação, a semelhança entre as impressões digitais de cinco lotes de adulterantes e a impressão digital característica de controle foi significativamente menor do que a de amostras autênticas. CA, PCA e OPLS-DA foram então introduzidos para analisar as informações de pico comuns das impressões digitais químicas. Ambos os resultados de AC e PCA mostram que o CC adulterante comumente usado entre diferentes adulterantes é relativamente mais próximo do autêntico, o que é difícil de distinguir. No entanto, quando a distância de classificação da AC é modificada para quatro, a identificação efetiva entre o autêntico e o adulterante pode ser alcançada. Com base nos 12 picos comuns de materiais autênticos, os valores de contribuição dos picos diferenciais de adulterantes foram avaliados quantitativamente pelo OPLS-DA, e obtidos sete picos cromatográficos diferenciais, a saber, pico nº 9, pico nº 5, pico nº 7, pico nº 6, pico nº 10, pico nº 3 e pico nº 2. Estes podem ser usados para identificar eficazmente os materiais autênticos e falsos de Chuanmutong, que são os principais componentes marcados da diferença entre o autêntico e o adulterante.
A última edição da Farmacopeia Chinesa ainda não incluiu a determinação do conteúdo dos componentes efetivos do Chuanmutong. Com o objetivo de melhorar seu controle de qualidade, este estudo investigou métodos de determinação de conteúdo de componentes ativos como β-sitosterol, ergosterol, sitosterol e ácido oleanólico relacionados à ação diurética em relatos anteriores 22,23,24,25,26. Como mostrado na Figura 2 Suplementar, o ergosterol não foi detectado no Chuanmutong autêntico, e o estigmasterol foi difícil de ser separado no cromatograma e não pôde ser quantificado com precisão. Finalmente, foi estabelecido o método de determinação do teor de β-sitosterol; os resultados da detecção mostraram que β-sitosterol foi encontrado em 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes. Portanto, β-sitosterol não era exclusivo de materiais medicinais genuínos. Embora algumas informações sobre a qualidade do Chuanmutong possam ser fornecidas, ainda é necessário analisar melhor os picos cromatográficos diferenciais nas impressões digitais no futuro para ver se os componentes específicos relacionados à eficácia do Chuanmutong podem ser encontrados.
Atualmente, os medicamentos tradicionais chineses são frequentemente identificados pela semelhança do espectro químico da impressão digital. No entanto, este indicador é um parâmetro baseado na informação global dos picos cromatográficos da amostra, que não pode fornecer mais informações sobre a identificação e as principais diferenças das diferentes amostras. Portanto, este estudo usou ainda CA, PCA e OPLS-DA para identificar as informações de pico comuns de impressões digitais químicas, encontrou os principais picos cromatográficos diferenciais entre amostras autênticas e adulteradas de Chuanmutong e os identificou com sucesso. Finalmente, a impressão digital química acoplada à HPLC para reconhecimento de vários padrões foi construída.
Como não é incomum misturar materiais medicinais chineses autênticos e seus adulterantes, como Fritillaria thunbergii, Herba Asari e Lonicera japonica, este método fornecerá uma nova estratégia para a identificação clara e científica de materiais medicinais chineses autênticos e seus adulterantes. Esta estratégia será de grande importância para garantir a qualidade dos materiais medicinais chineses na aplicação clínica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Administração de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan (n.º 2020JC0088, n.º 2021MS203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | - | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | - | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | - | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | - | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | - | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
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