يوفر هذا البروتوكول استراتيجية الجمع بين اثنين من الأعشاب لعلاج خلايا PC12 المصابة. يوفر البروتوكول مرجعا لتحسين أفضل طريقة تطبيق للطب الصيني التقليدي (TCM).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استكشاف استراتيجية الجمع بين الأعشاب لعلاج خلايا PC12 المصابة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في ضوء مزايا الجمع بين الطب الصيني التقليدي (TCM) في علاج نقص التروية الدماغية ، درسنا الاختلافات في الفعالية والآلية بين تركيبة التحضير ومجموعة المكونات من أجل استكشاف استراتيجية الجمع بين الأعشاب لعلاج خلايا PC12 المصابة. تم استخدام كلوريد الكوبالت (CoCl2) جنبا إلى جنب مع وسط خال من الجلوكوز للحث على الضرر التأكسدي لخلايا PC12. بعد ذلك ، تم اختيار المزيج الأمثل من حقن Astragalus mongholicus (Ast) وحقن Erigeron breviscapus (Eri) ودمجهما باتباع طرق تصميم موحدة بعد فحص تركيزهما الآمن والفعال على خلايا PC12. علاوة على ذلك ، تتكون تركيبة المكونات التي تم فحصها من 10 ميكرومتر أستراغالوسيد A ، و 40 ميكرومتر سكوتيلارين ، و 75 ميكرومتر حمض الكلوروجينيك في عشبين. بعد ذلك ، تم استخدام MTT و Annexin V-FITC / PI والتألق المناعي وتحليل اللطخة الغربية لتقييم فعالية وآلية تركيبة التحضير ومجموعة المكونات على خلايا PC12 المصابة. أظهرت النتائج أن تركيبة التحضير المثلى لبقاء الخلية كانت حقن Ast وكبسولة Eri بتركيز 6: 1.8 (ميكرومتر). كانت تركيبة المكونات (10 ميكرومتر أستراغالوسيد A ، 40 ميكرومتر سكوتيلارين ، و 75 ميكرومتر حمض الكلوروجينيك) أكثر فعالية من تركيبة التحضير. كلا المجموعتين خفضت بشكل ملحوظ معدل موت الخلايا المبرمج ، وكثافة مضان caspase-3 ، ومستوى أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS). وفي الوقت نفسه ، قاموا بتنظيم مستويات التعبير من p-Akt / Akt و Bcl-2 / Bax و Nrf2. كانت هذه التأثيرات أكثر وضوحا في تركيبة المكونات. في الختام ، يمكن لكلا المجموعتين أن تمنع الإصابة التي يسببها CoCl2 جنبا إلى جنب مع وسيط خال من الجلوكوز على خلايا PC12 ، وبالتالي تعزيز بقاء الخلية. ومع ذلك ، قد تكون كفاءة تركيبة المكونات على تركيبة التحضير بسبب تنظيمها الأقوى لمسار إشارات PI3K / Akt / Nrf2 المتعلق بالإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج.
المقدمة
نقص التروية الدماغية المزمن ، الناجم عن نقص التروية الدماغية ، هو مرض شائع في منتصف العمر وكبار السن1. كمرض إقفاري خفي طويل الأمد ، يمكن أن يؤدي إلى خلل وظيفي عصبي تدريجي أو مستمر. وتشمل الآليات المرضية الرئيسية موت الخلايا المبرمج والضرر التأكسدي ، مما يؤدي إلى خلل وظيفي عصبي تدريجي أو مستمر. هذا هو الأساس المرضي لمرض الزهايمر ، والخرف الوعائي ، وأمراض أخرى ، ويؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المرضى. ومع ذلك ، لا يزال هناك نقص في الأدوية المثالية في الطب الحديث لعلاج نقص التروية الدماغية المزمن2. في الوقت نفسه ، تم استخدام مزيج من Astragalus mongholicus (Ast) و Erigeron breviscapus (Eri) على نطاق واسع في ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الكاشف
- تحضير الوسط الكامل بإضافة 90 مل من وسط السكر العالي DMEM ، و 10 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 1 مل من محلول البنسلين والستربتومايسين في دورق مزرعة معقم سعة 125 مل. تخلط الوسط بالكامل وتخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية في ظروف مغلقة.
- قم بإعداد محلول CoCl 2 بإضافة 0.02 جم من مسحوق CoCl2 (وزنه بدقة) في 10 مل من وسط DMEM الخالي من السكر (مذاب تماما) للحصول على محلول مخزون 8.4 مليمتر. قم بتصفية المحلول بفلتر بكتيري 0.22 ميكرومتر ، وأغلقه ، وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.
ملاحظة: CoCl2 غير مستقر ويجب تخزينه في حاوية محكمة الإغلاق ، محمية من الضوء ؛ فترة صلاحية محلول C....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 1 فحص المزيج الأمثل من حقن Ast وكبسولة Eri. يوضح الشكل 1 أ معدل بقاء الخلية لحقن Ast وكبسولة Eri على خلايا PC12 العادية. كانت صلاحية الخلية أقل من 95٪ مع حقن Ast بتركيزات أكبر من 12 ميكرومتر (الشكل 1 أ) وكبسولة إيري بتركيزات أكبر من 5 ميكرومتر (الشكل 1 أ) ، مما يشير إلى أن الحد الأقصى للتركيز غير السام كان 12 ميكرومتر و 5 ميكرومتر على التوالي. كانت سميتهم الخلوية أكبر من سمية أستراتاغالوسيد أ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لا يزال هناك نقص في الأدوية المثالية لعلاج نقص التروية الدماغية في الممارسة السريرية الحديثة2. بتوجيه من تكملة qi وتفعيل طريقة الدورة الدموية ، تم استخدام Ast و Eri والمستحضرات الأخرى معا في الممارسة السريرية للطب الصيني التقليدي وحققت مزايا شاملة جيدة13،14،15. أظهر عدد كبير من الدراسات أن Ast يمكن أن يحسن نفاذية الحاجز الدموي الدماغي ، ويزيد من تدفق الدم الدماغي ، ويحسن قدرة الخلايا العصبية على تحمل نقص .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا البحث من خلال مشاريع البحث والتطوير الرئيسية التابعة لإدارة العلوم والتكنولوجيا بمقاطعة سيتشوان (2020YFS0325).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1300 سلسلة من الفئة الثانية خزانة السلامة الحيوية | شركة Thermo Fisher Scientific Instruments | Company 1374 | |
| 3- (4،5-Dimethylthiazol-2-yl) -2،5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress ؛ 1.4.0 | ACEA Biosciences، | Inc-Akt | |
| Wuhan Three Eagles Proteintech Group، Inc | 10176-2-AP | ||
| قياس التدفق الخلوي التحليلي | شركة Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC طقم الكشف عن موت الخلايا المبرمج | Beyotime Biotechnology | Company C1062L | |
| حقن Astragalus | Heilongjiang Zhenbao شركة الجزيرة للأدوية | A03190612144 | حقن |
| Ast Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group، Inc | 60267-1-Ig | |
| البروتين BCA | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group، Inc | 26593-1-AP | |
| حاضنات ثاني أكسيد الكربون | شركة Thermo Fisher Scientific Instruments | Company 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group، Inc | 19677-1-AP | |
| حمض الكلوروجينيك | تشونغتشينغ جاو رين شركة التكنولوجيا الحيوية | 327-97-9 | |
| سداسي هيدرات كلوريد | الكوبالت Merck Biotechnology، Inc. | 7791-13-1 | CoCl2< / sub> |
| ميثيل سلفوكسيد | قوانغتشو saiguo شركة التكنولوجيا الحيوية | 2020112701 | DMSO |
| الصوديوم فوسفات الهيدروجين dodecahydrate | شركة تشنغدو كولون للكيماويات | 2020090101 | |
| DMEM متوسط ارتفاع السكر | Hyclone | 2110050 | |
| DMEM شركة بكين Solarbio | لعلوم الحياة | 2029548 | |
| ECL السائل المضيء | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| التوازن الإلكتروني | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصين | FA1204 | |
| أداة الرحلان الكهربائي | Bio-Rad Laboratories (شنغهاي) المحدودة | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus كبسولة | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | كبسولة |
| مصل الأبقار الجنيني | معهد فور سيزونز للهندسة البيولوجية | 20210402 | FBS |
| مجهر فلوري | شركة أولمبس | IX71-F32PH | |
| جل تصوير | مختبرات بيو راد (شنغهاي) المحدودة | 1708265 | |
| الماعز الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر | ووهان ثلاثة النسور Proteintech Group، Inc | SA00001-1 | |
| الماعز المضاد للأجسام المضادة الثانوية | ووهان Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics الإصدار 26.0 | International Business Machines Corporation ، USA-ImageJ | ||
| 1.8.0 | المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة | الأمريكية - | برنامج التصوير |
| Immunol & nbsp ؛ الفلورة طقم تلطيخ | شركة Beyotime للتكنولوجيا الحيوية | P0196 | |
| KCl | شركة تشنغدو كولون للكيماويات | 2021070901 | |
| ماركر | شركة ثيرمو فيشر للأدوات العلمية | 26616 | |
| قارئ صفيحة دقيقة | Perkin Elmer Corporate Management (شنغهاي) Co. | HH35L2018296 | |
| المجهر المقلوب الموتيك | شركة ناندا للأدوات العلمية | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical | Company 2014081301 | |
| الحليب الخالي من الدسم | شركة Beyotime Biotechnology | Company P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group، Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group، Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 خلايا | الأكاديمية الصينية للعلوم | CBP60430 | |
| محلول البنسلين والستربتومايسين | هيكلون | SV30010 | |
| بيوتيم للتكنولوجيا الحيوية | P1045 | ||
| فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم | تشنغدو كولون للكيماويات | 2015082901 | |
| مجموعة فحص أنواع الأكسجين التفاعلية | Beyotime Biotechnology | CompanyS0033S | |
| RI-PA حل التحلل | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE عينة تحميل المخزن المؤقت ، 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| نصائح مرشح معقمة (0.22 & micro ؛ م ) | شركة Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| تريس قاعدة | قوانغتشو saiguo شركة التكنولوجيا الحيوية | 1115GR500 | تبس |
| التربسين | الحرارية العلمية Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | شركة Chengdu Kolon Chemical | Company 2021051301 | |
| مذبذب دوامة | OHAUS International Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصين | VXMNAL | |
| & beta - actin | ووهان Three Eagles Proteintech Group، Inc | 66009-1-Ig |
المراجع
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert c....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
