このプロトコルは、損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略を提供します。このプロトコルは、漢方薬(TCM)の最適なアプリケーションモードを最適化するためのリファレンスを提供します。
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方法論記事
損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略の探索
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
脳虚血の治療における伝統的な漢方薬(TCM)の組み合わせの利点を考慮して、損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略を探索するために、製剤の組み合わせと成分の組み合わせの有効性とメカニズムの違いを研究しました。グルコースフリー培地と組み合わせた塩化コバルト(CoCl2)は、PC12細胞の酸化的損傷を誘発するために使用されました。次に、 レン ゲ(Ast)注射と エリジェロンブレビスカプス (Eri)注射の最適な組み合わせを選択し、PC12細胞に対する安全で効果的な濃度をスクリーニングした後、統一された設計方法に従って組み合わせました。さらに、スクリーニングされた成分の組み合わせは、2つのハーブに10 μMのアストラガロシドA、40 μMのスクテラリン、および75 μMのクロロゲン酸を含みます。次に、MTT、アネキシンV-FITC/PI、免疫蛍光、およびウェスタンブロット分析を使用して、損傷したPC12細胞に対する製剤の組み合わせと成分の組み合わせの有効性とメカニズムを評価しました。結果は、細胞生存促進のための最適な調製の組み合わせが、濃度6:1.8(μM)のAst注射とEriカプセルであることを示しました。成分の組み合わせ(10 μMのアストラガロシドA、40 μMのスクテラリン、および75 μMのクロロゲン酸)は、製剤の組み合わせよりも効果的でした。どちらの組み合わせも、アポトーシス速度、カスパーゼ-3の蛍光強度、および細胞内活性酸素種(ROS)レベルを著しく低下させました。一方、彼らはp-Akt/Akt、Bcl-2/Bax、およびNrf2の発現レベルをアップレギュレートしました。これらの効果は、コンポーネントの組み合わせでより明白でした。結論として、両方の組み合わせは、PC12細胞上のグルコースフリー培地と組み合わせたCoCl2 によって誘発される傷害を阻害し、したがって細胞の生存を促進することができる。ただし、調製の組み合わせに対する成分の組み合わせの効率は、酸化ストレスとアポトーシスに関連するPI3K / Akt / Nrf2シグナル伝達経路のより強力な制御による可能性があります。
概要
脳低灌流による慢性脳虚血は、中高年に多い疾患です1。長期潜血性疾患として、進行性または持続性の神経機能障害を引き起こす可能性があります。主な病理学的メカニズムには、細胞のアポトーシスおよび酸化的損傷が含まれ、進行性または持続性の神経学的機能障害を引き起こす。これは、アルツハイマー病、血管性認知症、およびその他の疾患の病理学的基盤であり、患者の生活の質に深刻な影響を及ぼします。しかし、現代医学では慢性脳虚血を治療するための理想的な薬がまだ不足しています2。同時に、 レン ゲ(Ast)と エリジェロンブレビスカプス (Eri)の組み合わせは、伝統的な漢方薬(TCM)の臨床診療で広く使用されています4。併用戦略は、脳虚血後の神経機能の回復を促進する上で著しく改善されており、これは単一の薬剤よりも優れています。しかしながら、2つの薬剤の組み合わせでは投与比に大きな違いがある4。有効な成分と作用機序は明確に定義されておらず、これが臨床応用を制限する重要な問題です。
以前の研究では、ラットの脳虚血の治療におけるAst注射とEri注射の製剤の組み合わせの相乗効果が実証されています。p-Aktタンパク質の発現をアップレギュレートし、Bリンパ芽腫2(Bcl-2)ファミリ....
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プロトコル
1. 試薬の調製
- 125 mLの滅菌培養フラスコに90 mLのDMEM高糖培地、10 mLのウシ胎児血清(FBS)、および1 mLのペニシリン-ストレプトマイシン溶液を加えて、完全培地を調製します。完全培地を混合し、密閉条件下で4°Cで保存する。
- 10 mLのDMEM無糖培地(完全に溶解)に0.02 gのCoCl2粉末(正確に秤量)を加えてCoCl2溶液を調製し、8.4 mMストック溶液を得た。溶液を0.22 μmのバクテリアフィルターでろ過し、密封して、光から4°C離して保存します。
注:CoCl2 は不安定であり、光から保護された密閉容器に保管する必要があります。CoCl2 溶液の有効期間は7日間です。 - トリス塩酸緩衝塩溶液(TBST)を調製します。
- 8 gの塩化ナトリウム、0.2 gの塩化カリウム、および3 gのトリス塩基を正確に計量します。それらを1Lビーカーに加え、次に1,000mLのRO水を加えて混合物を溶解します。
- pHを7.4に調整し、1 mLのTween 20を加え、十分に混合してTBST溶液を得ます。
注:Tween 20は、抗原に対する抗体の非特異的結合を低減する界面活性剤として機能し、0.1%濃度で最適に機能します。
- MTT(3-(4,5....
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結果
Ast注射とEriカプセルの最適な組み合わせのスクリーニングを図1に示す。正常PC12細胞に対するAst注射およびエリカプセルの細胞生存率を図1Aに示す。細胞生存率は、12 μMを超える濃度のAst注射(図1A)および5 μMを超える濃度のEriカプセル(図1A)で95%未満であり、最大非毒性濃度がそれぞれ12 μMおよび5 μMであることを示しています。それらの細胞毒性は、単独で使用されたアストラガロシドAおよびスクテラリンのそれよりも大きかった。CoCl2によって誘導された損傷したPC12細胞に対するAst注射およびEriカプセルの生存率を図1B、Cに示す。モデル群と比較して、Ast注射は6〜12μM(p < 0.05またはp < 0.01)の濃度範囲で損傷したPC12細.......
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ディスカッション
現代の臨床診療では、脳虚血の治療に理想的な薬がまだ不足しています2。気を補い、血液循環法を活性化するという指導の下で、Ast、Eri、およびその他の製剤は、TCMの臨床診療で組み合わせて使用 され、優れた包括的な利点を達成しています13,14,15。多くの研究により、Astは血液脳関門の透過性を改善し、脳血流を増加させ、神経細胞が低酸素症に耐え、酸素フリーラジカル損傷に抵抗する能力を改善し、神経機能障害を大幅に改善できることが示されています16,17。老人性虚血性脳血管疾患に特に適しています16,17。Eriは血管を拡張し、脳への血液供給を増加させ、ROSを除去し、脂質過酸.......
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開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
この研究は、四川省科学技術局の主要な研究開発プロジェクト(2020YFS0325)によって資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1300シリーズクラスIIバイオセーフティキャビネット | モフィッシャーサイエンティフィックインスツルメンツ | カンパニー1374 | |
| 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド | 州saiguoバイオテクノロジー | カンパニー1334GR001 | |
| MTT ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, | Inc-Akt | |
| Wuhan | Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| 分析フローサイトメトリー | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbaoアイランドファーマシューティカルカンパニー | A03190612144 | アストインジェクション |
| アストラガロシドA | 重慶ガオレンバイオテクノロジー | カンパニー84687-43-4 | |
| Bax | 武漢スリーイーグルスプロテインテックグループ、株式会社 | 60267-1-Ig | |
| BCAタンパク質定量キット | Beyotimeバイオテクノロジー会社 | P0012 | |
| BCL-2 | 武漢スリーイーグルスプロテインテックグループ株式会社 | 26593-1-AP | |
| 二酸化炭素インキュベーター | サーモフィッシャーサイエンティフィックインスツルメンツカンパニー | 0816-2014 | |
| カスパーゼ-3 | 武漢スリーイーグルス プロテインテックグループ株式会社 | 19677-1-AP | |
| クロロゲン酸 | 重慶高レンバイオテクノロジーカンパニー | 327-97-9 | |
| 塩化コバルト六水和物 | メルクバイオテクノロジー株式会社 | 7791-13-1 | CoCl2 |
| ジメチルスルホキシド | 州saiguoバイオテクノロジー会社 | 2020112701 | DMSO |
| 二ナトリウムリン酸二ナトリウムdodecahydrate | 成都Kolon化学会社 | 2020090101 | |
| DMEM高糖媒体 | サーモサイエンティフィックHyclone | 2110050 | |
| DMEM無糖媒体 | 北京Solarbioライフサイエンス会社 | ||
| ECL 発光流体 | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| 電子天秤 | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, | China FA1204 | |
| 電気泳動装置 | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule Fetal |
| Uvine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| 蛍光顕微鏡 | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| ゲルイメージャー | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | .SA00001-1 | |
| ヤギ抗ウサギ二次抗体 | 武漢スリーイーグルス Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA-ImageJ | ||
| 1.8.0 | National Institutes of Health, USA-imaging | software | |
| Immunol 蛍光 染色キット | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | ||
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | ||
| Motic 倒立顕微鏡 | Nanda Scientific Instruments Co. | ||
| NaCl | 成都Kolon化学会社 | 2014081301 | |
| 無脂肪牛乳 | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | 武漢スリーイーグルス プロテインテックグループ株式会社 | 16396-1-AP | |
| P-Akt | 武漢スリーイーグルス プロテインテックグループ株式会社 | 66444-1-Ig | |
| PC12細胞 | 中国科学院 | ||
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 | サーモサイエンティフィック ハイクロン | SV30010 | |
| ホスファターゼ プロテアーゼ阻害剤混合物 | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| リン酸二水素カリウム | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| 活性酸素種アッセイキット | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA溶解液 | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGEサンプルローディングバッファー、5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| 滅菌フィルターチップ(0.22 µm) | メルク・バイオテクノロジー・インク | ||
| トリスベース | 広州西国生物科技会社 | 1115GR500 | TBS系 |
| トリプシン | サーモサイエンティフィックHyclone | J190013 | |
| Tween-20 | 成都Kolon化学会社 | 2021051301 | |
| 渦発振器 | OHAUSインターナショナル株式会社、上海、中国 | VXMNAL | |
| β-アクチン | 武漢スリーイーグルスプロテインテックグループ、株式会社 | 66009-1-IG |
参考文献
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert c....
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再版と許可
