Summary
본 프로토콜은 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 H9c2 심근 세포에서 전압 게이트 칼륨 (Kv) 채널 전류의 실시간 및 동적 획득을위한 효율적인 방법을 설명합니다.
Abstract
심근 세포막의 칼륨 채널은 세포 전기 생리 학적 활동의 조절에 중요한 역할을합니다. 주요 이온 채널 중 하나인 전압 게이트 칼륨(Kv) 채널은 약물로 인한 심근 손상 및 심근 경색과 같은 일부 심각한 심장 질환과 밀접한 관련이 있습니다. 본 연구에서, H9c2 심근 세포에서 Kv 채널 전류 (IKv)에 대한 1.5 mM 4- 아미노 피리딘 (4-AP, 광범위 칼륨 채널 억제제) 및 아코 니틴 (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM)의 효과를 결정하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하였다. 4-AP는 I Kv를 약 54% 억제한 반면, IKv에 대한 AC의 억제 효과는 용량 의존적 경향을 나타냄을 알 수 있었다(25μM에 대해서는 효과 없음, 50μM에 대해서는 30% 억제율, 100μM에 대해서는 46% 억제율 및 200μM에 대해서는 54% 억제율). 더 높은 감도와 정밀도의 특성으로 인해이 기술은 심장 독성 및 이온 채널을 표적으로 삼는 민족 의학의 약리학 적 효과에 대한 탐구를 촉진 할 것입니다.
Introduction
이온 채널은 세포막의 지질 이중층에 내장 된 특수 통합 단백질입니다. 활성화제의 존재 하에서, 이러한 특수 통합 단백질의 중심은 고도로 선택적인 친수성 기공을 형성하여, 적절한 크기 및 전하의 이온이 수동수송 방식으로 통과하도록 한다1. 이온 채널은 세포 흥분성과 생체 전기의 기초이며 다양한세포 활동에서 중요한 역할을 합니다2. 심장은 활동 전위3에 의해 시작된 흥분-수축 결합 과정으로 인한 규칙적인 수축을 통해 다른 기관에 혈액을 공급합니다. 이전 연구에 따르면 심근 세포의 활동 전위 생성은 세포 내 이온 농도의 변화로 인해 발생하며 인간 심근 세포에서 Na +,Ca 2+ 및 K + 이온 채널의 활성화 및 비활성화는 특정 시퀀스 4,5,6에서 활동 전위의 형성으로 이어집니다. 교란된 전압 게이트 칼륨(Kv) 채널 전류(IKv)는 정상적인 심장 리듬을 변화시켜 주요 사망 원인 중 하나인 부정맥을 유발할 수 있습니다. 따라서 IKv를 기록하는 것은 생명을 위협하는 부정맥7을 치료하기위한 약물의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다.
Kv 채널은 칼륨 채널의 중요한 구성 요소입니다. Kv 채널의 배위 기능은 포유류 심장의 전기적 활동 및 심근 수축성에 중요한 역할을합니다 8,9,10. 심근 세포에서 활동 전위의 진폭과 지속 시간은 여러 Kv 채널 하위 유형11에 의한 외부 K + 전류의 공동 전도에 따라 달라집니다. Kv 채널 기능의 조절은 심장 활동 전위의 정상적인 재분극에 매우 중요합니다. Kv 전도도의 가장 작은 변화조차도 심장 재분극에 큰 영향을 미치고 부정맥12,13의 가능성을 증가시킵니다.
세포 전기생리학적 연구의 기본 방법을 나타내는 세포막의 작은 영역과 전체 세포 패치 클램프 기록을 위한 피펫 팁 사이의 고저항 밀봉은 음압을 적용하여 설정할 수 있습니다. 지속적인 음압은 세포막이 피펫 팁과 접촉하여 피펫의 내벽에 달라붙게 합니다. 결과적인 완전한 전기 회로는 세포막(14)의 표면을 가로지르는 임의의 단일 이온 채널 전류를 기록할 수 있게 한다. 이 기술은 세포막 이온 채널 전류에 대해 매우 높은 감도를 가지며 모든 이온 채널에서 전류를 감지하는 데 사용할 수 있으며 응용 분야는 매우 광범위합니다15. 또한, 형광 표지 및 방사성 표지와 비교하여, 패치 클램프는 더 높은 권위 및 정확도를 갖는다16. 현재 전체 셀 패치 클램프 기술은 Kv 채널 전류17,18,19에 작용하는 한의학 성분을 감지하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, Wang 등은 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 연꽃 종자의 유효 성분이 활성화 된 상태 채널19를 차단함으로써 Kv4.3 채널의 억제를 달성 할 수 있음을 확인했습니다. Aconitine (AC)은 Aconitum carmichaeli Debx 및 Aconitum pendulum Busch와 같은 Aconitum 종의 효과적이고 활성 성분 중 하나입니다. 수많은 연구에 따르면 AC의 과다 복용은 부정맥과 심지어 심장 마비를 유발할 수 있습니다20. AC와 전압 게이트 이온 채널 사이의 상호 작용은 심장 독성21의 핵심 메커니즘 인 세포 내 이온 항상성의 파괴로 이어진다. 따라서이 연구에서는 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 심근 세포의 IKv에 대한 AC의 효과를 결정합니다.
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Protocol
상업적으로 입수한 H9c2 래트 심근세포( 재료 표 참조)를 5%CO2 가습 분위기에서 37°C에서 10% 열불활성화된 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 중에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 정상 H9c2 세포 및 4-AP- 또는 AC 처리 세포에서 IKb 의 변화를 감지했습니다 (그림 1 및 그림 2).
1. 용액 준비
- 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 세포 배양 배지를 준비한다( 재료 표 참조).
- 100μL의 DMSO 용액에 14.1165mg의 4-AP를 첨가하여 1.5 M 4-AP 용액을 준비합니다( 재료 표 참조). 세포외 용액을 첨가하여 1.5 M4-AP를 1.5 mM로 희석한다(단계 1.5).
- 19.36μL의 DMSO 용액에 5mg의 AC를 첨가하여 400mM AC를 준비합니다( 재료 표 참조).
알림: 위의 모든 용액은 4°C 냉장고에 보관되었으며 DMSO의 최종 농도는 0.1%(v/v)를 초과해서는 안 됩니다. - 0.4100g의 KCl (110.0 mM), 0.0120 g의 MgCl 2 (1.2 mM), 0.1270 g의 Na2 ATP (5.0 mM), 0.1190 g의 HEPES (10.0 mM) 및 0.1900 g의 EGTA (10.0 mM)를 이중 증류수 50 mL에 첨가하여 50 mL의 세포 내 용액을 준비합니다 (표 1 및 재료 표 참조).
참고: 세포내 용액의 pH 값을 1M KOH를 사용하여 7.2로 조정하고 작은 부피(1.5-2mL)로 분취하여 -20°C에서 보관했습니다. - 이중 증류수 50mL에 KCl 0.0185g(5.0mM), NaCl 0.3945g(135.0mM), MgCl 0.0203g2·6H2O(2.0mM), hepes 0.0595g(5.0mM), D-포도당 0.0990g(10.0mM)을 첨가하여 세포외용액 50mL를 준비합니다(표 1 및 재료 표 참조).
알림: 세포 외 용액은 즉시 사용할 수 있도록 준비해야하며 pH 값은 7.4M NaOH를 사용하여 1로 조정해야합니다.
2. 세포 배양
- H9c2 배양 접시가 80% 합류하면 0.25% 트립신으로 세포를 30초 동안 소화합니다.
- 5%CO2 분위기 및 70% - 80% 상대 습도로 37°C에서 24시간 동안 유리판으로 카펫이 깔린 35mm 접시에 일반 배지 또는 약물 함유 배지(25μM, 50μM, 100μM 및 200μM AC)로 2 x 105 cells/mL를 배양합니다(재료 표 참조).
3. 마이크로 피펫 제작
- 마이크로피펫 풀러를 켜고( 재료 표 참조) 30분 동안 예열합니다.
- 필라멘트(OD: 1.5mm, ID: 1.10mm, 길이 10cm)가 있는 붕규산 유리 모세관을 마이크로피펫 풀러에 놓습니다. 3.3 단계에서 설정 한 프로그램을 선택하고 제어판에서 Enter 키를 클릭하십시오. 오른쪽 상단 모서리에 있는 램프 프로그램을 클릭하여 유리 모세관의 "열" 값을 결정합니다.
- "램프"테스트에 의해 결정된 값에 따라 전극을 당기는 프로그램을 작성하고 "열"값 = "램프"값, 풀 = 0, 벨 = 풀로드 이동 속도, 시간 = 200-250 단계를 사용하십시오. Pull( 당기기 )을 클릭하여 피펫 제작을 시작합니다.
알림: 사용하기 전에 마이크로피펫 풀러의 밀봉된 용기에 있는 건조제의 색상을 관찰하십시오. 색상이 파란색에서 분홍색으로 바뀌면 건조제를 교체해야합니다. 전극 팁의 오염을 방지하려면 피펫 준비 중에 유리 모세관의 중간 부분을 만지지 마십시오. 그런 다음 생산 된 피펫을 조심스럽게 제거하고 밀폐되고 밀봉 된 용기에 넣으십시오.
4. 기기 설정
- 해당 기기를 디지털-아날로그 변환기, 신호 증폭기, 마이크로 매니퓰레이터, 현미경 및 카메라 순서로 켭니다( 재료 표 참조).
- 이미징 어플리케이션, 신호 증폭기 소프트웨어 및 데이터 수집 소프트웨어를 순차적으로 엽니다( 재료 표 참조).
알림: 기기는 순차적으로 켜야 합니다. 그렇지 않으면 소프트웨어를 연 후 "데모 디지타이저" 상태가 나타납니다.
5. IKv 파라미터 설정
- 아래 단계에 따라 IKv 를 기록하기 위한 프로토콜을 편집합니다.
- Edit( 편집)를 클릭하고 데이터 수집 소프트웨어에서 프로토콜 편집을 선택합니다( 재료 표 참조).
- "파형"인터페이스에서 프로그램을 편집하십시오 : 에포크 A (첫 번째 레벨 = -60mV, 델타 레벨 = 0mV, 첫 번째 지속 시간 = 20ms 및 델타 지속 시간 = 0ms); 에포크 B(첫 번째 레벨 = -40mV, 델타 레벨 = 10mV, 첫 번째 지속 시간 = 150ms, 델타 지속 시간 = 0ms) 및 에포크 C(첫 번째 레벨 = -60mV, 델타 수준 = 0mV, 첫 번째 지속 시간 = 30ms, 델타 기간 = 0ms).
- 그런 다음 모드/속도 인터페이스를 클릭하고 "시험 계층 구조" 데이터를 설정합니다: 시험 지연 = 0초, 실행 = 1, 스윕 = 11, 스윕 기간 = 0.22초22,23.
참고: 제어 조건에서 -60mV의 유지 전위에서 10mV씩 증가하여 -40mV에서 +60mV까지 150ms 탈분극 단계를 적용하여 IKv 채널 전류를 획득합니다. 프로토콜의 총 시간은 "파형"프로그램에 설정된 시간보다 커야합니다.
- P/N 누출 빼기 프로그램 편집: 프로토콜 편집을 클릭하여 자극 버튼을 선택하고 P/N 누출 빼 기 대화 상자에서 누출 빼기 프로그램을 설정합니다: 서브스윕 수 = 2-8(이 연구에서는 4), 안정화 시간 = 100-1,000ms(이 연구에서는 200), "극성" = "파형과 반대", 유지 레벨 = -80mV.
알림: P/N 누출 빼기는 "첫 번째 유지"(-60mV)보다 낮은 유지 수준을 가져야 합니다.
6. 전압 클램프 모드에서 I Kv 의 전체 셀 패치 클램프 기록
- 데이터 저장 경로 설정: 파일을 클릭하고 데이터 수집 소프트웨어에서 데이터 파일 이름 설정을 선택합니다. 데이터 수집 소프트웨어에서 Edit (Open Protocol)를 선택하고 Open Protocol을 클릭하여 설정된 IKv 프로토콜 (5.1 단계)을 엽니 다. 마지막으로 도구 옵션을 클릭하고 멤브레인 테스트를 선택하여 프로토콜 실행을 시작합니다.
- 세포외 용액(단계 1.5)을 전체 세포 패치 클램프 장치( 재료 표 참조)의 세포 배스에 추가하고 H9c2 세포(단계 2.1에서 배양)와 함께 커버슬립을 수조에 위쪽으로 놓습니다.
- 피펫(3단계에서 제작)의 30%를 세포외 용액으로 채우고 패치 클램프 장치에 통합된 기록 전극 홀더에 설치합니다. O-링 고무 가스켓과 플라스틱 와셔로 피펫을 조입니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터로 피펫을 욕조에 떨어 뜨립니다. 신호 증폭기 소프트웨어(재료 표 참조)의 파이펫 오프셋 인터페이스를 클릭하여 IKv 전류 기준선을 0pA로 유지합니다.
알림: 세포 내 용액(단계 1.4)은 은선의 AgCl/Ag 부분과 접촉해야 하며 은선은 피펫의 내벽에 가깝지 않아야 합니다. 피펫의 저항은 2-6 MΩ이어야합니다. 피펫 팁의 폐색을 방지하려면 플라스틱 튜브24를 통해 기록 전극 홀더에 연결된 1.0mL 주사기를 사용하여 연속 양압을 피펫에 전달해야 합니다. - 플라스틱 튜브를 통해 기록 전극 홀더에 연결된 1.0mL 주사기를 사용하여 적절한 양압을 수동으로 전달합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 3차원으로 조작하여 피펫을 약간 움직여 셀과 접촉합니다.
- 피펫이 세포막에 닿은 후 막 테스트 구형파가 1/3에서 1/2로 떨어지면 양압을 제거하고 적절한 음압을 수동으로 전달합니다. 그런 다음 데이터 수집 소프트웨어의 패치 인터페이스를 클릭하여 GΩ 씰을 형성합니다. 셀 밀봉 중에 "C p Fast" 및 "Cp Slow" 신호 증폭기 소프트웨어를 사용하여 빠르고 느린 정전 용량을 보상하십시오.
참고: 멤브레인 테스트가 ≥1GΩ이면 피펫 팁과 셀 사이에 셀 부착 구성이 형성됩니다. - 세포막의 패치를 파열시키기 위해 짧은 음압 펄스를 적용하십시오.
참고: 막 저항의 급격한 감소는 성공적인 전체 세포 기록 패턴을 특징짓습니다. 액세스 저항(Ra)이 ≥30MΩ이면, 셀들은 단계 6.3 내지 6.6을 위해 재선택되어야 한다. 기록된 IKv 데이터의 정확성을 보장하기 위해, 세포막이 파괴된 후에 음압이 제거되어야 한다. - 신호 증폭기 소프트웨어의 전체 셀 버튼을 클릭하여 전체 셀 멤브레인 커패시턴스 보상을 실행합니다. 마지막으로 데이터 기록 버튼을 클릭하여 데이터를 저장하고 기록합니다.
- 데이터 분석 소프트웨어로 저장된 IKv 데이터를 엽니다. 전류-전압(I−V) 관계 저장: 분석을 클릭하여 통계를 선택하여 다음을 수행합니다: 데이터 분석을 위해 범위를 Cousors 1,2로 선택합니다. 피크 진폭 및 평균 버튼을 클릭한 다음 확인을 클릭하여 결과 페이지에서 데이터를 봅니다. 마지막으로, 추가 분석을 위해 IKv 평균 데이터의 열을 함수 그리기 소프트웨어(재료 표 참조)에 복사합니다.
- 대표 IKv 현재 트레이스 저장: 편집을 클릭하여 트레이스 전송을 선택합니다. 그런 다음 전송할 지역에서 전체 추적을 선택합니다. 그런 다음 추적 선택에서 선택을 클릭하고 신호에서 IN 0 (pA)을 선택합니다. 마지막으로 확인을 클릭하여 "결과" 페이지에서 데이터를 보고 전체 데이터를 함수 그리기 소프트웨어에 복사하여 현재 추적을 그립니다.
- IKv 프로토콜 저장: 편집을 클릭하여 자극 파형 신호 생성을 선택하고 확인을 선택합니다. 그런 다음 "신호"에서 A0 # 0 (mA)을 선택하는 것을 제외하고 6.9 단계를 다시 실행하십시오.
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Representative Results
이 프로토콜은 전체 세포 패치 클램프 기술에서 설정된 파라미터에 따라 IKv의 기록을 허용했습니다. IKv는 -60 mV의 유지 전위에서 -40에서 +60 mV까지 150ms의 탈분극 펄스 자극에 의해 트리거되었습니다(그림 3A). H9c2 쥐 심근 세포의 IKv는 처음에는 -20 mV 부근에서 나타 났으며, 그 후 진폭은 추가 탈분극으로 증가했다. IKv와 막 전위 사이의 평균 관계는 측정 된 전류 진폭으로부터 계산되었다. 결과는 대조군과 비교하여, 1.5 mM 4-AP로 5분 처리 후IKv 진폭이 눈에 띄게 감소되었음을 보여주었다(도 3B). 추가적으로, IKv는 24 시간 AC 처리 후 용량 의존적 방식으로 10 mV에서 60 mV까지 막 전위에서 유의하게 감소하였다 (그림 3C-F).
그림 1: I Kv를 기록하는 데 필요한 장비 및 기기 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 전-세포 패치-클램프 기술을 사용한 H9c2 세포에서의 I Kv의 전기생리학적 기록의 흐름도. (A) 세포 배양. (b) 세포내 및 세포외 용액의 제조. (C) 전체 세포 기록의 개략도. C1: 피펫을 셀 가까이로 이동합니다. C2: 피펫과 셀 사이에 고저항 씰을 형성합니다. C3: 세포막을 파열시킵니다. (d) IKv를 기록합니다. D1 : K + 전류 형성의 개략도; D2: 전체 셀 전압 클램프 모드에서 기록된 IKv에 대한 대표적인 전류 트레이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3:H9c2 세포 에서의 대표적인 I Kv. (A) 무처리 (대조군), 24 시간 동안 AC 함유 배지 (25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM) 및 1.5 mM 4-AP로 5 분 동안 H9c2 세포에서 측정 된 IKv에 대한 대표적인 전류 트레이스. IKv는 -60 mV의 유지 전위에서 -40에서 +60 mV까지 150 ms의 탈분극 펄스에 의해 트리거되었습니다. (b) 1.5 mM 4-AP 자극의 경우, IKv는 10 mV 내지 60 mV의 막 전위에서 하강하였다. (C-F) AC 처리는 막 전위에서 농도 의존적 방식으로 IKv를 10 mV에서 60 mV로 감소시켰다. *p < 대조군 대비 0.05(n=6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 세포 외 용액 | ||
| 화학 물질 | g / 50 밀리람베르트 | 조성 (mM) |
| 나트륨 | 0.3945 | 135.0 |
| 증권 시세 표시기 | 0.1865 | 5.0 |
| 헤페스 | 0.5958 | 5.0 |
| MgCl2·6H2O | 0.2033 | 2.0 |
| D- 포도당 | 0.9900 | 10.0 |
| 세포 내 용액 | ||
| 화학 물질 | g / 50 밀리람베르트 | 조성 (mM) |
| 증권 시세 표시기 | 0.4100 | 110.0 |
| 마그네슘 2 | 0.0120 | 1.2 |
| Na2-ATP | 0.1270 | 5.0 |
| 헤페스 | 0.1190 | 10.0 |
| 증권 시세 표시기 | 0.1900 | 10.0 |
표 1: 전압 클램프 모드에서 IKv 를 기록하기 위한 세포내 및 세포외 용액.
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Discussion
패치-클램프 전기생리학적 기술은 주로 세포막(25) 상의 이온 채널의 전기적 활성 및 기능적 특성을 기록하고 반영하는데 사용된다. 현재, 패치 클램프 기술의 주요 기록 방법은 단일 채널 기록 및 전체 셀 기록(26)을 포함한다. 전체 셀 모드의 경우, 유리 미세전극 및 음압은 세포막의 작은 영역과 피펫 팁(27) 사이에 고저항 밀봉을 형성하는데 사용된다. 지속적인 음압으로 인해 피펫의 팁이 세포막이 파열되고 막이 피펫의 내벽에 부착되면 피펫과 셀 사이에 형성된 완전한 전기 회로를 통해 세포막 표면에 개별 이온 채널의 전류 밀도를 기록할 수 있습니다(26,27). . 최근 몇 년 동안 전체 세포 패치 클램프 기술은 이온 채널 관련 질병을 표적으로 하는 약물 연구에 널리 사용되었습니다. 비록 그것이 조작자에 대한 높은 요구들을 가지고 있지만, 이 기술은 여전히 이온 채널 연구28를 위한 "황금 표준"으로 남아 있다. 또한, 천공된 패치-클램프 기술은 항생제를 사용하여 세포막(29, 30) 내에 투과성 기공을 형성함으로써 연장된 기간에 걸쳐 비교적 안정한 세포내 환경에서 표적 이온 채널의 전류 변화를 기록할 수 있다. 전류 클램프 또는 전압 클램프 모드에서 전체 셀 패치 클램프 기술을 사용하여 이온 채널의 전압 또는 전류의 동적 변화를 기록하고 추적 할 수 있으므로 의심 할 여지없이 약물의 약리학 적 활성 또는 독성 메커니즘을 평가하는 강력한 플랫폼입니다31,32.
AC는 Aconitum 종의 주요 독성 성분 중 하나이며 디 에스테르-디 테르 페 노이드 알칼로이드 그룹에 속하며 독성이 매우 높습니다20,33. 증거에 따르면 AC는 심혈관 독성34,35를 유발할 수 있습니다. 비 선택적 K + 채널 차단제로서 AC는 과도 외부 K + 전류, 초고속 지연 정류기 K + 전류 및 고속 지연 정류기 외부 K + 전류를 차단하여 부정맥21,36,37을 유발할 수 있다고보고되었습니다. 현재까지 전압 의존성 칼륨 전류가 AC의 심장 독성에 관여한다는 강력한 증거는 없습니다. 따라서, 본 연구에서, 래트 H9c2 심근 세포에서 IKv에 대한 AC의 억제 효과를 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 조사하였다. Na+ 채널의 활성화는 AC가 약리학적 또는 독성학적 효과를 발휘하는 널리 알려진 메커니즘입니다38. 흥미롭게도 AC가 IKv 21,36,37에 직접 작용할 수 있다는 증거가 있습니다. 그러나, 본 논문에 제시된 데이터는 AC가 IKv를 직접적으로 억제할 수 있다는 충분한 증거를 제공하지 않는다. AC의 IKv 억제 효과는 Na+ 채널의 직접적인 활성화로 인한 것일 수 있으며, 이는 추가 조사가 필요합니다.
이 연구에 사용 된 전체 세포 패치 클램프 기술은 처음부터 개발 된 이래로 이온 채널 측면에서 약물의 심장 독성을 탐구하는 기존의 방법이되었습니다. 본 실험은 AC가 전압 클램프 모드에서 농도 의존적으로 H9c2 세포의 IKv를 효과적으로 억제함을 확인하였다. 그러나 K+ 채널을 포함한 각 유형의 이온 채널에는 여러 하위 유형이 포함되어 있으며 이 연구에서는 총 전압 종속 K+ 채널 전류만 기록되었습니다. 후속 연구는 특정 이온 채널 아형의 높은 발현을 갖는 모델 세포주를 통해 AC의 약리학적 및 독성학적 메커니즘을 탐구할 수 있다37. 대안적으로, 형광 단백질로 표지된 특정 이온 채널을 통합하여 AC의 심근 독성을 시각적으로 조사할 수 있다(39). 이 프로토콜의 중요한 단계는 6.4-6.6단계입니다. 이러한 3개의 단계를 완료하는 것은 IKv의 후속 기록이 성공적인지 여부를 직접 결정한다. 다른 기술과 비교하여 전체 세포 패치 클램프 기술은 높은 기술 요구 사항과 낮은 처리량 기록40의 특성을 가진 세포막 또는 세포 소기관막의 단일 이온 채널에 전류를 기록하기 위한 황금 표준이며 허용되는 방법입니다. 요약하면, 이 기술은 세포 전기생리학 연구의 기본 방법일 뿐만 아니라 신경과학, 심혈관 과학 및 기타 분야에서도 널리 사용됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
중국 국립 자연 과학 재단 (82130113)과 칭하이 성 과학 기술부 (2020-SF-C33)의 핵심 R & D 및 혁신 프로그램의 재정 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
| Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
| Amplifier | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
| Analytical Balance | Sartorius | 124S-CW | |
| ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
| Cell culture dish (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cell culture dish (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
| Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
| Clampfit software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | data acqusition software |
| D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
| Digital camera | Hamamatsu | C11440 | |
| Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
| H9c2 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
| HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
| HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
| HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
| KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
| KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
| MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
| MgCl2·6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Microscope cover glass (20 × 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
| Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
| MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | signal-amplifier software |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| PH meter | Mettler Toledo | S201K | |
| Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
References
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