Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

القياس الكمي في الوقت الحقيقي لتأثيرات TnpB المرتبط بعائلة IS200 / IS605 على نشاط Transposon

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64825
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2,3
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Microbiology Program, University of California, 3Biophysics Program, University of California
* These authors contributed equally

Summary

تم تحديد بروتوكول لإجراء تصوير مباشر في الوقت الفعلي لتحديد كيفية تأثير البروتين الملحق TnpB على ديناميكيات التحويل في خلايا الإشريكية القولونية الحية الفردية.

Abstract

هنا ، تم تحديد بروتوكول لإجراء تصوير مباشر في الوقت الفعلي لنشاط العناصر القابلة للنقل في الخلايا البكتيرية الحية باستخدام مجموعة من مراسلي الفلورسنت المقترنة بالنقل. على وجه الخصوص ، يوضح كيف يمكن استخدام التصوير في الوقت الفعلي لتقييم آثار البروتين الملحق TnpB على نشاط العنصر القابل للنقل IS608 ، وهو عضو في عائلة IS200 / IS605 من العناصر القابلة للنقل. عائلة IS200 / IS605 من العناصر القابلة للنقل هي عناصر متحركة وفيرة متصلة بأحد أكثر الجينات التي لا تعد ولا تحصى الموجودة في الطبيعة ، tnpB. تقترح تماثلات التسلسل أن بروتين TnpB قد يكون مقدمة تطورية لأنظمة CRISPR / Cas9. بالإضافة إلى ذلك ، تلقى TnpB اهتماما متجددا ، بعد أن ثبت أنه يعمل كنوكلياز داخلي للحمض النووي الريبي يشبه Cas. تم تحديد تأثيرات TnpB على معدلات تبديل IS608 ، وثبت أن تعبير TnpB ل IS608 يؤدي إلى ~ 5x زيادة نشاط الترانسبوزون مقارنة بالخلايا التي تفتقر إلى تعبير TnpB.

Introduction

العناصر القابلة للنقل (TEs) هي عناصر وراثية تحشد داخل جينومها المضيف عن طريق الاستئصال أو تحفيز النسخ متبوعا بإعادة الاندماج الجينومي. توجد TEs في جميع مجالات الحياة ، ويعيد التحويل هيكلة الجينوم المضيف ، ويحور مناطق الترميز والتحكم1. هذا يولد الطفرات والتنوع التي تلعب دورا مهما في التطور2،3 ، والتنمية4،5 ، والعديد من الأمراض البشرية6 ، بما في ذلك السرطان7.

باستخدام التركيبات الجينية الجديدة التي تربط جوانب نشاط النقل بمراسلي الفلورسنت ، وصف عملنا السابق تطوير نظام تجريبي يعتمد على TE IS608 البكتيري ، وهو ممثل لعائلة IS200 / IS605 واسعة الانتشار من TEs ، والتي تسمح بالتصور في الوقت الفعلي للتبديل في الخلايا الحية الفردية8 (الشكل 1). يتم عرض نظام TE في الشكل 1A. يتكون TE من تسلسل ترميز transposase ، tnpA ، محاطا بالطرف الأيسر (LE) والطرف الأيمن (RE) التكرارات غير الكاملة (IPs) ، وهي مواقع التعرف والاستئصال ل TnpA. يتم التعبير عن tnpA باستخدام المروج PLTetO1 ، والذي يتم قمعه بواسطة مثبط tet ويمكن تحريضه باستخدام anhydrotetracycline (aTc)9. يقسم TE تسلسل -10 و -35 لمروج PlacIQ1 التأسيسي 10 للمراسل الأزرق mCerulean311. كما هو موضح في الشكل 1C ، عندما يتم تحفيز إنتاج tnpA ، يمكن استئصال TE ، مما يؤدي إلى إعادة تكوين المروج. تعبر الخلية المنتجة عن mCerulean3 وتتألق باللون الأزرق. يتم دمج المحطة N من TnpA مع المراسل الأصفر فينوس12 ، مما يسمح بقياس مستويات TnpA عن طريق التألق الأصفر.

IS608 وأعضاء آخرين من عائلة IS200 / IS605 من الترانسبوزونات عادة ما يشفرون أيضا جينا ثانيا للوظيفة غير المعروفة حتى الآن ، tnpB13. بروتينات TnpB هي عائلة وفيرة للغاية ولكنها غير كاملة من النيوكليازات المشفرة بواسطة العديد من TEsالبكتيرية والقديمة 14,15 ، والتي غالبا ما تتكون من tnpB16 فقط. علاوة على ذلك ، جددت الدراسات الحديثة الاهتمام ب TnpB من خلال العثور على أن TnpB يعمل كنوكلياز داخلي قابل للبرمجة موجه بالحمض النووي الريبي يشبه كريسبر / كاس والذي سيؤدي إما إلى فواصل dsDNA أو ssDNA في ظل ظروف متنوعة17,18. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح ما هو الدور الذي قد يلعبه TnpB في تنظيم النقل. لإجراء تصور في الوقت الفعلي لتأثيرات TnpB على تبديل IS608 ، تم إنشاء نسخة من transposon ، بما في ذلك منطقة الترميز من TnpB مع اندماج N-terminal إلى بروتين الفلورسنت الأحمر mCherry.

استكمالا للدراسات الأكثر تفصيلا على مستوى الجزء الأكبر التي أجراها مختبر كولمان19 ، يظهر هنا كيف يمكن للتصوير في الوقت الفعلي لنشاط الترانسبوزون أن يكشف كميا عن تأثير TnpB أو أي بروتينات ملحقة أخرى على ديناميكيات النقل. من خلال دمج TnpB إلى mCherry ، يتم تحديد أحداث النقل الفردية بواسطة التألق الأزرق وترتبط بمستويات التعبير عن TnpA (التألق الأصفر) و TnpB (التألق الأحمر).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الثقافات البكتيرية

  1. تنمو سلالة الإشريكية القولونية MG1655 مع تركيبات ترانسبوزون البلازميد (الموصوفة سابقا في Kim et al.8) طوال الليل في LB مع المضادات الحيوية المناسبة (25 ميكروغرام / مل من الكانامايسين ، انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تتوفر تسلسلات التركيبات المستخدمة والتسلسلات ذات الصلة كأرقام انضمام GenBank20 OP581959 و OP581957 و OP581958 و OP717084 و OP717085.
  2. لتحقيق نمو أسي ثابت ، قم بتخفيف الثقافات ≥100 مرة في وسط M63 (100 mM KH 2 PO 4 ، 1 mM MgSO 4 ، 1.8 μM FeSO 4 ، 15 mM [NH 4]2SO 4 ، 0.5 ميكروغرام / مل من الثيامين [فيتامين B1]) مكمل بمصدر كربون (0.5٪ وزن / فولت جلوكوز هنا) والمضادات الحيوية المناسبة (انظر جدول المواد).
  3. تنمو الثقافات عند 37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) إلى ~ 0.2. الثقافات جاهزة للاستخدام.

2. إعداد الشريحة

  1. قم بإعداد شريحة عن طريق غلي M63 مع 0.5٪ وزن / فولت جلوكوز و 1.5٪ وزن / فولت أغاروز في الميكروويف لإذابة الأغاروز والتأكد من أنه منصهر تماما ومختلط جيدا.
  2. اترك الخليط يبرد إلى ~ 55 درجة مئوية قبل إضافة المضادات الحيوية والمحرضات (25 ميكروغرام / مل كاناميسين و 10 نانوغرام / ميكرولتر أنهيدروتيتراسيكلين [aTc] ، انظر جدول المواد).
  3. ضع شريحة مجهر على طاولة العمل. قم بتكديس شريحتين أخريين بشكل عمودي على الأولى وضع شريحة أخرى في الأعلى ، بالتوازي مع الشريحة السفلية. تأكد من وجود فجوة تساوي سمك شريحة واحدة بين الشرائح السفلية والعلوية. ماصة ~ 1 مل من خليط الأغاروز M63 في هذه الفجوة بين الشرائح ببطء لإنشاء مربع هلام صغير.
  4. بمجرد أن يتجمد الجل (~ 10-15 دقيقة) ، حرك الشريحة العلوية لإزالتها. تقليم وسادة agarose بشفرة حلاقة أو سكين. ثم ماصة 2.5 ميكرولتر من الثقافة (الخطوة 1.3) ووضع غطاء الغطاء في الأعلى.
  5. أغلق المسافة بين الشريحة وغطاء الغطاء باستخدام الإيبوكسي (انظر جدول المواد). اترك الإيبوكسي يجف وتستقر الخلايا على وسادة الأغاروز لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية.

3. الفحص المجهري مضان الفاصل الزمني

  1. ضع العينة المحضرة (الخطوة 1.3) على مجهر مضان (انظر جدول المواد) في بيئة يتم تسخينها وصيانتها عند 37 درجة مئوية.
    1. اضبط أوقات التعريض الضوئي المناسبة للكاميرا المستخدمة للحصول على الصورة. اضبط شدة الإضاءة لتقليل التبييض الضوئي.
      ملاحظة: تم استخدام وقت التعرض 2 ثانية لكل طول موجي للدراسة الحالية.
    2. لكل طول موجي ، ابحث عن مجال رؤية (FOV) يحتوي على الحد الأدنى من التألق. الحصول على صور لاستخدامها أثناء التحليل لطرح الخلفية.
  2. قم بإعداد بروتوكول للحصول على الصور في شبكة بأطوال موجية مختلفة وعلى فترات زمنية منتظمة.
    1. ترميز التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني في البروتوكول. اضبط تردد الاكتساب على الفاصل الزمني المطلوب (20 دقيقة هنا) وإجمالي مدة الفاصل الزمني على الطول المطلوب (24 ساعة).
    2. ترميز الأطوال الموجية المناسبة في البروتوكول (اعتمادا على البناء المستخدم).
      ملاحظة: ذروة إثارة mCherry عند 587 نانومتر وذروة الانبعاث عند 610 نانومتر21 ؛ mVenus عند 515 نانومتر و 527 نانومتر12 ، بينما mCerulean3 عند 433 نانومتر و 475 نانومتر11.
    3. اضبط حجم الشبكة للالتقاط بين العدد المطلوب من FOVs.
      ملاحظة: استخدمت البيانات التمثيلية الموضحة هنا 8 × 8 FOVs.

4. تحليل الصور

  1. قم بإجراء طرح الخلفية على كل قناة ملونة باستخدام صور الخلفية ذات الصلة التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.2. بالنسبة لجميع خطوات التحليل ، نستخدم وحدات قياسية في النظام الأساسي مفتوح المصدر فيجي22 (انظر جدول المواد).
  2. قرب إجمالي السكان في كل نقطة زمنية عن طريق تحديد عتبة قناة mCerulean وقسمة منطقة العتبة على متوسط مساحة الخلية.
  3. لحساب أحداث الاستئصال الفريدة ، خذ الوقت المشتق من قناة mCerulean3. قم بذلك عن طريق طرح الصور المتتالية في قناة mCerulean3. سيتم الكشف عن أحداث الاستئصال في مشتق الوقت كميض ساطع من التألق.
    1. عتبة كومة أحداث الاستئصال للقضاء على مضان غير مرغوب فيه. لاحظ أن هذه العملية ستؤدي إلى استبعاد أجزاء من عمليات الاستئصال نفسها. لإصلاح ذلك ، قم بتوسيع الصور لاستعادة عمليات الاستئصال إلى أحجامها الأصلية.
      ملاحظة: يمكن إجراء تحليلات باستخدام تقنيات مماثلة للعتبة وتحليل الصور على قنوات التألق الأخرى أيضا (على سبيل المثال ، ربط أحداث الاستئصال بمستويات ترانسبوزاز TnpA [مضان الزهرة الأصفر] و TnpB [مضان الكرز الأحمر].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذه الطريقة لتصور نشاط الترانسبوزون في الخلايا الحية بواسطة الفحص المجهري الفلوري ، مع وجود إنتاجية أقل من قياسات التألق السائبة ، تسمح بالتصور المباشر لنشاط الترانسبوزون في الخلايا الحية الفردية. تؤدي أحداث استئصال الترانسبوزون إلى إعادة تكوين المروج ل mCerulean3 (الشكل 1) ، مما يسمح بتحديد الخلايا التي تخضع لنشاط Transposon عن طريق مضان أزرق ساطع (الشكل 2 ، TnpB +: الفيلم التكميلي 1 و TnpB-: الفيلم التكميلي 2).

وجد أن الخلايا التي تعبر عن البروتين الملحق TnpB (الشكل 3 ، البرتقالي) تشهد مستويات أعلى 4-5 مرات من نشاط الترانسبوزون مقارنة بتلك التي لا تفعل ذلك (الشكل 3 ، الأزرق) ، بما يتفق مع الدراسات الأكثر تفصيلا على المستوى السائب19. هذا ملحوظ بشكل خاص لأن تضمين تسلسل الترميز ل mCherry-tnpB يزيد من طول الترانسبوزون بمقدار ~ 2000 bp ، بينما وجدت الدراسات السابقة أن استئصال IS608 transposon هو دالة متناقصة بشكل كبير لطول transposon23.

تتمثل ميزة التصوير في الوقت الفعلي في أنه بمجرد تحديدها ، يمكن تتبع الخلايا التي تمر بأحداث تبديل موضعية وتحليلها لتحديد المعلمات المميزة الأخرى ، مثل معدل النمو ، لتحديد توزيع تأثيرات اللياقة البدنية أو مستوى التعبير عن البروتينات الملحقة لتحديد تأثيرها على نشاط النقل. على سبيل المثال ، في خلايا TnpB + ، تحتوي الخلايا التي تخضع لأحداث استئصال الترانسبوزون على مستويات تعبير أعلى من mCherry-TnpB من عامة السكان (الشكل 4 أ). علاوة على ذلك ، بالنسبة للخلايا التي تخضع لأحداث الاستئصال (الشكل 4B ، الأصفر الداكن) ، فإن خلايا TnpB + (الشكل 4B ، أسفل) تعبر فقط عن مستويات أعلى بشكل هامشي من ترانسبوزاز Venus-TnpA من خلايا TnpB (الشكل 4B ، أعلى) (TnpB- 158.3 ± 68.2 AU ، TnpB +: 193 ± 79.9 AU) ، وهو أعلى من التألق الأصفر لعامة السكان (الشكل 4B ، أصفر فاتح). مجتمعة ، تشير هذه البيانات إلى أن بروتين TnpB مسؤول عن المستويات الأعلى المرصودة من نشاط النقل.

Figure 1
الشكل 1: التركيبات الجينية لتصوير ديناميكيات الترانسبوزون في الوقت الحقيقي. (أ) يتم تعطيل مروج mCerulean3 بواسطة TE ، وتحيط بنهاياته بتسلسلات متوازية خاطئة في الطرف الأيسر والطرف الأيمن (LE IP و RE IP). يتم التعبير عن الترانسبوزاز ، tnpA (رمادي) ، من PLtetO1 ، الذي ينظمه مثبط tet (رمادي) ويمكن تحريضه باستخدام anhydrotetracycline (aTc). يتم عرض تسلسلات تقاطع المروج / TE والمروج -10 و -35 (المربعات الحمراء) ، ومواقع الانقسام TnpA بواسطة الأسهم. (ب) بناء TnpB + هو المكان الذي تم فيه دمج mCherry-tnpB نسخيا مع الزهرة-tnpA بحيث يتم نسخ كلاهما على شكل mRNA متعدد الحمضيات ، مما يحاكي التكوين الطبيعي ل IS608. (ج) عند الاستئصال ، يتم إصلاح محفز mCerulean3 ، وتظهر الخلية مضانا أزرق. يتم عرض تسلسل المروج المعاد تشكيله أسفل الرسم التخطيطي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تصور أحداث استئصال الترانسبوزون. مجال رؤية المثال ل TnpB + مع الخلايا (A) مباشرة قبل و (B) بعد اكتشاف أحداث استئصال transposon بواسطة مضان أزرق. تشير الأسهم البيضاء إلى أحداث الختان. الفارق الزمني بين الإطارين هو 20 دقيقة. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: TnpB يعزز معدل استئصال الترانسبوزون. معدل الاستئصال لخلايا TnpB + (برتقالي) وخلايا TnpB- (زرقاء). يظهر متوسط المعدل من ثلاث نسخ متماثلة كنقاط ذات مناطق مظللة بفاصل ثقة 95٪. تتم محاذاة البيانات بحيث تبدأ الخلايا في الاستئصال عند t = 0. كان الحد الأقصى للمعدل المقاس لخلايا TnpB + هو 5.1 ± 2.4 × 10-2 حدث لكل خلية في الساعة ، بينما كان TnpB- 1.4 ± 0.48 × 10-2 حدثا لكل خلية في الساعة. كان متوسط المعدل خلال الفترة الزمنية الكاملة الموضحة 2.6 ± 1.8 × 10-2 حدثا لكل خلية في الساعة لخلايا TnpB + و 5.3 ± 2.9 × 10-3 أحداث لكل خلية في الساعة لخلايا TnpB. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: إحصائيات التعبير البروتيني للخلايا المستصلة مقابل إجمالي عدد الخلايا. تم تقسيم كل إطار إلى 64 كتلة متساوية ، وتم قياس التألق للخلايا التي يتم استئصالها داخل الكتلة ولجميع الخلايا الموجودة داخل الكتلة بغض النظر عن نشاط الاستئصال. يتم قياس الاحتمال ، كما هو موضح على المحور ص ، على أنه عدد وحدات البكسل من الكثافة المشار إليها في كل نوع خلية مقسوما على إجمالي عدد وحدات البكسل. تم ضبط حجم الكتلة لكل إطار على 445 × 445 بكسل. (أ) تعبر الخلايا التي تخضع لأحداث الاستئصال (الأحمر الداكن) عن TnpB أكثر من عامة السكان (أحمر فاتح). كان متوسط التألق الأحمر لاستئصال الخلايا 51.3 ± 15.4 AU (أحمر غامق) ، بينما كان ذلك لجميع الخلايا 42.5 ± 7.4 AU (أحمر فاتح). (ب) تتشابه مستويات ترانسبوزاز الزهرة-TnpA في خلايا TnpB- (أعلى) و TnpB + (أسفل). يتم تسوية مجموعات البيانات بحيث يكون متوسط التألق الأصفر لإجمالي عدد الخلايا (أصفر فاتح) متساويا ل TnpB +/- عند 105.7 AU. تظهر الخلايا التي تم تحديدها على أنها تخضع لأحداث استئصال الترانسبوزون (الأصفر الداكن) مضان أصفر أعلى من عامة السكان ، مع توزيعات مماثلة ل TnpB- (أعلى) و TnpB + (أسفل). متوسط التألق الأصفر للمجموعات المستقطعة هو TnpB-: 158.3 ± 68.2 AU و TnpB +: 193 ± 79.9 AU. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفيلم التكميلي 1: ديناميكيات الوقت الحقيقي لاستئصال IS608 مع تعبير TnpB. فيلم يعرض مقطع 5 ساعات من ديناميكيات IS608 في الوقت الفعلي ؛ يتم التقاط إطار كل 20 دقيقة. يتم تصور استئصال IS608 على أنه تطور مضان أزرق ساطع. تتضمن الخلايا الموضحة في هذا الفيلم تعبير TnpB. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيلم التكميلي 2: ديناميكيات الوقت الحقيقي لاستئصال IS608 بدون تعبير TnpB. فيلم يعرض مقطع 5 ساعات من ديناميكيات IS608 في الوقت الفعلي ؛ يتم التقاط إطار كل 20 دقيقة. يتم تصور استئصال IS608 على أنه تطور مضان أزرق ساطع. لا تتضمن الخلايا المعروضة في هذا الفيلم تعبير TnpB. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة الفريدة المقدمة هنا للتصوير في الوقت الفعلي لنشاط العناصر القابلة للنقل في الخلايا الحية هي اختبار حساس يمكنه اكتشاف التحويل مباشرة في الخلايا الحية وفي الوقت الفعلي وربط هذا النشاط بالتعبير عن البروتينات الملحقة. في حين أن الإنتاجية أقل مما يمكن تحقيقه بالطرق السائبة ، فإن هذه الطريقة تحقق قياسات مفصلة لنشاط TE وتعبير البروتين في الخلايا الحية الفردية.

يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الأدوات والتقنيات لتنمية الخلايا مباشرة على المجهر للتصوير في الوقت الفعلي. تتميز الطريقة المستخدمة هنا لنمو الخلايا على منصات الأغاروز بكونها سريعة ورخيصة وسهلة الأداء. العيب المحتمل ، اعتمادا على حالة النمو الخلوي المثيرة للاهتمام ، هو أن الموارد المتاحة لدعم نمو الخلايا في وسادة الأغاروز محدودة ، وبالتالي فإن الخلايا ستستنفد هذه الموارد بشكل طبيعي وتتوقف عن النمو بعد فترة زمنية قصيرة نسبيا (12-24 ساعة). وبالتالي ، يجب توخي الحذر لإعداد الخلايا في حالة نمو ثابت وتلقيح الوسادة بكثافة منخفضة بما يكفي لإعطاء متسع من الوقت للقياس. يمكن استخدام الموائع الدقيقة للحفاظ على الخلايا في حالة نمو أسي ثابت لفترات طويلة من الزمن24 ، على الرغم من أن هذه الطرق تتطلب خبرة ومعدات وإعداد إضافي لتكون فعالة.

استكمالا للعمل الأكثر تفصيلا من مختبر Kuhlman19 ، يتضح هنا أن البروتين المرتبط بعائلة IS200 / IS605 TE TnpB يزيد من معدل استئصال IS608 بما يصل إلى خمسة أضعاف ، وأن الاستئصال المتزايد يرتبط ارتباطا مباشرا بمستويات التعبير الأعلى من TnpB. هذه الطرق هي أحد الأمثلة على تقنيات الفحص المحسنة التي قد تساعد في إلقاء الضوء على نشاط الترانسبوزون وتأثيره على ديناميكيات الطفرات والتطورية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم توفير الدعم المالي لهذا البحث من خلال صناديق بدء التشغيل من جامعة كاليفورنيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 Ton Clear Epoxy Devcon 31345
Agarose Sigma-Aldrich 5066
Ammonium sulfate Sigma-Aldrich AX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919
Argon Laser Melles Griot 35-IMA-840-015
Blue Filter Cube Chroma Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)Glucose Sigma-Aldrich G7021
Eclipse Ti-E Microscope Nikon Discontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) Eppendorf North America Biotools 22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) Eppendorf North America Biotools 22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 g Fisher Scientific 706834
Fiji Fiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) Fisher Scientific BP9723-2 
Glass Cover Slide Fisher Scientific 12-542B 
Kanamycin Sulfate Sigma-Aldrich 1355006
Magnesium sulfate Cert Ac Fisher Scientific XXM63SP3KG
Microscope Heater World Precision Instruments 96810-1
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific 17001H
ProScan III Stage Prior
Red Filter Cube Chroma Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP Laser Coherent 1170412
Slide, Microscope Fisher Scientific 125535B
Thiamine Hydrochloride Sigma-Aldrich (SIAL) T1270-100G
Ti-LU4 Laser Launch Nikon
Yellow Filter Cube Chroma Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
  2. Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
  3. Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
  4. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
  5. Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
  6. Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
  7. Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11 (2014).
  8. Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
  9. Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
  10. Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
  11. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
  12. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  13. Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
  14. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  15. Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
  16. Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
  17. Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
  18. Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
  19. Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
  20. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
  24. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).

Tags

علم الأحياء، العدد 191،
القياس الكمي في الوقت الحقيقي لتأثيرات TnpB المرتبط بعائلة IS200 / IS605 على نشاط Transposon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Worcester, M., Manoj, F., Kuhlman,… More

Worcester, M., Manoj, F., Kuhlman, T. E. Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity. J. Vis. Exp. (191), e64825, doi:10.3791/64825 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter