تم تحديد بروتوكول لإجراء تصوير مباشر في الوقت الفعلي لتحديد كيفية تأثير البروتين الملحق TnpB على ديناميكيات التحويل في خلايا الإشريكية القولونية الحية الفردية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
القياس الكمي في الوقت الحقيقي لتأثيرات TnpB المرتبط بعائلة IS200 / IS605 على نشاط Transposon
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هنا ، تم تحديد بروتوكول لإجراء تصوير مباشر في الوقت الفعلي لنشاط العناصر القابلة للنقل في الخلايا البكتيرية الحية باستخدام مجموعة من مراسلي الفلورسنت المقترنة بالنقل. على وجه الخصوص ، يوضح كيف يمكن استخدام التصوير في الوقت الفعلي لتقييم آثار البروتين الملحق TnpB على نشاط العنصر القابل للنقل IS608 ، وهو عضو في عائلة IS200 / IS605 من العناصر القابلة للنقل. عائلة IS200 / IS605 من العناصر القابلة للنقل هي عناصر متحركة وفيرة متصلة بأحد أكثر الجينات التي لا تعد ولا تحصى الموجودة في الطبيعة ، tnpB. تقترح تماثلات التسلسل أن بروتين TnpB قد يكون مقدمة تطورية لأنظمة CRISPR / Cas9. بالإضافة إلى ذلك ، تلقى TnpB اهتماما متجددا ، بعد أن ثبت أنه يعمل كنوكلياز داخلي للحمض النووي الريبي يشبه Cas. تم تحديد تأثيرات TnpB على معدلات تبديل IS608 ، وثبت أن تعبير TnpB ل IS608 يؤدي إلى ~ 5x زيادة نشاط الترانسبوزون مقارنة بالخلايا التي تفتقر إلى تعبير TnpB.
المقدمة
العناصر القابلة للنقل (TEs) هي عناصر وراثية تحشد داخل جينومها المضيف عن طريق الاستئصال أو تحفيز النسخ متبوعا بإعادة الاندماج الجينومي. توجد TEs في جميع مجالات الحياة ، ويعيد التحويل هيكلة الجينوم المضيف ، ويحور مناطق الترميز والتحكم1. هذا يولد الطفرات والتنوع التي تلعب دورا مهما في التطور2،3 ، والتنمية4،5 ، والعديد من الأمراض البشرية6 ، بما في ذلك السرطان7.
باستخدام التركيبات الجينية الجديدة التي تربط جوانب نشاط النقل بمراسلي الفلورسنت ، وصف عملنا السابق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الثقافات البكتيرية
- تنمو سلالة الإشريكية القولونية MG1655 مع تركيبات ترانسبوزون البلازميد (الموصوفة سابقا في Kim et al.8) طوال الليل في LB مع المضادات الحيوية المناسبة (25 ميكروغرام / مل من الكانامايسين ، انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تتوفر تسلسلات التركيبات المستخدمة والتسلسلات ذات الصلة كأرقام انضمام GenBank20 OP581959 و OP581957 و OP581958 و OP717084 و OP717085. - لتحقيق نمو أسي ثابت ، قم بتخفيف الثقافات ≥100 مرة في وسط M63 (100 mM KH 2 PO 4 ، 1 mM MgSO 4 ، 1.8 μM FeSO 4 ، 15 mM [NH 4]2SO<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذه الطريقة لتصور نشاط الترانسبوزون في الخلايا الحية بواسطة الفحص المجهري الفلوري ، مع وجود إنتاجية أقل من قياسات التألق السائبة ، تسمح بالتصور المباشر لنشاط الترانسبوزون في الخلايا الحية الفردية. تؤدي أحداث استئصال الترانسبوزون إلى إعادة تكوين المروج ل mCerulean3 (الشكل 1) ، مما يسمح بتحديد الخلايا التي تخضع لنشاط Transposon عن طريق مضان أزرق ساطع (الشكل 2 ، TnpB +: الفيلم التكميلي 1 و TnpB-: الفيلم التكميلي 2).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة الفريدة المقدمة هنا للتصوير في الوقت الفعلي لنشاط العناصر القابلة للنقل في الخلايا الحية هي اختبار حساس يمكنه اكتشاف التحويل مباشرة في الخلايا الحية وفي الوقت الفعلي وربط هذا النشاط بالتعبير عن البروتينات الملحقة. في حين أن الإنتاجية أقل مما يمكن تحقيقه بالطرق السائبة ، فإن هذه الطريقة تحقق قياسات مفصلة لنشاط TE وتعبير البروتين في الخلايا الحية الفردية.
يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الأدوات والتقنيات لتنمية الخلايا مباشرة على المجهر للتصوير في الوقت الفعلي. تتميز الطريقة المستخدمة هنا .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم توفير الدعم المالي لهذا البحث من خلال صناديق بدء التشغيل من جامعة كاليفورنيا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2 طن واضح الايبوكسي | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| كبريتات الأمونيوم | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline هيدروكلوريد | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| ليزر الأرجون | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| مكعب مرشح أزرق | كروما | على سبيل المثال: Z457 / 10X ، Em: ET485 / 30M | |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | توقف | |
| صناديق Eppendorf epTIPS وصواني إعادة التعبئة ، الحجم: 0.1 إلى 10 & micro ؛ L ، الطول: 3.4 سم ، 1.33 بوصة ، PP (بولي بروبيلين) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes وصواني إعادة التعبئة ، الحجم: 50 إلى 1000 ميكرو ؛ L ، الطول: 7.1 سم ، 2.79 بوصة ، PP (بولي بروبلين) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| كبريتات الحديدوز Acs 500 جم | فيشر Scientific | 706834 | |
| فيجي | فيجي (imagej.net) | ||
| Fisher BioRecodes LB Broth ، Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| غطاء زجاجي شريحة | فيشر Scientific | 12-542B | |
| كبريتات كاناميسين | سيجما ألدريتش | 1355006 | |
| كبريتات المغنيسيوم شهادة AC | فيشر سخان المجهر XXM63SP3KG | ||
| العلمي World Precision Instruments | 96810-1 | ||
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | فيشر Scientific | 17001H | |
| ProScan III المرحلة | السابقة | ||
| مكعب مرشح أحمر | Chroma | Ex: ET560 / 40X ، Em: ET645 / 75M | |
| Sapphire 561 LP شريحة 1170412 | متماسكة | ||
| ليزر ، مجهر | فيشر Scientific | 125535B | |
| الثيامين هيدروكلوريد | سيجما ألدريتش (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 إطلاق ليزر | نيكون | ||
| مكعب مرشح أصفر | كروما | على سبيل المثال: Z514 / 10X ، Em: ET535 / 30M |
المراجع
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Micro....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
