Summary
En protokol er skitseret til at udføre live realtidsbilleddannelse for at kvantificere, hvordan tilbehørsproteinet TnpB påvirker transponeringsdynamikken i individuelle levende Escherichia coli-celler .
Abstract
Her skitseres en protokol til at udføre live, realtidsbilleddannelse af transponerbar elementaktivitet i levende bakterieceller ved hjælp af en række fluorescerende reportere koblet til transponering. Det viser især, hvordan realtidsbilleddannelse kan bruges til at vurdere virkningerne af tilbehørsproteinet TnpB på aktiviteten af det transponerbare element IS608, et medlem af IS200/IS605-familien af transponerbare elementer. IS200/IS605-familien af transponerbare elementer er rigelige mobile elementer forbundet med et af de mest utallige gener, der findes i naturen, tnpB. Sekvenshomologier foreslår, at TnpB-proteinet kan være en evolutionær forløber for CRISPR/Cas9-systemer. Derudover har TnpB modtaget fornyet interesse, idet det har vist sig at fungere som en Cas-lignende RNA-guidet DNA-endonuklease. TnpB's virkninger på transponeringshastighederne for IS608 kvantificeres, og det påvises, at ekspressionen af TnpB af IS608 resulterer i ~5x øget transponaktivitet sammenlignet med celler, der mangler TnpB-ekspression.
Introduction
Transponerbare elementer (TE'er) er genetiske elementer, der mobiliserer inden for deres værtsgenomer ved udskæring eller katalysering af kopiering efterfulgt af genomisk reintegration. Der findes TE'er på alle livets områder, og transponering omstrukturerer værtsgenomet og muterer kodnings- og kontrolregioner1. Dette genererer mutationer og mangfoldighed, der spiller en vigtig rolle i evolution2,3, udvikling4,5 og flere menneskelige sygdomme6, herunder kræft7.
Ved hjælp af nye genetiske konstruktioner, der kobler aspekter af transponeringsaktivitet til fluorescerende journalister, beskrev vores tidligere arbejde udviklingen af et eksperimentelt system baseret på den bakterielle TE IS608, en repræsentant for den udbredte IS200/IS605-familie af TE'er, der giver mulighed for realtidsvisualisering af transponering i individuelle levende celler8 (figur 1). TE-systemet vises i figur 1A. TE omfatter transposasekodningssekvensen, tnpA, flankeret af venstre ende (LE) og højre ende (RE) ufuldkomne palindromiske gentagelser (IP'er), som er genkendelses- og excisionsstederne for TnpA. tnpA udtrykkes ved hjælp af promotoren PLTetO1, som undertrykkes af tet-repressoren og kan induceres med anhydrotetracyclin (aTc)9. TE opdeler sekvenserne -10 og -35 af en konstituerende PlacIQ1 promotor10 for den blå reporter mCerulean311. Som vist i figur 1C kan TE, når produktionen af tnpA induceres, udskæres, hvilket fører til rekonstitution af promotoren. Den producerede celle udtrykker mCerulean3 og fluorescerer blå. N-terminalen af TnpA er smeltet sammen med den gule reporter Venus12, hvilket gør det muligt at måle TnpA-niveauerne ved gul fluorescens.
IS608 og andre medlemmer af IS200/IS605-familien af transposoner koder også typisk for et andet gen af den hidtil ukendte funktion, tnpB13. TnpB-proteinerne er en enormt rigelig, men ufuldkommen karakteriseret familie af nukleaser kodet af flere bakterielle og arkæaleTEs 14,15, som ofte kun består af tnpB16. Desuden har nylige undersøgelser fornyet interesse for TnpB ved at finde ud af, at TnpB fungerer som en CRISPR / Cas-lignende programmerbar RNA-guidet endonuklease, der vil give enten dsDNA eller ssDNA pauser under forskellige forhold17,18. Det er imidlertid fortsat uklart, hvilken rolle TnpB kan spille i reguleringen af gennemførelsen. For at udføre realtidsvisualisering af virkningerne af TnpB på IS608-transponering blev der oprettet en version af transposonen, herunder kodningsområdet for TnpB med en N-terminal fusion til det røde fluorescerende protein mCherry.
Som supplement til mere detaljerede undersøgelser på bulkniveau udført af Kuhlman-laboratoriet19 vises det her, hvordan realtidsbilleddannelse af transponaktivitet kvantitativt kan afsløre virkningen af TnpB eller andre tilbehørsproteiner på transponeringsdynamik. Ved at fusionere TnpB til mCherry identificeres de enkelte transponeringshændelser ved blå fluorescens og korreleres med ekspressionsniveauer af TnpA (gul fluorescens) og TnpB (rød fluorescens).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af bakteriekulturer
- E. coli-stamme MG1655 vokser med plasmidtransposonkonstruktioner (tidligere beskrevet i Kim et al.8) natten over i LB med de relevante antibiotika (25 μg/ml kanamycin, se materialetabel) ved 37 °C.
BEMÆRK: Sekvenserne af de anvendte konstruktioner og de relaterede sekvenser er tilgængelige som GenBank20-tiltrædelsesnumre OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 og OP717085. - For at opnå steady-state eksponentiel vækst ≥100 fortyndede kulturer foldet ind i M63-mediet (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0,5 μg / ml thiamin [vitamin B1]) suppleret med en kulstofkilde (0,5% w / v glucose her) og passende antibiotika (se materialetabel).
- Dyrkning af kulturer ved 37 °C indtil den optiske massefylde ved 600 nm (OD600) når ~0,2. Kulturerne er klar til brug.
2. Forberedelse af dias
- Forbered et dias ved at koge M63 med 0,5% w / v glucose og 1,5% w / v agarose i mikrobølgeovnen for at smelte agarosen og sikre, at den er helt smeltet og godt blandet.
- Blandingen afkøles til ~55 °C, før der tilsættes antibiotika og induktorer (25 μg/ml Kanamycin og 10 ng/μL anhydrotetracyclin [aTc], se Materialetabel).
- Placer et mikroskopglas på arbejdsbordet. Stak yderligere to dias vinkelret på den første, og placer en anden ovenpå parallelt med det nederste dias. Sørg for, at der er et mellemrum svarende til en diastykkelse mellem de nederste og øverste dias. Pipette ~ 1 ml af M63 agaroseblandingen langsomt ind i dette mellemrum mellem diasene for at skabe en lille gelfirkant.
- Når gelen er størknet (~ 10-15 min), skal du skubbe det øverste dias for at fjerne det. Trim agarosepuden med et barberblad eller en kniv. Derefter pipetteres 2,5 μL af kulturen (trin 1.3) og læg dækslippet ovenpå.
- Forsegl mellemrummet mellem glideren og dækslippet med epoxy (se Materialetabel). Epoxyen tørres, og cellerne sætter sig på agarosepuden i mindst 1 time ved 37 °C.
3. Timelapse fluorescensmikroskopi
- Den tilberedte prøve (trin 1.3) anbringes på et fluorescensmikroskop (se Materialetabel) i et miljø, der opvarmes og holdes ved 37 °C.
- Indstil de eksponeringstider, der passer til det kamera, der bruges til billedoptagelse. Juster belysningsintensiteten for at minimere fotoblegning.
BEMÆRK: En eksponeringstid på 2 s for hver bølgelængde blev brugt til denne undersøgelse. - For hver bølgelængde skal du finde et synsfelt (FOV), der indeholder minimal fluorescens. Anskaf billeder til brug under analysen til baggrundssubtraktion.
- Indstil de eksponeringstider, der passer til det kamera, der bruges til billedoptagelse. Juster belysningsintensiteten for at minimere fotoblegning.
- Opret en protokol til at hente billeder i et gitter ved forskellige bølgelængder og med regelmæssige tidsintervaller.
- Indkode timelapse-fotografering i protokollen. Indstil anskaffelsesfrekvensen til det ønskede tidsinterval (20 min her) og den samlede timelapse-varighed til den ønskede længde (24 timer).
- Kod passende bølgelængder ind i protokollen (afhængigt af den anvendte konstruktion).
BEMÆRK: MCherry excitationstoppen er ved 587 nm og emissionstoppen ved 610 nm21; mVenus er på 515 nm og 527 nm12, mens mCerulean3 er på 433 nm og 475 nm11. - Indstil gitterstørrelsen til at fange mellem det ønskede antal FOV'er.
BEMÆRK: De repræsentative data, der vises her, brugte 8 x 8 FOV'er.
4. Billedanalyse
- Udfør baggrundssubtraktion på hver farvekanal ved hjælp af de respektive baggrundsbilleder, der er erhvervet i trin 3.1.2. Til alle analysetrinnene bruger vi standardmoduler i open source-platformen Fiji22 (se Materialefortegnelse).
- Tilnærm den samlede befolkning på hvert tidspunkt ved at tærskel mCerulean-kanalen og dividere tærskelområdet med det gennemsnitlige celleområde.
- For at tælle de unikke excisionshændelser skal du tage tiden afledt af mCerulean3-kanalen. Udfør dette ved at trække successive billeder i mCerulean3-kanalen. Excisionshændelserne vil blive detekteret i tidsderivatet som et lyst glimt af fluorescens.
- Tærskel stakken af excision begivenheder for at eliminere uønsket fluorescens. Bemærk, at denne proces vil begrænse dele af selve udskæringerne. For at løse dette skal du udvide billederne for at gendanne excisionerne til deres oprindelige størrelser.
BEMÆRK: Analyser ved hjælp af lignende tærskel- og billedanalyseteknikker kan også udføres på de andre fluorescenskanaler (f.eks. korrelere excisionshændelser med niveauer af transposase TnpA [gul Venusfluorescens] og TnpB [rød mCherry fluorescens].
- Tærskel stakken af excision begivenheder for at eliminere uønsket fluorescens. Bemærk, at denne proces vil begrænse dele af selve udskæringerne. For at løse dette skal du udvide billederne for at gendanne excisionerne til deres oprindelige størrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode til visualisering af transposonaktivitet i levende celler ved fluorescensmikroskopi, mens den har lavere gennemstrømning end bulkfluorescensmålinger, muliggør direkte visualisering af transposonaktivitet i individuelle levende celler. Transposon excision events resulterer i rekonstitution af promotoren for mCerulean3 (figur 1), hvilket gør det muligt at identificere celler, der gennemgår transponaktivitet ved lyseblå fluorescens (figur 2, TnpB+: Supplerende film 1 og TnpB-: Supplerende film 2).
Det konstateres, at celler, der udtrykker tilbehørsproteinet TnpB (figur 3, orange), oplever 4-5 gange højere niveauer af transponaktivitet sammenlignet med dem, der ikke gør det (figur 3, blå), i overensstemmelse med de mere detaljerede undersøgelser på bulkniveau19. Dette er især bemærkelsesværdigt, da inkluderingen af kodningssekvensen af mCherry-tnpB øger længden af transposon med ~ 2.000 bp, mens tidligere undersøgelser har fundet ud af, at IS608 transposon excision er en eksponentielt faldende funktion af transposon længde23.
En fordel ved realtidsbilleddannelse er, at når de er identificeret, kan celler, der gennemgår transponeringshændelser, spores og analyseres yderligere for at bestemme andre karakteristiske parametre, såsom væksthastighed, for at bestemme fordelingen af fitnesseffekter eller ekspressionsniveauet for tilbehørsproteiner for at bestemme deres indvirkning på transponeringsaktivitet. I TnpB+-celler har celler, der gennemgår transponeringsexcisionshændelser, f.eks. højere ekspressionsniveauer af mCherry-TnpB end den generelle population (figur 4A). For celler, der gennemgår excisionshændelser (figur 4B, mørkegul), udtrykker TnpB+ celler (figur 4B, nederst) desuden kun marginalt højere niveauer af Venus-TnpA-transposase end TnpB-celler (figur 4B, øverst) (TnpB- 158,3 ± 68,2 AU, TnpB+: 193 ± 79,9 AU), hvilket er højere end den gule fluorescens i den generelle befolkning (figur 4B , lysegul). Samlet set tyder disse data på, at TnpB-protein er ansvarlig for de observerede højere niveauer af transponeringsaktivitet.
Figur 1: Genetiske konstruktioner til billeddannelse af transponeringsdynamik i realtid. (A) mCerulean3-promotoren forstyrres af TE, hvis ender flankeres af venstre ende og højre ende defekte palindromiske sekvenser (LE IP og RE IP). Transposasen, tnpA (grå), udtrykkes fra PLtetO1, som reguleres af tetrepressoren (grå) og kan induceres med anhydrotetracyclin (aTc). Sekvenserne af Promoter/TE-krydset og promotor--10- og -35-sekvenserne (røde bokse) og TnpA-spaltningsstederne vises med pile. (B) TnpB+-konstruktionen er, hvor mCherry-tnpB er blevet transkriptionelt smeltet sammen med venus-tnpA, således at begge transskriberes som et polycistronisk mRNA, der efterligner den naturlige konfiguration af IS608. (C) Ved udskæring repareres mCerulean3-promotoren, og cellen udviser blå fluorescens. Den rekonstituerede promotorsekvens vises under diagrammet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Visualisering af transponeringsexcisionshændelser. Eksemplets synsfelt for TnpB+ med celler (A) umiddelbart før og (B) efter påvisning af transponudskæringshændelser ved blå fluorescens. Hvide pile angiver excision begivenheder. Tidsforskellen mellem de to rammer er 20 min. Skala bar = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: TnpB forbedrer transponeringsexcisionshastigheden. Udskæringshastigheden for TnpB+ celler (orange) og TnpB- (blå) celler. Gennemsnitshastigheden fra tre replikater vises som punkter med skraverede områder med et 95 % konfidensinterval. Dataene justeres, så celler begynder at excisere ved t = 0. Den maksimale målte hastighed for TnpB + celler var 5,1 ± 2,4 x 10-2 hændelser pr. celle i timen, mens den for TnpB- var 1,4 ± 0,48 x 10-2 hændelser pr. celle pr. time. Den gennemsnitlige hastighed over hele det viste interval var 2,6 ± 1,8 x 10-2 hændelser pr. celle pr. time for TnpB+ celler og 5,3 ± 2,9 x 10-3 hændelser pr. celle pr. time for TnpB-celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Proteinekspressionsstatistik for excising celler versus total cellepopulation. Hver ramme blev opdelt i 64 lige store blokke, og fluorescens blev målt for celler, der udgik inden for blokken og for alle celler indeholdt i blokken uanset excisionsaktiviteten. Sandsynlighed, som afbildet på y-aksen, måles som antallet af pixels med den angivne intensitet i hver celletype divideret med det samlede antal pixels. Blokstørrelsen for hver ramme blev indstillet til 445 x 445 pixels. (A) De celler, der gennemgår excisionshændelser (mørkerød), udtrykker mere TnpB end den generelle population (lys rød). Den gennemsnitlige røde fluorescens for excising celler var 51,3 ± 15,4 AU (mørkerød), mens den for alle celler var 42,5 ± 7,4 AU (lys rød). (B) Venus-TnpA-transposaseniveauer er ens i TnpB- (øverst) og TnpB + (nederst) celler. Datasættene normaliseres, så de gennemsnitlige gule fluorescenser af den samlede cellepopulation (lysegul) er ens for TnpB+/- ved 105,7 AU. De celler, der er blevet identificeret som undergår transponudskæringshændelser (mørkegul), udviser højere gul fluorescens end den generelle befolkning med lignende fordelinger for TnpB- (øverst) og TnpB + (nederst). Gennemsnitlige gule fluorescenser af excising populationer er TnpB-: 158,3 ± 68,2 AU og TnpB+: 193 ± 79,9 AU. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende film 1: Real-time dynamik af IS608 excision med TnpB udtryk. En film, der viser et 5 timers segment af real-time IS608 dynamik; en ramme fanges hvert 20. minut. IS608 excision visualiseres som udviklingen af lyseblå fluorescens. Cellerne vist i denne film inkluderer udtrykket TnpB. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende film 2: Real-time dynamik af IS608 excision uden TnpB udtryk. En film, der viser et 5 timers segment af real-time IS608 dynamik; en ramme fanges hvert 20. minut. IS608 excision visualiseres som udviklingen af lyseblå fluorescens. Cellerne, der vises i denne film, indeholder ikke udtrykket TnpB. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den unikke metode, der præsenteres her til realtidsbilleddannelse af transponerbar elementaktivitet i levende celler, er et følsomt assay, der direkte kan detektere transponering i levende celler og i realtid og korrelere denne aktivitet med ekspression af tilbehørsproteiner. Mens gennemstrømningen er lavere, end der kan opnås ved bulkmetoder, opnår denne metode detaljerede målinger af TE-aktivitet og proteinekspression i individuelle levende celler.
En række værktøjer og teknikker kan anvendes til at dyrke celler direkte på mikroskopet til realtidsbilleddannelse. Den metode, der anvendes her af cellevækst på agarosepuder, har den fordel, at den er hurtig, billig og nem at udføre. En mulig ulempe, afhængigt af den cellulære væksttilstand af interesse, er, at ressourcer, der er tilgængelige til støtte for cellevækst i agarosepuden, er begrænsede, og derfor vil celler naturligt udtømme disse ressourcer og stoppe med at vokse efter en relativt kort periode (12-24 timer). Derfor skal man sørge for at forberede cellerne i steady state-vækst og pode puden med en lav nok densitet til at give rigelig tid til måling. Mikrofluidik kan anvendes til at opretholde celler i steady state eksponentiel vækst i længere perioder24, selvom disse metoder kræver yderligere ekspertise, udstyr og opsætning for at være effektive.
Som supplement til mere detaljeret arbejde fra Kuhlman-laboratoriet19 illustreres det her, at IS200/IS605 TE-familierelateret protein TnpB øger hastigheden af IS608-excision med op til det femdobbelte, og at øget excision er direkte korreleret med højere ekspressionsniveauer af TnpB. Disse metoder er et eksempel på forbedrede analyseteknikker, der kan hjælpe med at kaste lys over transponaktivitet og dens indvirkning på mutations- og evolutionær dynamik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Økonomisk støtte til denne forskning blev ydet af opstartsmidler fra University of California.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
- Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
- Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
- Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
- Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11 (2014).
- Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
- Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
- Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
- Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
- Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
- Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
- Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
- Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
- Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
- Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
- Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).
