Summary
Un protocole est décrit pour effectuer une imagerie en temps réel en direct afin de quantifier comment la protéine accessoire TnpB affecte la dynamique de transposition dans les cellules vivantes individuelles d’Escherichia coli .
Abstract
Ici, un protocole est décrit pour effectuer une imagerie en direct et en temps réel de l’activité des éléments transposables dans les cellules bactériennes vivantes à l’aide d’une suite de rapporteurs fluorescents couplés à la transposition. En particulier, il démontre comment l’imagerie en temps réel peut être utilisée pour évaluer les effets de la protéine accessoire TnpB sur l’activité de l’élément transposable IS608, membre de la famille des éléments transposables IS200/IS605. La famille IS200/IS605 d’éléments transposables sont des éléments mobiles abondants liés à l’un des gènes les plus innombrables trouvés dans la nature, tnpB. Les homologies de séquence suggèrent que la protéine TnpB pourrait être un précurseur évolutif des systèmes CRISPR/Cas9. De plus, le TnpB a suscité un regain d’intérêt, ayant été montré comme une endonucléase d’ADN guidée par l’ARN de type Cas. Les effets de TnpB sur les taux de transposition de l’IS608 sont quantifiés, et il est démontré que l’expression de TnpB de l’IS608 entraîne une augmentation ~5x de l’activité du transposon par rapport aux cellules dépourvues d’expression de TnpB.
Introduction
Les éléments transposables (ET) sont des éléments génétiques qui se mobilisent au sein de leur génome hôte par excision ou catalysent la copie suivie d’une réintégration génomique. Les ET existent dans tous les domaines de la vie, et la transposition restructure le génome de l’hôte, mutant les régions codantes et de contrôle1. Cela génère des mutations et une diversité qui jouent un rôle important dans l’évolution2,3, le développement 4,5, et plusieurs maladies humaines6, dont le cancer7.
En utilisant de nouvelles constructions génétiques qui couplent des aspects de l’activité de transposition à des rapporteurs fluorescents, nos travaux antérieurs ont décrit le développement d’un système expérimental basé sur la bactérie TE IS608, un représentant de la famille répandue IS200/IS605 des TE, qui permet la visualisation en temps réel de la transposition dans les cellules vivantes individuelles8 (Figure 1). Le système TE est illustré à la figure 1A. Le TE comprend la séquence codante de la transposase, tnpA, flanquée de répétitions palindromiques imparfaites (IP) à l’extrémité gauche (LE) et à l’extrémité droite (RE), qui sont les sites de reconnaissance et d’excision de TnpA. Le tnpA est exprimé à l’aide du promoteur PLTetO1, qui est réprimé par le répresseur du têt et est inductible par l’anhydrotétracycline (aTc)9. Le TE divise les séquences -10 et -35 d’un promoteur constitutif PlacIQ1 10 pour le rapporteur bleu mCerulean311. Comme le montre la figure 1C, lorsque la production de tnpA est induite, le TE peut être excisé, conduisant à une reconstitution du promoteur. La cellule produite exprime mCerulean3 et devient bleue. L’extrémité N de TnpA est fusionnée avec le rapporteur jaune Vénus12, permettant de mesurer les niveaux de TnpA par fluorescence jaune.
IS608 et d’autres membres de la famille de transposons IS200/IS605 codent également généralement pour un deuxième gène de la fonction jusqu’ici inconnue, le tnpB13. Les protéines TnpB sont une famille de nucléases extrêmement abondantes mais imparfaitement caractérisées codées par plusieurs TEs14,15 bactériennes et archées, qui sont souvent constituées uniquement de tnpB16. De plus, des études récentes ont renouvelé l’intérêt pour le TnpB en constatant que le TnpB fonctionne comme une endonucléase programmable guidée par ARN de type CRISPR / Cas-like qui produira des cassures d’ADNds ou d’ADNss dans diverses conditions17,18. Cependant, on ne sait toujours pas quel rôle le TnpB peut jouer dans la régulation de la transposition. Pour effectuer une visualisation en temps réel des effets de TnpB sur la transposition IS608, une version du transposon, incluant la région codante de TnpB avec une fusion N-terminale à la protéine fluorescente rouge mCherry, a été créée.
En complément d’études plus détaillées au niveau du vrac réalisées par le laboratoire Kuhlman19, il est montré ici comment l’imagerie en temps réel de l’activité des transposons peut révéler quantitativement l’impact de TnpB ou de toute autre protéine accessoire sur la dynamique de transposition. En fusionnant TnpB en mCherry, les événements de transposition individuels sont identifiés par fluorescence bleue et corrélés avec les niveaux d’expression de TnpA (fluorescence jaune) et TnpB (fluorescence rouge).
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Protocol
1. Préparation de cultures bactériennes
- Cultiver la souche MG1655 d’E. coli avec des constructions de transposons plasmidiques (décrites précédemment dans Kim et coll.8) pendant une nuit dans LB avec les antibiotiques appropriés (25 μg/mL de kanamycine, voir le tableau des matériaux) à 37 °C.
REMARQUE : Les séquences des constructions utilisées et les séquences associées sont disponibles sous les numéros d’acquisition GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 et OP717085. - Pour obtenir une croissance exponentielle à l’état d’équilibre, diluer les cultures ≥100 fois dans le milieu M63 (100 mM KH2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0,5 μg/mL de thiamine [vitamine B1]) complétées par une source de carbone (0,5 % p/v de glucose ici) et des antibiotiques appropriés (voir Tableau des matériaux).
- Cultiver des cultures à 37 °C jusqu’à ce que la densité optique à 600 nm (OD600) atteigne ~0,2. Les cultures sont prêtes à l’emploi.
2. Préparation des diapositives
- Préparez une lame en faisant bouillir du M63 avec 0,5 % p/v de glucose et 1,5 % p/v d’agarose au micro-ondes pour faire fondre l’agarose et s’assurer qu’elle est complètement fondue et bien mélangée.
- Laisser refroidir le mélange à ~55 °C avant d’ajouter des antibiotiques et des inducteurs (25 μg/mL de kanamycine et 10 ng/μL d’anhydrotétracycline [aTc], voir le tableau des matières).
- Placez une lame de microscope sur l’établi. Empilez deux autres diapositives perpendiculaires à la première et placez-en une autre sur le dessus, parallèlement à la glissière inférieure. Assurez-vous qu’il y a un espace égal à une épaisseur de lame entre les diapositives inférieure et supérieure. Pipeter ~1 mL du mélange d’agarose M63 dans cet espace entre les lames lentement pour créer un petit carré de gel.
- Une fois que le gel s’est solidifié (~10-15 min), faites glisser la lame supérieure pour l’enlever. Coupez le tampon d’agarose avec une lame de rasoir ou un couteau. Ensuite, pipeter 2,5 μL de la culture (étape 1.3) et mettre la lamelle de couverture sur le dessus.
- Scellez l’espace entre la glissière et la lamelle de couverture avec de l’époxy (voir le tableau des matériaux). Laisser sécher l’époxy et déposer les cellules sur le tampon d’agarose pendant au moins 1 h à 37 °C.
3. Microscopie à fluorescence timelapse
- Placer l’échantillon préparé (étape 1.3) sur un microscope à fluorescence (voir le tableau des matériaux) dans un environnement chauffé et maintenu à 37 °C.
- Réglez les temps d’exposition appropriés pour l’appareil photo utilisé pour l’acquisition d’images. Ajustez l’intensité de l’éclairage pour minimiser le photoblanchiment.
REMARQUE : Un temps d’exposition de 2 s pour chaque longueur d’onde a été utilisé pour la présente étude. - Pour chaque longueur d’onde, trouvez un champ de vision (FOV) contenant une fluorescence minimale. Acquérir des images à utiliser pendant l’analyse pour la soustraction d’arrière-plan.
- Réglez les temps d’exposition appropriés pour l’appareil photo utilisé pour l’acquisition d’images. Ajustez l’intensité de l’éclairage pour minimiser le photoblanchiment.
- Configurez un protocole pour acquérir des images dans une grille à différentes longueurs d’onde et à intervalles de temps réguliers.
- Encodez la photographie timelapse dans le protocole. Réglez la fréquence d’acquisition sur l’intervalle de temps souhaité (20 min ici) et la durée totale du timelapse sur la durée souhaitée (24 h).
- Coder les longueurs d’onde appropriées dans le protocole (selon la construction utilisée).
NOTE: Le pic d’excitation mCherry est à 587 nm et le pic d’émission à 610 nm21; mVénus est à 515 nm et 527 nm12, tandis que mCerulean3 est à 433 nm et 475 nm11. - Définissez la taille de la grille à capturer entre le nombre souhaité de FOV.
REMARQUE: Les données représentatives présentées ici utilisaient des FOV de 8 x 8.
4. Analyse d’images
- Effectuez une soustraction d’arrière-plan sur chaque couche de couleur en utilisant les images d’arrière-plan respectives acquises à l’étape 3.1.2. Pour toutes les étapes d’analyse, nous utilisons des modules standard dans la plate-forme open-source Fiji22 (voir Tableau des matériaux).
- Approximez la population totale à chaque moment en seuillant le canal céruléen et en divisant la zone seuil par la surface cellulaire moyenne.
- Pour compter les événements d’excision uniques, prenez la dérivée temporelle du canal mCerulean3. Pour ce faire, soustrayez des images successives dans le canal mCerulean3. Les événements d’excision seront détectés dans la dérivée temporelle comme un éclair lumineux de fluorescence.
- Seuil de la pile d’événements d’excision pour éliminer la fluorescence indésirable. Notez que ce processus entraînera le seuil d’une partie des excisions elles-mêmes. Pour résoudre ce problème, dilatez les images pour restaurer les excisions à leur taille d’origine.
REMARQUE : Des analyses utilisant des techniques similaires de seuillage et d’analyse d’images peuvent également être effectuées sur les autres canaux de fluorescence (p. ex., corréler les événements d’excision avec les niveaux de transsase TnpA [fluorescence jaune de Vénus] et TnpB [fluorescence rouge mCherry].
- Seuil de la pile d’événements d’excision pour éliminer la fluorescence indésirable. Notez que ce processus entraînera le seuil d’une partie des excisions elles-mêmes. Pour résoudre ce problème, dilatez les images pour restaurer les excisions à leur taille d’origine.
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Representative Results
Cette méthode de visualisation de l’activité des transposons dans les cellules vivantes par microscopie à fluorescence, tout en ayant un débit inférieur à celui des mesures de fluorescence en vrac, permet une visualisation directe de l’activité des transposons dans les cellules vivantes individuelles. Les événements d’excision de transposons entraînent la reconstitution du promoteur de mCerulean3 (Figure 1), permettant l’identification des cellules subissant une activité de transposon par fluorescence bleu vif (Figure 2, TnpB+: Supplementary Movie 1 et TnpB-: Supplementary Movie 2).
On constate que les cellules exprimant la protéine accessoire TnpB (Figure 3, orange) présentent des niveaux d’activité transposonique 4 à 5 fois plus élevés que celles qui n’en ont pas (Figure 3, bleu), ce qui correspond aux études plus détaillées au niveau du volume19. Ceci est particulièrement remarquable car l’inclusion de la séquence codante de mCherry-tnpB augmente la longueur du transposon de ~2 000 pb, alors que des études antérieures ont montré que l’excision du transposon IS608 est une fonction décroissante exponentiellement décroissante de la longueur du transposon23.
Un avantage de l’imagerie en temps réel est qu’une fois identifiées, les cellules subissant des événements de transposition peuvent être suivies et analysées davantage pour déterminer d’autres paramètres caractéristiques, tels que le taux de croissance, pour déterminer la distribution des effets de fitness ou le niveau d’expression des protéines accessoires pour déterminer leur impact sur l’activité de transposition. Par exemple, dans les cellules TnpB+, les cellules subissant des événements d’excision de transposons ont des niveaux d’expression plus élevés de mCherry-TnpB que la population générale (Figure 4A). De plus, pour les cellules subissant des événements d’excision (Figure 4B, jaune foncé), les cellules TnpB+ (Figure 4B, en bas) n’expriment que des niveaux légèrement plus élevés de Vénus-TnpA transposase que de cellules TnpB- (Figure 4B, en haut) (TnpB- 158,3 ± 68,2 UA, TnpB+: 193 ± 79,9 UA), ce qui est supérieur à la fluorescence jaune de la population générale (Figure 4B jaune clair). Prises ensemble, ces données suggèrent que la protéine TnpB est responsable des niveaux plus élevés observés d’activité de transposition.
Figure 1 : Constructions génétiques pour l’imagerie de la dynamique des transposons en temps réel. (A) Le promoteur mCerulean3 est perturbé par le TE, dont les extrémités sont flanquées de séquences palindromiques défectueuses aux extrémités gauche et droite (LE IP et RE IP). La transposase, tnpA (grise), est exprimée à partir de PLtetO1, qui est régulée par le répresseur tet (gris) et est inductible par l’anhydrotétracycline (aTc). Les séquences de la jonction Promoteur/TE et des séquences -10 et -35 du promoteur (cases rouges) et les sites de clivage TnpA sont représentés par des flèches. (B) La construction TnpB+ est l’endroit où mCherry-tnpB a été fusionné transcriptionnellement à vénus-tnpA de sorte que les deux sont transcrits comme un ARNm polycistronique, imitant la configuration naturelle de IS608. (C) Lors de l’excision, le promoteur mCerulean3 est réparé et la cellule présente une fluorescence bleue. La séquence promotrice reconstituée est affichée sous le diagramme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Visualisation des événements d’excision de transposons. Exemple de champ de vision de TnpB+ avec des cellules (A) immédiatement avant et (B) après détection d’événements d’excision de transposons par fluorescence bleue. Les flèches blanches indiquent les événements d’excision. Le décalage horaire entre les deux images est de 20 min. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Le TnpB améliore le taux d’excision des transposons. Le taux d’excision pour les cellules TnpB+ (orange) et TnpB- (bleues). Le taux moyen de trois répétitions est représenté sous forme de points avec des régions ombragées avec un intervalle de confiance de 95%. Les données sont alignées de sorte que les cellules commencent à exciser à t = 0. Le taux maximal mesuré pour les cellules TnpB+ était de 5,1 ± 2,4 x 10-2 événements par cellule et par heure, tandis que pour TnpB- était de 1,4 ± 0,48 x 10-2 événements par cellule et par heure. Le taux moyen sur l’ensemble de l’intervalle indiqué était de 2,6 ± 1,8 x 10-2 événements par cellule et par heure pour les cellules TnpB+ et de 5,3 ± 2,9 x 10-3 événements par cellule et par heure pour les cellules TnpB-. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Statistiques d’expression protéique pour l’excision des cellules par rapport à la population cellulaire totale. Chaque image a été divisée en 64 blocs égaux, et la fluorescence a été mesurée pour les cellules excisant dans le bloc et pour toutes les cellules contenues dans le bloc, quelle que soit l’activité d’excision. La probabilité, telle qu’elle est tracée sur l’axe des y, est mesurée comme le nombre de pixels de l’intensité indiquée dans chaque type de cellule divisé par le nombre total de pixels. La taille de bloc de chaque image a été définie sur 445 x 445 pixels. (A) Les cellules qui subissent des événements d’excision (rouge foncé) expriment plus de TnpB que la population générale (rouge clair). La fluorescence rouge moyenne pour les cellules excisantes était de 51,3 ± 15,4 UA (rouge foncé), tandis que celle pour toutes les cellules était de 42,5 ± 7,4 UA (rouge clair). (B) Les niveaux de transvasase Vénus-TnpA sont similaires dans les cellules TnpB- (en haut) et TnpB+ (en bas). Les ensembles de données sont normalisés de sorte que les fluorescences jaunes moyennes de la population cellulaire totale (jaune clair) soient égales pour TnpB+/- à 105,7 UA. Les cellules qui ont été identifiées comme subissant des événements d’excision de transposons (jaune foncé) présentent une fluorescence jaune plus élevée que la population générale, avec des distributions similaires pour TnpB- (en haut) et TnpB+ (en bas). Les fluorescences jaunes moyennes des populations excisantes sont TnpB-: 158,3 ± 68,2 UA et TnpB+: 193 ± 79,9 UA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Film supplémentaire 1: Dynamique en temps réel de l’excision IS608 avec expression TnpB. Un film montrant un segment de 5 h de dynamique IS608 en temps réel; Une image est capturée toutes les 20 minutes. L’excision IS608 est visualisée comme le développement d’une fluorescence bleu vif. Les cellules montrées dans ce film incluent l’expression de TnpB. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Film supplémentaire 2: Dynamique en temps réel de l’excision IS608 sans expression TnpB. Un film montrant un segment de 5 h de dynamique IS608 en temps réel; Une image est capturée toutes les 20 minutes. L’excision IS608 est visualisée comme le développement d’une fluorescence bleu vif. Les cellules montrées dans ce film n’incluent pas l’expression de TnpB. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La méthode unique présentée ici pour l’imagerie en temps réel de l’activité des éléments transposables dans les cellules vivantes est un test sensible qui peut détecter directement la transposition dans les cellules vivantes et en temps réel et corréler cette activité avec l’expression de protéines accessoires. Bien que le débit soit inférieur à ce qui peut être accompli par des méthodes en vrac, cette méthode permet d’obtenir des mesures détaillées de l’activité TE et de l’expression des protéines dans les cellules vivantes individuelles.
Une variété d’outils et de techniques peuvent être utilisés pour cultiver des cellules directement au microscope pour l’imagerie en temps réel. La méthode utilisée ici de croissance cellulaire sur les tampons d’agarose a l’avantage d’être rapide, bon marché et facile à réaliser. Un inconvénient possible, en fonction de l’état de croissance cellulaire d’intérêt, est que les ressources disponibles pour soutenir la croissance cellulaire dans le tampon d’agarose sont limitées, et donc les cellules vont naturellement épuiser ces ressources et cesser de croître après une période de temps relativement courte (12-24 h). Par conséquent, il faut prendre soin de préparer les cellules à l’état d’équilibre et d’inoculer le tampon à une densité suffisamment faible pour donner suffisamment de temps pour la mesure. La microfluidique peut être utilisée pour maintenir les cellules en croissance exponentielle à l’état stable pendant de longues périodesde temps 24, bien que ces méthodes nécessitent une expertise, un équipement et une configuration supplémentaires pour être efficaces.
En complément des travaux plus détaillés du laboratoire Kuhlman19, il est illustré ici que la protéine TnpB associée à la famille IS200/IS605 TE augmente le taux d’excision IS608 jusqu’à cinq, et que l’augmentation de l’excision est directement corrélée à des niveaux d’expression plus élevés de TnpB. Ces méthodes sont un exemple de techniques d’essai améliorées qui peuvent aider à faire la lumière sur l’activité des transposons et son impact sur la dynamique mutationnelle et évolutive.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Le soutien financier pour cette recherche a été fourni par des fonds de démarrage de l’Université de Californie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
- Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
- Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
- Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
- Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11 (2014).
- Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
- Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
- Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
- Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
- Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
- Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
- Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
- Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
- Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
- Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
- Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).
