このプロトコルは、生細胞におけるStub1を介したペキソファジーをトリガーおよびモニタリングするための指示を提供します。
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この記事について
サマリー
要約
哺乳類細胞は、Stub1を介したペキソファジーを介してペルオキシソームをターンオーバーすることができます。この経路は、ペルオキシソームの量と質の細胞制御を可能にする可能性があります。このプロセスの間に、ヒートショックタンパク質70とユビキチンE3リガーゼStub1がペルオキシソーム上に移動し、ペキソファジーを開始するためにひっくり返されます。Stub1リガーゼ活性により、標的ペルオキシソーム上にユビキチンやその他のオートファジー関連モジュールを蓄積することができます。ペルオキシソーム内腔内の活性酸素種(ROS)レベルを上昇させると、Stub1を介したペキソファジーが活性化される可能性があります。したがって、色素支援ROS生成を使用して、この経路をトリガーおよび監視することができます。本稿では、蛍光タンパク質と合成蛍光色素の2つのクラスの色素を使用して、哺乳類細胞培養内でペキソファジーを開始する手順について概説します。これらの色素支援ROS生成ベースのプロトコルは、世界中の細胞集団内のすべてのペルオキシソームを標的とするために使用できるだけでなく、単一細胞内の個々のペルオキシソームの操作を可能にすることもできます。また、生細胞顕微鏡を使用してStub1を介したペキソファジーを追跡する方法についても説明します。
概要
ペルオキシソームは、ほとんどの真核細胞に存在する単膜結合オルガネラです。ペルオキシソームは、超長鎖脂肪酸のベータ酸化、プリン異化作用、およびエーテルリン脂質と胆汁酸の合成を行うために不可欠な代謝コンパートメントです1。ペルオキシソーム由来アセチルCoAは、代謝における中枢シグナル伝達を制御することにより、脂質恒常性を制御します2。したがって、ペルオキシソーム機能の低下が、神経変性疾患、老化、癌、肥満、および糖尿病を含む様々な疾患において暗示されることは驚くべきことではない3、4、5。ペルオキシソーム操作の維持に不可欠なプロセスはペキソファジーです。ペキソファジーは、オートファジーによるペルオキシソームの選択的代謝回転のための異化プロセスです。細胞はペキソファジーを使用してペルオキシソームの量と質を制御し、それによって適切なペルオキシソーム機能を確保します。最近の研究では、PEX1ペルオキシソーム生合成因子1および6の突然変異によって引き起こされるペルオキシソーム喪失は、制御されていないペキソファジー6に起因することが実証されました。特に、すべてのペルオキシソーム....
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プロトコル
1. ペルオキシソーム内腔にジキラーレッドまたは自己標識タンパク質(SLP)を発現する細胞の調製
- ガラス底の細胞培養皿に目的の細胞を播種します。ここでの実験では、840 μLの培養液(10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM/F-12)または840 μLの培養液(10%ウシ血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM)中の6 x 104マウスNIH3T3細胞を、直径20 mmのガラスマイクロウェルを備えた35 mmの培養皿に播種します。
注:播種する細胞の数は、他の仕様のガラス底皿を使用する場合、ガラスマイクロウェルの面積に応じて比例して調整する必要があります。 - 細胞を5%CO2/37°C下で24時間増殖させる。
- トランスフェクション試薬を使用して、細胞に目的のプラスミドをトランスフェクトします。
- PMP34-TagBFPを使用して、生細胞中のペルオキシソームを標識します。ペルオキシソーム内腔でのROS生成(+色素標識SLPリガンド)には、ペルオキシソーム標的ジキラーレッド-VKSKLまたはSLP-VKSKL(+色素標識SLPリガンド)のいずれかを使用します(光活性化ROS産生による)。このプロトコルでは、自己標識タンパク質HaloTag-VKSKL21を使用し....
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結果
ここに示すStub1を介したペキソファジー誘導スキームは、ペルオキシソーム内腔内での色素支援ROS生成を利用します。この操作には、最小限の光強度が必要です。したがって、蛍光タンパク質または色素を含むペルオキシソームは、標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して照明することができます。焦点照明は、蛍光レポーターroGFP2-VKSKLによって示されるように、個々のペルオキシソーム内で瞬間的かつ局所的なROS産生をもたらします(図9)。イメージング中の追加のROS生成を避けるために、roGFP2-VKSKL測定ではdiKillerRed-VKSKLをイメージングしませんでした。 図9 の右下のdiKillerRed-VKSKL画像は、損傷したペルオキシソームが13である場所を明確に示すために、すべてのroGFP2-VKSKL測定が行われた後に撮影されました。データはまた、照射されていないペルオキシソームが影響を受けないことを示しており、方法論の精度を示しています。ROSは、.......
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ディスカッション
このプロトコルは、光でペルオキシソームROSレベルを上昇させることにより、細胞培養内でStub1を介したペキソファジーをトリガーする方法を詳述しています。このプロトコルは色素支援ROS生成に依存しているため、目的の細胞内でdiKillerRed-VKSKLまたは色素標識SLPリガンド染色の十分な発現を確保する必要があります。異なる細胞型または異なる遺伝的背景の細胞がわずかに異なる特性を有するペルオキシソームを有する可能性があることを考えると、ペキソファジーの誘導を確実にするために正確な照明条件を調整する必要があるかもしれない。Stub1を介したペキソファジーの活性化をスクリーニングするための強力な手段は、EGFP-Ubが照明されたペルオキシソームに転座するかどうかを監視することです(照明後1時間)13。健康な細胞では、EGFP-Ubシグナルは通常、細胞質内に均一に分布しています。したがって、照射されたペルオキシソームへのその転座は観察が容易である。照明条件を最適化するために、光強度または照明時間を変更することができます。また、ペルオキシソームを損傷しようとするときは、下流のイメージングを妨.......
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開示事項
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
謝辞
この作業は、台湾の国家科学技術評議会からのMOST 111-2311-B-001-019-MY3研究助成金によって部分的にサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 直径20mmのガラスマイクロウェルを備えた35mm培養皿 | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm ガラス底 |
| 3-アミノ-1,2,4-トリアゾール (3-AT) | シグマ アルドリッチ | A8056 | |
| ウシ血清 | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 16170060 | |
| 細胞培養インキュベーター | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academy, Sinica | PTS1 タンデムダイマーを PTS1 (VKSKL) と KillerRed を添加して作られ | |
| ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11965092 | |
| ダルベッコの改変イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM / F-12) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | の11330032 | |
| EGFP-C1 | クロンテック | pEGFP-C1 | EGFP-C1のバックボーンは、EGFP-Stub1、EGFP-Hsp70、EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | HeLa cDNAから増幅し、EGFP-C1にクローニングしたHsp70遺伝子(HSPA1A) PCR、EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | にクロー | ||
| EGFP-C1に挿入して(HeLa細胞cDNAのPCR増幅により)、EGFP-C1 | カデミア | ||
| EGFP-C1 | |||
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| シ胎児血清 | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMRリガンド | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 EGFP-C1 バックボーン | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | オリンパス | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, TOKAI HITチャンバーインキュベーターとUNIV2-D35ディッシュアタッチメント付き顕微鏡 |
| Janelia Fluor 646 HaloTag 配位子 | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | トランスフェクション試薬 |
| NIH3T3 細胞 | ATCC | CRL-1658 | 付着性 |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | 還元血清培地 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR HeLa cDNAから増幅し、クローニングintoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | eroGFP(Addgene plasmid 20131から採取)にアミノ酸配列VKSKLを付加し、EGFP-C1 | |
| SHSY5Y細胞 | ATCC | CRL-2266 | 接着体 |
参考文献
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).
- He, A., et al.
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