Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Opheldering van het metabolisme van 2,4-dibroomfenol in planten

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65089

⸱

10 februari 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Microbial Control Technology for Industrial Pollution in Zhejiang Province, College of Environment, Zhejiang University of Technology, 2International Joint Research Center for Persistent Toxic Substances (IJRC-PTS), College of Environment, Zhejiang University of Technology, 3Research and Teaching Center of Agriculture, Zhejiang Open University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor de identificatie van 2,4-dibroomfenolmetabolieten in planten.

Samenvatting

Gewassen kunnen op grote schaal worden blootgesteld aan organische verontreinigende stoffen, omdat de bodem een belangrijke put is voor verontreinigende stoffen die in het milieu worden weggegooid. Dit creëert potentiële blootstelling van de mens door de consumptie van verontreinigende voedingsmiddelen. Het ophelderen van de opname en het metabolisme van xenobiotica in gewassen is essentieel voor de beoordeling van het blootstellingsrisico via de voeding bij de mens. Voor dergelijke experimenten vereist het gebruik van intacte planten echter langetermijnexperimenten en complexe monstervoorbereidingsprotocollen die door verschillende factoren kunnen worden beïnvloed. Planteneeltculturen in combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie (HRMS) kunnen een oplossing bieden voor de nauwkeurige en tijdbesparende identificatie van metabolieten van xenobiotica in planten, omdat het interferentie van de microbiële of schimmelmicro-omgeving kan voorkomen, de behandelingsduur kan verkorten en het matrixeffect van intacte planten kan vereenvoudigen. 2,4-dibroomfenol, een typische vlamvertrager en hormoonontregelaar, werd als modelstof gekozen vanwege het wijdverbreide voorkomen ervan in de bodem en het opnamepotentieel ervan door planten. Hierin werd planteelt gegenereerd uit asepsiszaden en blootgesteld aan steriel 2,4-dibroomfenolbevattend cultuurmedium. De resultaten toonden aan dat acht metabolieten van 2,4-dibroomfenol werden geïdentificeerd in de eeltweefsels van de plant na 120 uur incubatie. Dit geeft aan dat 2,4-dibroomfenol snel werd gemetaboliseerd in de eeltweefsels van de plant. Het platform voor planteneelkweek is dus een effectieve methode om de opname en het metabolisme van xenobiotica in planten te evalueren.

Inleiding

Een toenemend aantal organische verontreinigende stoffen is in het milieu gegooid als gevolg van antropogene activiteiten1,2, en de bodem wordt beschouwd als een belangrijke put voor deze verontreinigingen 3,4. De verontreinigingen in de bodem kunnen door planten worden opgenomen en mogelijk worden overgedragen op organismen op een hoger trofisch niveau langs voedselketens, door rechtstreeks het menselijk lichaam binnen te dringen via gewasconsumptie, wat leidt tot onbedoelde blootstelling 5,6. Planten gebruiken verschillende routes om xenobiotica te metaboliseren voor ontgifting7; Het ophelderen van het metabolisme van xenobiotica is belangrijk, omdat het het feitelijke lot van verontreinigingen in planten beheerst. Aangezien de metabolieten door bladeren (naar de atmosfeer) of de wortels kunnen worden uitgescheiden, biedt het bepalen van de metabolieten in de zeer vroege stadia van blootstelling dus de mogelijkheid om een uitgebreid aantal metabolieten te testen8. Studies met intacte planten vereisen echter langetermijnexperimenten en complexe monstervoorbereidingsprotocollen die door verschillende factoren kunnen worden beïnvloed.

Plantaardige eeltculturen zijn daarom een goed alternatief voor het bestuderen van het metabolisme van xenobiotica in planta, omdat ze de behandelingstijd aanzienlijk kunnen verkorten. Deze culturen sluiten microbiële interferentie en fotochemische afbraak uit, vereenvoudigen het matrixeffect van intacte planten, standaardiseren de teeltomstandigheden en vereisen minder experimentele inspanning. Plantaardige eeltculturen zijn met succes toegepast als een alternatieve benadering in metabole studies van triclosan9, nonylfenol10 en tebuconazol8. Deze studies toonden aan dat de metabole patronen in eeltculturen vergelijkbaar waren met die in intacte planten. Deze studie stelt een methode voor voor de efficiënte en nauwkeurige identificatie van metabolieten van xenobiotica in planten zonder complexe en tijdrovende protocollen. Hier gebruiken we plantaardige eeltculturen in combinatie met hoge resolutie massaspectrometrie voor de analyse van metabolieten met lage intensiteit signalen11,12.

Hiertoe werden wortel (Daucus carota var. sativus) eeltsuspensies gedurende 120 uur blootgesteld aan 100 μg/l 2,4-dibroomfenol in een schudder bij 130 tpm en 26 °C. 2,4-dibroomfenol werd gekozen vanwege de verstorende endocriene activiteit13 en het wijdverbreide voorkomen in bodem14. De metabolieten werden geëxtraheerd en geanalyseerd met behulp van hoge resolutie massaspectrometrie. Het hier voorgestelde protocol kan het in planta-metabolisme onderzoeken van andere soorten organische verbindingen die kunnen worden geïoniseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Differentiatie van wortel callus

OPMERKING: Autoclaaf alle apparatuur die hier wordt gebruikt en voer alle bewerkingen uit in een UV-gesteriliseerde ultraschone werkbank.

  1. Vernaliseer de zaden door de uniforme wortelzaden (Daucus carota var. sativus) gedurende 16 uur onder te dompelen in gedeïoniseerd water bij 4 °C.
  2. Steriliseer de vernalized zaden gedurende 20 minuten met 75% ethanol en spoel vervolgens drie keer met steriel gedeïoniseerd water onder aseptische omstandigheden.
  3. Steriliseer de zaden verder met 20%H 2 O2 gedurende 20 minuten en was ze zes keer onder aseptische omstandigheden met gesteriliseerd gedeïoniseerd water.
  4. Ontkiem de zaden aseptisch door ze te zaaien op hormoonvrij MS-medium (pH 5,8, geautoclaveerd bij 121 °C gedurende 20 minuten) met 1% agar-gel en te broeden bij 26 °C met een fotoperiode van 16 uur (350 μmol/m2s) gedurende 15 dagen.
  5. Verkrijg de explantaten door de hypocotyl en zaadlob van de zaailingen in kleine stukjes (0,5 cm) te snijden.
  6. Transformeer de explantaten in petrisalen (twee tot vier explantaten per schaal) met 15-20 ml aseptisch MS-medium aangevuld met auximon (2,4-dichloorfenoxyazijnzuur; 1 mg / L) en fytokinine (6-benzylaminopurine; 0,5 mg / L) onder aseptische omstandigheden.
  7. Incubeer de explantaten in het donker bij 26 °C gedurende 3-4 weken om het eelt op te wekken.
  8. Scheid de eeltweefsels (ongeveer 1 cm diameter) gevormd van de eerste explantaten met behulp van een steriel scalpel en een tang.
    OPMERKING: De nieuw gevormde eeltweefsels zijn wit tot crèmegeel van kleur en hechten zich losjes aan de eerste explantaten.

2. 2,4-dibroomfenol behandeling

  1. Los 1 μg 2,4-dibroomfenol op in 10 ml aseptisch vloeibaar MS-medium (de uiteindelijke concentratie van 2,4-dibroomfenol is 100 ppb, pH 5,6-7,0).
  2. Voeg 3 g van het verse worteleelt (stap 1.8) toe aan glazen kolven met de bereide 2,4-dibroomfenoloplossing (van stap 2.1) onder aseptische omstandigheden. Beschouw dit als de 2,4-dibroomfenol behandeling.
    OPMERKING: De glazen kolven werden geautoclaveerd en verzegeld met paraffinefolie.
  3. Neem een mediumcontrole op die alleen de 2,4-dibroomfenoloplossing bevat (bereid in stap 2.1) om de abiotische afbraak van 2,4-dibroomfenol te evalueren.
  4. Voeg een blanco controle toe die alleen de worteleelt bevat (geen 2,4-dibroomfenoloplossing) om te controleren op mogelijke verontreiniging.
    1. Bereid de blanco controle die wortel bevat door 3 g vers verzameld worteleelt alleen toe te voegen aan 10 ml steriel MS-medium.
  5. Incubeer de 2,4-dibroomfenolbehandeling en de medium- en blancocontroles bij 130 rpm en 26 °C in het donker in een incubator gedurende 120 uur.
  6. Verwijder de glazen kolven uit de incubator om de monsters van de 2,4-dibroomfenolbehandeling en -controles na 120 uur incubatie te verzamelen.
    OPMERKING: Alle monsters werden in drievoud bereid.

3. Monstervoorbereiding

  1. Scheid de callus zorgvuldig van het MS-medium door filtratie met glasvezelfilters (0,45 μm) voor de 2,4-dibroomfenolbehandeling en de controles. Verzamel het eelt na het wassen met ultrapuur water drie keer.
  2. Vriesdroog het verzamelde eelt met vloeibare stikstof en homogeniseer vervolgens het verzamelde eelt (0,2 g) met een high-throughput weefselmolen op 70 Hz gedurende 3 minuten.
  3. Spike de gehomogeniseerde callus door 50 μL van 25 mg / L surrogaat 4-n-NP-d4 toe te voegen met een glazen microsyringe en vervolgens gedurende 1 minuut te vortexen.
  4. Soniceer de monsters met 5 ml methanol / water (1: 1, v / v) in een ultrasoonapparaat (150 W, 40 kHz) gevuld met ijswater gedurende 30 minuten, om 2,4-dibroomfenol en de metabolieten te extraheren.
  5. Centrifugeer de suspensies bij 8.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten en verzamel de supernatanten door pipetteren.
    1. Herhaal de extractieprocessen voor het eeltmonster drie keer en combineer de extracten.
  6. Laat de extracten door hydrofiele lipofiele gebalanceerde vaste fase extractie (HLB SPE) patronen met een stroomsnelheid van 1 ml / min.
    OPMERKING: De HLB SPE-patronen werden achtereenvolgens voorbehandeld met 6 ml methanol en 6 ml water om eventuele interferenties te verwijderen.
  7. Elueer de analyten door 6 ml methanol door de HLB SPE-patronen te leiden. Concentreer vervolgens de verkregen eluenten tot 1 ml onder een zachte stroom stikstofgas voor instrumentele analyse.
  8. Injecteer 10 μL resulterende eluenten in de UPLC-Q-TOF-MS voor 2,4-dibroomfenol en hun metabolietenanalyse15.
    1. Filter alle monsters met een nylonmembraan van 0,22 μm vóór instrumentele analyse.

4. Instrumentele analyse

OPMERKING: 2,4-dibroomfenol en hun metabolietenanalyses werden uitgevoerd op een ultraperformante vloeistofchromatograaf (UPLC) in combinatie met een micrOTOF-QII-massaspectrometer uitgerust met een elektrospray-ionisatie (ESI), werkend in de positieve en negatieve ionenmodus.

  1. Open de kolomverwarmingsdeur en installeer de UPLC-kolom door de kolominlaat aan te sluiten op de injectieklep en kolomuitlaat op de inlaat van de massaspectrometer.
    OPMERKING: Een C18-kolom (50 mm x 2,1 mm; deeltjesgrootte van 1,7 μm) werd gebruikt voor de scheiding van analyten bij 40 °C.
  2. Sluit mobiele fase A (ultrapuur water) en mobiele fase B (methanol van chromatografiekwaliteit) aan op het instrument door respectievelijk het uiteinde van de oplosmiddelbuizen A en B in de overeenkomstige oplosmiddelflessen te steken.
    1. Filter alle mobiele fasen (500 ml voor elk) door een filter van 0,22 μm en soniceer gedurende meer dan 30 minuten.
  3. Klik in het softwarevenster op Instrument | Inlaatmethode om de voorwaarden voor het vloeistofchromatogram te bewerken.
    1. Stel de gradiëntcondities van mobiele fase B als volgt in: een debiet van 1,0 ml/min; 0-0,5 min, 5%; 0,5-3,5 min, 5% tot 50%; 3,5-6,5 min, 50% tot 100%; 6,5-7 min, 100%; 7-10 min, 100% tot 5%.
    2. Stel de injectiesnelheid van de monsters in de UPLC-Q-TOF-MS in op 0,2 ml/min.
      OPMERKING: De injectie van het monster wordt geprogrammeerd met behulp van een volautomatische sampler.
  4. Selecteer in het softwarevenster MS-methode en stel vervolgens de parameters van Q-TOF-MS in: een drooggasdebiet (N2) van 8 l / min, een temperatuur van 300-350 °C; een capillaire spanning van 4.500 V; een botsingsenergie van 5-45 V; en een volledig scanbereik van 40-800 Da.
  5. Plaats de injectieflacons met het monster op de overeenkomstige plaatsen van de monsterlades op serienummer en plaats de monsterlades opnieuw in de monsterkamer.
    OPMERKING: Houd de monsterbakken plat en zorg ervoor dat de deur van de monsterkamer gesloten is.
  6. Selecteer in het softwarevenster Bestand | Nieuw om een database te maken. Geef de database een naam.
  7. Laad het hierboven gemaakte voorbeeldprogramma door MS-bestand | Inlaatbestand | Injecteer volume.
  8. Sla de database op in de voorbeeldmap van het project door te klikken op Bestand | Opslaan.
  9. Selecteer Uitvoeren | Begin in het hoofdvenster van de software en selecteer vervolgens Voorbeeldgegevens ophalen en klik op OK in het venster van de startvoorbeeldlijst om gegevens te verzamelen.
    OPMERKING: Het real-time chromatogram kan worden bekeken door te klikken op Chromatogram | Real-time update tijdens het data-acquisitieproces.
  10. Verwerk de gegevens in de software door de doelgegevensrij te selecteren en op het chromatogramvenster te klikken om het MS-scanchromatogram te bekijken.
  11. Klik in het venster Chromatogram op Weergeven | TIC ScanWaveDS Tracering toevoegen | OK om de dochter massaspectra te laten scannen.
  12. Identificeer de metabolieten door de chromatogrammen van de 2,4-dibroomfenolbehandeling en de controles te vergelijken.
  13. Verhelder de metabolietkandidaten door de retentietijd, massa en fragmentatiepatronen16,17.
    OPMERKING: De fout in massanauwkeurigheid tussen de experimentele m/z-waarden van de moederionen van de metabolietkandidaten en hun overeenkomstige theoretische m/z moet minder dan 10 ppm bedragen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De stappen van het protocol zijn weergegeven in figuur 1. Volgens het protocol vergeleken we het chromatogram van het worteleeltextract van de 2,4-dibroomfenolbehandeling met de controles en vonden acht verschillende pieken die aanwezig zijn in de 2,4-dibroomfenolbehandeling, maar afwezig in de controles (figuur 2). Dit geeft aan dat in totaal acht metabolieten van 2,4-dibroomfenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 en M187) met succes werden gedetecteerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol is ontwikkeld om de biotransformatie van xenobiotica in planten efficiënt te identificeren. De cruciale stap van dit protocol is de cultuur van het planteel. Het moeilijkste deel is de differentiatie en het onderhoud van het planteneel, omdat het planteneelt gemakkelijk wordt geïnfecteerd en ontwikkeld tot plantenweefsels. Daarom is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle gebruikte apparatuur wordt geautoclaveerd en dat alle bewerkingen onder aseptische omstandigheden worden uitgevoerd. De differentiatie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (21976160) en het Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,4-dichloorfenoxyazijnzuurWAKO1 mg/L
20% H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10011218-500ML
4-n-NP, >99%Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4Pointe-Claire
6-benzylaminopurineWAKO0,5 mg/L
75% ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.1269101-500ML
7890A-5975 gaschromatografieAgilent
ACQULTY ultra-prestatie vloeistofchromatografieWaters
Amber glazen flesjesWaters
Kunstmatige klimaatincubatorNingbo DongNan Lab Equipment Co.,LTDRDN-1000A-4
AutoclaafSTIKMJ-Series
C18 kolomACQUITY UPLC BEH
CentrifugeThermo Fisher
DB-5MS capillaire kolomAgilent
DichloormethaanSigma-Aldrich40071190-4L
VriesdrogerSCIENTZ 
Hoge doorvoerweefselmolenSCIENTZ 
MethanolSigma-Aldrich
MicrOTOF-QII massaspectrometerBruker Daltonics
Milli-Q systeemMilliporeMS1922801-4L
Murashige & Skoog mediumHOPEBIOHB8469-7
N-hexaanSigma-AldrichH109658-4L
Stikstofblaasinstrument AOSHENGMD200-2
NP isomeren, >99%Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridgesWaters60 mg/3 mL
Research plusEppendorf100-1000 µL
Zaden van Little Finger wortel (Daucus carota var. sativus) Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Schuddende incubatorsShanghai bluepard instruments Co.,ltd.THZ-98AB
Solid phase extractorAUTO SCIENCE
Ultrasone machineZKIUC-6
UV-gesteriliseerd ultra-schoon werkbladAIRTECH

Referenties

  1. Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
  2. Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048(2020).
  3. Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232(2021).
  4. Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
  5. Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
  6. Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
  7. Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
  8. Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
  9. Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
  10. Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064(2021).
  11. Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
  12. Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
  13. Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
  14. de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
  15. Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
  16. Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
  17. Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
  18. Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
  19. Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
  20. Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Metabolisme van 24-dibroomfenolplantencalluscultuuropname van xenobioticaorganische verontreinigingenhogeresolutiemassaspectrometrieidentificatie van metabolietenvaste-fase-extractieultra-performance vloeistofchromatografiemilieurisicobeoordelingplantemetabole routes
Opheldering van het metabolisme van 2,4-dibroomfenol in planten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.