We presenteren een protocol om metabole activiteiten in cellen gereguleerd door aminozuren direct te visualiseren met behulp van deuteriumoxide (zwaar water D2O) gesondeerde gestimuleerde Raman-verstrooiing (DO-SRS) microscopie, die is geïntegreerd met twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie (2PEF).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Essentiële aromatische aminozuren (AAAs) zijn bouwstenen voor het synthetiseren van nieuwe biomassa's in cellen en het ondersteunen van normale biologische functies. Een overvloedig aanbod van AAAs is bijvoorbeeld belangrijk voor kankercellen om hun snelle groei en deling te behouden. Hiermee is er een stijgende vraag naar een zeer specifieke, niet-invasieve beeldvormingsbenadering met minimale monstervoorbereiding om direct te visualiseren hoe cellen AAAs gebruiken voor hun metabolisme in situ. Hier ontwikkelen we een optisch beeldvormingsplatform dat deuteriumoxide (D2O) sonderen combineert met gestimuleerde Raman-verstrooiing (DO-SRS) en DO-SRS integreert met twee-foton excitatiefluorescentie (2PEF) in een enkele microscoop om de metabole activiteiten van HeLa-cellen onder AAA-regulatie direct te visualiseren. Gezamenlijk biedt het DO-SRS-platform een hoge ruimtelijke resolutie en specificiteit van nieuw gesynthetiseerde eiwitten en lipiden in enkele HeLa-celeenheden. Bovendien kan de 2PEF-modaliteit autofluorescentiesignalen van nicotinamide, adeninedinucleotide (NADH) en flavine op een labelvrije manier detecteren. Het hier beschreven beeldvormingssysteem is compatibel met zowel in vitro als in vivo modellen, wat flexibel is voor verschillende experimenten. De algemene workflow van dit protocol omvat celkweek, kweekmediavoorbereiding, celsynchronisatie, celfixatie en monsterbeeldvorming met DO-SRS- en 2PEF-modaliteiten.
Inleiding
Omdat ze essentiële aromatische aminozuren (AAAs) zijn, kunnen fenylalanine (Phe) en tryptofaan (Tryp) door het menselijk lichaam worden geabsorbeerd om nieuwe moleculen te synthetiseren voor het ondersteunen van normale biologische functies1. Phe is nodig voor de synthese van eiwitten, melanine en tyrosine, terwijl Tryp nodig is voor de synthese van melatonine, serotonine en niacine 2,3. Overmatige consumptie van deze AAAs kan echter het zoogdierdoel van de rapamycine (mTOR) -route upreguleren, AMP-geactiveerd eiwitkinase remmen en interfereren met het mitochondriale metabolisme, waard....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Mediavoorbereiding
- Bereid 10 ml controle en overtollige AAAs in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 50% D2O.
- Meet en meng voor de controlemedia 10 mg DMEM-poeder met 4,7 ml dubbel gedestilleerd water (ddH2O) in een conische buis van 15 ml. Het DMEM poeder bevat alle aminozuren in standaard concentraties. Draai de buis grondig om en keer deze om om ervoor te zorgen dat de oplossing goed wordt gemengd. Voeg 4,7 ml D2O, 0,5 ml foetaal runderserum (5% FBS) en 0,1 ml penicilline / streptomycine (1%) toe. Draai de buis grondig om en keer deze om om ervoor te zorgen dat de oplossing goed word....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De toevoeging van overtollige AAAs in 15x concentraties aan de 50% D2O-bevattende celkweekmedia produceerde verschillende C-D Raman-banden van nieuw gesynthetiseerde lipiden en eiwitten in HeLa-cellen (figuur 2B). Eerdere experimenten werden uitgevoerd met verschillende concentratieniveaus, zoals 2x en 5x, en hoewel de gegevens niet worden gepresenteerd, produceerde de 15x-concentratie de meest verschillende C-D Raman-banden van nieuw gesynthetiseerde lipiden en eiwitten. Specifie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
DO-SRS en 2PEF beeldvorming zijn toegepast om metabole dynamica te onderzoeken in verschillende ex vivo modellen, waaronder Drosophila en menselijke weefsels 21,22,23,24,26,27,33. De beeldvormingsmodaliteit die in deze studie wordt gebruikt, integreert DO-SRS en 2PEF-microscopie, di.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Dankbetuigingen
We bedanken Dr. Yajuan Li en Anthony Fung voor hun technische ondersteuning en het Fraley-lab voor de cellijn. We erkennen de start-upfondsen van UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 en Hellman Fellow Award.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco%27s%20Modified%20Eagle%27s%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/ |
Referenties
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).
- Parthasarathy, A., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
