Этот метод описывает эффективный рабочий процесс для визуализации и количественного измерения потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида в клетках HeLa с использованием флуоресцентной визуализации в реальном времени.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественная оценка потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида на основе флуоресценции с использованием визуализации в реальном времени в клетках HeLa
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Митохондрии являются динамическими органеллами, критически важными для метаболического гомеостаза, контролируя выработку энергии посредством синтеза АТФ. Для поддержки клеточного метаболизма различные механизмы контроля качества митохондрий взаимодействуют для поддержания здоровой митохондриальной сети. Одним из таких путей является митофагия, при которой PTEN-индуцированная киназа 1 (PINK1) и фосфо-убиквитинирование Паркина поврежденных митохондрий способствуют секвестрации аутофагосом и последующему удалению из клетки посредством слияния лизосом. Митофагия важна для клеточного гомеостаза, а мутации в Паркине связаны с болезнью Паркинсона (БП). В связи с этими выводами значительное внимание уделялось исследованию повреждений и оборота митохондрий, чтобы понять молекулярные механизмы и динамику контроля качества митохондрий. Здесь визуализация живых клеток использовалась для визуализации митохондриальной сети клеток HeLa, для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида после обработки карбонильным цианидом м-хлорфенилгидразоном (CCCP), митохондриальным разъединяющим агентом. Кроме того, была экспрессирована мутация паркина, связанная с болезнью Паркина (ParkinT240R), которая ингибирует паркин-зависимую митофагию, чтобы определить, как экспрессия мутантов влияет на митохондриальную сеть по сравнению с клетками, экспрессирующими паркин дикого типа. Протокол, описанный здесь, описывает простой рабочий процесс с использованием подходов, основанных на флуоресценции, для эффективной количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида.
Введение
Митохондриальная сеть представляет собой ряд взаимосвязанных органелл, которые играют решающую роль в производстве энергии1, врожденном иммунитете2,3 и клеточной сигнализации 4,5. Митохондриальная дисрегуляция была связана с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона (БП)6,7. БП — это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, поражающее дофаминергические нейроны черной субстанции, которое поражает почти 10 миллионов человек во всем ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка биологических образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги, используя стерильную технику в шкафу биобезопасности. Сбрызните поверхность шкафа и всех материалов 70% этанолом.
- Культивирование и трансфекция клеток HeLa
- Культивирование 30 000 клеток HeLa в модифицированной среде орла (DMEM) Дульбекко, содержащей 4,5 г/л глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% раствора L-глютамина (HeLa media; см. Таблицу материалов). Поместите ячейки на 35-миллиметровые чашки для визуализации состеклянным дном (см. Таблицу материалов), содержащую 2 мл предва....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом протоколе количественное определение на основе флуоресценции использовалось для измерения мембранного потенциала и уровней супероксида митохондриальной сети после обработки CCCP (рис. 1). В этом рабочем процессе использовались клетки HeLa, иммортализированная клеточная линия, полученная из рака шейки матки. Клетки HeLa обычно используются для изучения митохондриальной биологии и являются относительно плоскими, что позволяет легко визуализировать митохондриальную сеть с помощью микроск.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Рабочий процесс, описанный здесь, может быть использован для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида надежно и воспроизводимо с использованием флуоресцентной визуализации30. Существуют важные технические ограничения, которые следует учитывать при разработке этих экспериментов. Клетки HeLa трансфицировали пустым вектором YFP, YFP-ParkinWT или YFP-ParkinT240R. Пустой вектор YFP был использован в качестве контроля, чтобы подтвердить, что .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конкурирующих интересов, о которых можно было бы заявить.
Благодарности
Мы благодарим сотрудников лаборатории Эванса за их вдумчивые отзывы об этой рукописи. Эта работа поддерживается стипендиатами Дьюка Уайтхеда, учеными в области науки и техники Дьюка и стипендией Ханны Грей Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI). Рисунок 1А был сделан с использованием BioRender.com.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Химические вещества, пептиды и рекомбинантные белки | |||
| CCCP (карбонильный цианид m-хлорфенилгидразон) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) с 4,5 г/л глюкозы | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, безводный | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (реагент для трансфекции) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (раствор L-глютамина) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker темно-красный | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (редуцированная сывороточная среда) | ThermoFisher Scientific | 31985070 | |
| тетраметилродамин, этиловый эфир, перхлорат (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Экспериментальные модели: Организмы/штаммы | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Кембриджский институт медицинских исследований) | N/A | |
| >рекомбинантная ДНК | |||
| EYFP пустой вектор | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | Эта статья | Получена путем сайт-направленного мутагенеза из YFP-Parkin | |
| WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| программное обеспечение и алгоритмы | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (программное обеспечение для работы с электронными таблицами) | Microsoft Office | ||
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Программное обеспечение для анализа) | Программное обеспечение GraphPad | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 мм Тарелка, покровное стекло No 1,5, диаметр стекла 20 мм, Инкубатор | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| без покрытия (Климатическая камера) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Инвертированный микроскоп | Leica | N/A | |
| Программное обеспечение для деконволюции молнии | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 Конфокальный микроскоп | Leica | N/A |
Ссылки
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
