Coulometrische respirometrie is ideaal voor het meten van de stofwisseling van kleine organismen. Bij correctie voor Drosophila melanogaster in de huidige studie lag de gemeten O2-consumptie binnen het bereik dat in eerdere studies werd gerapporteerd voor wildtype D. melanogaster. Het verbruik van O2 per vlieg door vatmutanten , die kleiner en minder actief zijn, was significant lager dan bij het wildtype.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meting van O2-verbruik in Drosophila melanogaster met behulp van coulometrische microrespirometrie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Coulometrische microrespirometrie is een eenvoudige, goedkope methode om hetO2-verbruik van kleine organismen te meten met behoud van een stabiele omgeving. Een coulometrische microrespirometer bestaat uit een luchtdichte kamer waarin O 2 wordt verbruikt en de door het organisme geproduceerde CO2 wordt verwijderd door een absorberend medium. De resulterende drukverlaging activeert de elektrolytische O2-productie en de hoeveelheid geproduceerdeO2 wordt gemeten door de hoeveelheid lading te registreren die wordt gebruikt om deze te genereren. In de huidige studie is de methode aangepast aan Drosophila melanogaster getest in kleine groepen, waarbij de gevoeligheid van het apparaat en de omgevingsomstandigheden zijn geoptimaliseerd voor hoge stabiliteit. De hoeveelheid O2 die door wildtype vliegen in dit apparaat wordt geconsumeerd, komt overeen met die gemeten door eerdere studies. De massaspecifiekeO2-consumptie door vatmutanten, die kleiner zijn en waarvan bekend is dat ze minder actief zijn, verschilde niet van die van congene controles. De kleine omvang van de vatmutanten resulteerde echter in een aanzienlijke vermindering van hetO2-verbruik per vlieg. Daarom is de microrespirometer in staat om hetO2-verbruik in D. melanogaster te meten, bescheiden verschillen tussen genotypen te onderscheiden en een veelzijdig hulpmiddel toe te voegen voor het meten van stofwisselingssnelheden.
Inleiding
Het vermogen om de stofwisseling te meten is cruciaal voor een volledig begrip van een organisme in zijn omgevingscontext. Het is bijvoorbeeld noodzakelijk om de stofwisseling te meten om de rol ervan in levensduur1, de rol van voeding in het metabolisme2 of de drempel voor hypoxische stress3 te begrijpen.
Er zijn twee algemene benaderingen voor het meten van de stofwisseling4. Directe calorimetrie meet het energieverbruik rechtstreeks door de warmteproductie te meten. Indirecte calorimetrie meet de energieproductie op andere manieren, vaak via r....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Vliegenopfok en -verzameling
- Houd vliegen bij 25 °C in smalle injectieflacons met standaard Drosophila-voer .
OPMERKING: De steekproefomvang voor elk genotype moet ten minste negen replicaten omvatten, elk bestaande uit een enkele respirometerkamer met 15-25 vliegen, opgesteld zoals hieronder beschreven. - Breng de vliegen elke 2-3 dagen over.
- Verdoof vliegen met CO2, verzamel groepen van 15-25 mannetjes van elk genotype en plaats elke groep in verse, niet-gegiste voedselflesjes.
OPMERKING: Mannetjes werden gebruikt om de variabiliteit als gevolg van de voortplantingsstatus te verminderen. De me....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De druk- en stroomuitgangen van de ademhalingsmeterregelaar worden weergegeven voor één kamer in één experiment in figuur 3A. De eerste, lange stroompuls zette de kamer onder druk van omgevingsdruk (ongeveer 992 hPa) tot de vooraf ingestelde UIT-drempel van 1017 hPa. Terwijl de vliegen O 2 verbruikten en CO 2 werd geabsorbeerd, nam de druk langzaam af totdat deze de AAN-drempel van 1016 hPa bereikte, die de stroom door de O 2-generator activeerde. In het geto.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De bovenstaande procedure demonstreert de meting van hetO2-verbruik in D. Melanogaster met behulp van een elektronische coulometrische microrespirometer. De resulterende gegevens voor de consumptie van O2 in wildtype D. melanogaster lagen binnen de marges die in de meeste eerdere publicaties met verschillende methoden zijn beschreven (tabel 1), hoewel iets lager dan die welke door anderen werden gerapporteerd 3,6.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
We danken Dr. Linda Restifo van de Universiteit van Arizona voor het voorstellen om de O2-consumptie van CASK mutanten te testen en voor het sturen van CASK mutanten en hun congene controles. De publicatiekosten werden verstrekt door het Departmental Reinvestment Fund van de afdeling Biologie van het University of College Park. Ruimte en wat apparatuur werden geleverd door de universiteiten in Shady Grove.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
Referenties
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
