Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ניתוח זרימת דיווח כפול מבוסס חרוזים פלואורסצנטיים מגנטיים של חסימת נוגדנים המושרה על ידי חיסון PDL1-Vaxx של אינטראקציה PD-1/PD-L1

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65467
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Obstetrics & Gynecology, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2The James Comprehensive Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

מעכבי צ'קפוינט הם מטרות חשובות בפיתוח טיפולים למלחמה בסרטן. דו"ח זה מציג חיסון חדשני לסרטן מבוסס פפטיד PDL1, PDL1-Vaxx, אשר גורם לייצור נוגדנים רב-שבטיים מנטרלים החוסמים היווצרות קומפלקס PD-1/PDL1. עבודה זו מפרטת גם את הפיתוח והבדיקות של בדיקה מבוססת חרוזים פלואורסצנטיים לניתוח פעילות זו.

Abstract

עיכוב קולטני נקודות ביקורת (PD-1, PD-L1 ו-CTLA-4) עם נוגדנים חד-שבטיים הראה תועלת רבה בניסויים קליניים לטיפול בחולי סרטן והפך לגישה מרכזית באימונותרפיה מודרנית לסרטן. עם זאת, רק תת-קבוצה של חולים מגיבה לאימונותרפיה של נוגדנים חד-שבטיים של נקודות ביקורת. לכן, דחוף לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות נגד סרטן. פותח חיסון חדשני נגד סרטן מסוג PDL1 (ליגנד מוות מתוכנת 1), עם חומצות אמינו 130-147 המקושרות לפפטיד MVF (חלבון היתוך נגיף חצבת "מופקר") באמצעות מקשר GPSL. בדיקות פרה-קליניות הצביעו על כך שחיסון PDL1 זה (PDL1-Vaxx) מעורר ביעילות נוגדנים אימונוגניים מאוד בבעלי חיים. בעלי חיים שחוסנו ב-PDL1-Vaxx מראים ירידה בנטל הגידול ושיעורי הישרדות מורחבים במודלים שונים של סרטן בעלי חיים. מנגנוני הפעולה מצביעים על כך שנוגדנים שמקורם בחיסון מעכבים את התרבות תאי הגידול, גורמים לאפופטוזיס וחוסמים את האינטראקציה PD-1/PD-L1. כתב יד זה מציג בדיקה מבוססת חרוזים מגנטיים המשתמשת במערכת ניתוח זרימה בעלת דיווח כפול כדי להעריך את האינטראקציה PD-1/PD-L1 ואת חסימה על ידי נוגדנים נגד PDL1 שהועלו כנגד PDL1-Vaxx.

Introduction

בתאי T, תאי B ונקודות ביקורת תוך-תאיות של מערכת החיסון, מסלולי איתות מווסתים את פעילות מערכת החיסון. חלק מהתאים הסרטניים מגנים על עצמם מפני התקפה חיסונית על ידי גירוי מטרות נקודות ביקורת, המעכבות את תפקוד מערכת החיסון ומעודדות הישרדות ושגשוג ניאופלסטיים. אימונותרפיה אונקולוגית על ידי עיכוב נקודות ביקורת משתמשת בנוגדנים כדי למקד ולחסום את מחסומי האיתות, ובכך לשחזר את הפונקציות האנטי ניאופלסטיות של המערכת החיסונית 1,2,3. טיפולים אנטי-סרטניים יעילים ביותר כוללים כיום את הנוגדנים החד-שבטיים nivolumab, המכוונים לחלבון מוות מתוכנת 1 (PD-1)4, ואת atezolizumab, המכוון לליגנד מוות מתוכנת 1 (PD-L1)5. גישה זו הראתה הצלחה קלינית רבה בטיפול בחולי סרטן. עם זאת, התועלת הקלינית של אסטרטגיות עיכוב נקודות ביקורת הנוכחיות מתמתנת על ידי תופעות לוואי ועמידות לטיפול, במיוחד בטיפול בסוכן יחיד6. יש צורך דחוף בשילוב של אימונותרפיה ואסטרטגיות טיפוליות יעילות יותר עם רעילות נמוכה יותר בטיפול בסרטן 1,3,6.

במהלך 30 השנים האחרונות, המעבדה של ד"ר קאומאיה פיתחה חיסונים פפטידים לסרטן וחומרים הקשורים לחיקוי פפטיד לטיפול בסרטן, חלקם נמצאים בניסויים קליניים מתמשכים 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . לדוגמה, B-Vaxx עם אימונותרפיה משולבת HER-2 הראתה יתרונות למטופלים נגד גידולים מוצקים גרורתיים ו / או חוזרים בניסויים קליניים12. חיסוני הסרטן האחרונים של המעבדה הם PD1-Vaxx 2,13 ו-PDL1-Vaxx14, שהראו יתרונות גדולים במחקרים פרה-קליניים, במיוחד בטיפול משולב. PD1-Vaxx השלים ניסויים קליניים להעלאת מינון בארה"ב ובאוסטרליה. PD1-Vaxx ישולב עם atezolizumab בניסוי שלב 1b שיחל במאי 2023. דוח זה מתמקד בהערכת היכולת של נוגדנים הנגרמים על ידי PDL1-Vaxx לחסום את האינטראקציה PD-1/PD-L1.

החיסון לסרטן PDL1-Vaxx הוא חיסון אפיטופ פפטידי תאי B חדשני עם חומצות אמינו PD-L1 130-147 המקושרות לפפטיד המופקר של נגיף חצבת תאי T (MVF) באמצעות מקשר פפטידי GPSL. מחקרים פרה-קליניים הראו כי PDL1-Vaxx הוא אימונוגני מאוד בהמרצת ייצור נוגדנים אנטי-סרטניים במודלים שונים של בעלי חיים, מאריך הישרדות ומפחית את נטל הגידול14. נוגדנים אלה הנוצרים כנגד פפטיד PD-L1 יכולים לחסום בהצלחה את האינטראקציה PD1/PD-L1, ובכך לגרום לפעילות אנטי-ניאופלסטית. דו"ח זה מציג בדיקה המנתחת את המצור של היווצרות קומפלקס PD1/PD-L1 על ידי נוגדנים הנגרמים על ידי PDL1-Vaxx באמצעות פורמט מבוסס חרוזים מגנטיים עם קריאת כתב כפול במכשיר ציטומטריית זרימה.

Protocol

1. הכנה ניסיונית

הערה: הפרטים של כל הריאגנטים/ציוד המוזכרים בשלב זה מפורטים בטבלת החומרים.

  1. השג PD-1 אנושי רקומביננטי (rhPD-1; פוליהיסטידין-מתויג). יש לשחזר rhPD1 שעבר ליופיליזציה עם מלח חוצץ פוספט מסונן סטרילי (PBS), pH 7.4, לפני השימוש.
  2. השג PD-L1 אנושי רקומביננטי ביוטינילציה (rhPD-L1). יש לשחזר rhPD-L1 שעבר ליופיליזציה במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה לפני השימוש.
  3. השג מגיב זיהוי R-פיקואריתרין מצומד סטרפטווידין (SAPE). אחסנו את כל תמיסות SAPE המוגנות מפני אור בטמפרטורות מקרר (כלומר, 2-8°C).
  4. השג מיקרוספרות מגנטיות צבועות פלואורסצנטית (קוטר 6.5 מיקרומטר, פוליסטירן עם מגנטיט משובץ) ואת ערכת צימוד החרוזים15 (אם נעשה שימוש, ראה טבלת חומרים). צימוד קוולנטי למיקרוספרות דורש sulfo-NHS (sulfo-N-hydrosuccinimide) ו-EDC (N-[3-dimethylaminopropyl]-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride).
    הערה: ערכות חרוזים מגנטיים זמינות עם כל אחד מ-500 תגי פלורסנט ייחודיים, המאפשרים זיהוי ובידול בין ערכות חרוזים שונות16. חרוזים מוצעים בריכוזי מלאי של 2.5 × 10,6 חרוזים/מ"ל ו-12.5 × 10,6 חרוזים/מ"ל. אחסנו את החרוזים מוגנים מפני אור בטמפרטורות מקרר (כלומר, 2-8 מעלות צלזיוס). אין להקפיא את מתלי החרוזים.
  5. להשיג נוגדני בקרה חיוביים ושליליים ונוגדנים לזיהוי משני Brilliant Violet 421 (BV421). אחסנו את כל המולקולות המצומדות פלואורסצנטיות המוגנות מפני אור.
  6. בצע את כל תגובות הצימוד בצינורות קישור חלבונים נמוכים ואת כל תגובות הבדיקה בלוחות מיקרוטיטר בעלי קישור חלבון נמוך, תחתית עגולה, 96 בארות. אטמו את הצלחות ברדיד אלומיניום חד פעמי או בכיסויי מיקרו-צלחות מפלסטיק 96 בארות לשלבי הדגירה. השתמש במפריד לוחות מגנטי כדי לשתק את החרוזים במהלך שלבי שטיפת הבדיקה.
    הערה: מערכת ניתוח זרימת הדיווח הכפול כוללת שלושה לייזרים: (1) אחד המזהה ומכמת את הפלואורסצנטיות הספציפית לערכת החרוזים (ערוץ סיווג); (2) כזה שמזהה ומכמת את הפלואורסצנטיות של פיקואריתרין (PE) ספציפית למטרה (כתב ערוץ 1; עירור 532 ננומטר, פליטה "כתומה" 565-585 ננומטר); ו-(3) כזה שמזהה ומכמת את הפלואורסצנטיות BV421 הספציפית למטרה של ניתוח מטרה שנייה (כתב ערוץ 2; עירור 405 ננומטר, פליטה "כחולה" 421-441 ננומטר).

2. צימוד rhPD-1 לחרוזים מגנטיים

הערה: החלבון שיש להצמיד חייב להיות ללא אלבומין בסרום בקר (BSA), נתרן אזיד, גליצין, גליצרול, תריס(הידרוקסי-מתיל)אמינומתאן (Tris), או תוספים המכילים אמין, ויש להשהות אותו ב-PBS ב-pH 7.4. ערכת צימוד מסחרית זמינה הכוללת את כל הריאגנטים והמאגרים הדרושים המתוארים כאן (ראה טבלת חומרים).

  1. מוציאים את כל ריאגנטי הצימוד מהמקרר, ומאפשרים להם להתאזן לטמפרטורת החדר (RT, 18-22 מעלות צלזיוס) למשך 20-30 דקות.
  2. השהה מחדש את מיקרוספרות המלאי על ידי ערבול קצר, סוניקציה או סיבוב (15 דקות ב 15-30 סל"ד), על פי דף המידע של המוצר.
  3. העבר 1 × 106 חרוזים מגנטיים לצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון 1.5 מ"ל (ראה טבלת חומרים).
  4. לשטוף חרוזים עם 100 μL של חיץ הפעלה15: 0.1 M NaH2PO4 (monobasic), pH 6.2.
    הערה: ניתן לבצע צימוד גם באמצעות ערכת צימוד מוגדרת מראש, הכוללת 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0, כמאגר הפעלה וצימוד חלופי (ראה טבלת חומרים).
    1. מניחים את הצינור המכיל את החרוזים במפריד מגנטי למשך 1-2 דקות.
      הערה: לחלופין, ניתן להפריד את החרוזים באמצעות מיקרו-צנטריפוגה במשקל של ≥8,000 × גרם למשך 1-2 דקות.
    2. שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה מהחרוזים המשותקים מגנטית או כדורית כאשר הצינור עדיין ממוקם במפריד המגנטי.
    3. הסר את צינור המיקרוצנטריפוגה מהמגנט, והוסף 80 μL של חיץ צימוד (ראה טבלת חומרים).
    4. סובבו את צינור התגובה בעדינות, והפעילו צליל במשך 20 שניות כדי לפזר את החרוזים.
  5. הפעל את החרוזים עם sulfo-NHS ו- EDC.
    הערה: תמיסת המלאי של sulfo-NHS היא 50 מ"ג/מ"ל מומס במאגר ההפעלה. פתרון המלאי של EDC הוא גם 50 מ"ג / מ"ל מומס במאגר ההפעלה. גם מאגר ההפעלה וגם הלחות באטמוספירה גורמים להתפרקות EDC. לא מומלץ להשתמש בתמיסת EDC מאוחסנת. הכינו מספיק תמיסת EDC טרייה לפני השלב, והשתמשו בה מיד כשהפתרון מוכן. השליכו את תמיסת ה-EDC העודפת.
    אזהרה: EDC גורם לגירוי חמור בעיניים וגורם לגירוי בדרכי הנשימה ובעור.
    1. הוסף 10 μL של sulfo-NHS לצינור microfuge המכיל את החרוזים שטופים ופעילים.
    2. הוסף 10 μL של תמיסת מלאי EDC לצינור המיקרופוגה המכיל את החרוזים והסולפו-NHS.
    3. הגן על המיקרוספרות הרגישות לאור מפני אור, וסובב על המסובב במשך 20 דקות במהירות 15-30 סל"ד, ב- RT (18-22 ° C). לחלופין, הצינור יכול להישאר נייח במהלך שלב ההפעלה אם הוא מערבל בעדינות כדי להפיץ מחדש את החרוזים במרווחים של 10 דקות.
  6. שטפו ריאגנטים של צימוד עודף מהחרוזים.
    1. מניחים את הצינור המכיל את החרוזים המופעלים במפריד מגנטי למשך 1-2 דקות.
    2. שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה מחרוזים משותקים מגנטיים או כדוריים כאשר הצינור עדיין ממוקם במפריד המגנטי.
    3. הסר את צינור המיקרוצנטריפוגה מהמגנט, והוסף 100 μL של מאגר ההפעלה.
    4. מערבבים את צינור התגובה בעדינות כדי לפזר את החרוזים.
    5. חזור על שלבים 2.6.1-2.6.4 פעמיים נוספות ובסך הכל שלוש כביסות. בתום הכביסה, החרוזים יהיו תלויים ב 100 μL של חיץ הפעלה בריכוז משוער של 10 × 106 חרוזים / מ"ל.
  7. חברו את הפפטיד rhPD-1 לחרוזים הפעילים.
    1. הוסף 390 μL של מאגר הפעלה לצינור המכיל את החרוזים המופעלים כדי להביא את נפח מתלה החרוזים הכולל עד 490 μL.
    2. הוסף 1 מיקרוגרם של פפטיד PD-1 לתרחיף החרוזים המופעל על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של תמיסת פפטיד PD-1 (1 מ"ג/מ"ל מומס ב-PBS) לצינור המכיל את החרוזים המופעלים.
    3. מערבלים לזמן קצר את צינור המיקרוצנטריפוגה כדי להפיץ באופן אחיד את PD-1 ואת החרוזים המופעלים.
    4. דגרו על החרוזים עם PD-1 למשך שעתיים בחושך ב-RT (18-22°C) עם סיבוב (15-30 סל"ד).
  8. שטפו את החרוזים פעמיים (2x) באמצעות Assay/Wash Buffer (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05% Tween-20 + 0.05% NaN315).
    1. מניחים את הצינור המכיל את החרוזים המופעלים במפריד מגנטי למשך 1-2 דקות.
    2. שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה מהחרוזים המשותקים מגנטית או כדורית כאשר הצינור עדיין ממוקם במפריד המגנטי.
    3. הסר את צינור המיקרוצנטריפוגה מהמגנט, והוסף 100 μL של מאגר ההפעלה.
    4. מערבבים את צינור התגובה בעדינות כדי לפזר את החרוזים.
    5. חזור על שלבים 2.8.1-2.8.4 פעם אחת נוספת ובסך הכל שתי כביסות. בתום הכביסה, החרוזים יהיו תלויים ב 100 μL של חיץ הפעלה בריכוז של 10 × 106 חרוזים / מ"ל.
      הערה: ניתן לייצר את מאגר ה- Assay/Wash ללא נתרן אזיד (חומר משמר) אם המאגר אינו משמש גם כאמצעי אחסון.
    6. אחסנו את החרוזים המצומדים ל-rhPD-1 בחושך במקרר בטמפרטורה של 2-8°C אם לא נעשה בהם שימוש מיידי. חרוזים מצומדים לחלבון יציבים עד 18 חודשים.

3. הערכה של צימוד מוצלח של rhPD-1 לחרוזים

הערה: המיקרוספרות המצומדות ל-rhPD-1 מגיבות עם rhPD-L1 ביוטינילציה, שהאחרונה בהן מזוהה על ידי דגירה עם SAPE ואחריה הערכה של ציטומטר הזרימה. זה מוודא גם צימוד מוצלח של PD-1 לחרוזים המגנטיים וגם אינטראקציה פונקציונלית בין חלבוני rhPD-1 ו-rhPD-L1.

  1. צור סדרת דילול סדרתי כפול של rhPD-L1 ביוטינילציה ב-PBS-TBN (תמיסת rhPD-L1 היא 1 מ"ג/מ"ל). טווח הריכוז הסופי של rhPD-L1 שייבדק הוא תמיסה של 8 מיקרוגרם/מ"ל עד לתמיסה של 313 pg/mL. צור נפחים של 150 μL של כל דילול rhPD-L1: 50 μL לכל תגובה ושתי תגובות לכל מצב, בתוספת עודף מספיק כדי להכיל הפסדי צנרת.
    1. תייג את צינורות המיקרופוגה לדילול rhPD-L1 כ- 8 מיקרוגרם/מ"ל, 4 מיקרוגרם/מ"ל, 2 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל, 0.125 מיקרוגרם/מ"ל, 0.063 מיקרוגרם/מ"ל ו-0.031 מיקרוגרם/מ"ל. צינור 0 מיקרוגרם/מ"ל (PBS-TBN בלבד) משמש כבקרה ללא PD-L1.
    2. טען מראש 150 μL של PBS-TBN לכל צינורות הדילול rhPD-L1 המסומנים.
      הערה: הריכוז הסופי הגבוה ביותר של rhPD-L1 שייבדק הוא 8 מיקרוגרם/מ"ל, וה-rhPD-L1 ידולל ביחס של 1:1 בנוסף לתערובת התגובה, כך שצינור הדילול שכותרתו "8 מיקרוגרם/מ"ל" מתייחס לריכוז הסופי ולמעשה מכיל 16 מק"ג/מ"ל rhPD-L1. התוויות על כל צינורות הדילול מציינות את ריכוז rhPD-L1 הסופי לאחר הוספה לתגובה.
    3. צור את דילול rhPD-L1 בריכוז הגבוה ביותר (16 מיקרוגרם/מ"ל בפועל). זהו דילול דו-שלבי, פי 62.5 של תמיסת מלאי rhPD-L1 של 1 מ"ג/מ"ל (1,000 מיקרוגרם/16 מיקרוגרם = 62.5).
      1. שלב 84 μL של PBS-TBN עם 16 μL של תמיסת מלאי rhPD-L1 (1 מ"ג/מ"ל, כלומר, 1,000 μL) בצינור מיקרוצנטריפוגה. זהו דילול של פי 6.25, והריכוז המתקבל הוא 160 מיקרוגרם/מ"ל rhPD-L1.
      2. בצינור שכותרתו "8 מיקרוגרם/מ"ל", שלב 270 μL של PBS-TBN עם 30 μL של דילול rhPD-L1 שנוצר בשלב הקודם (160 מיקרוגרם / מ"ל). זהו דילול של פי 10, והריכוז המתקבל הוא למעשה 16 מיקרוגרם/מ"ל. תווית הצינור "8 מיקרוגרם/מ"ל" מתייחסת לריכוז הסופי שלה לאחר הוספה לתגובה.
    4. מעבירים 150 μL של דילול rhPD-L1 שנוצר בשלב 3.1.3 ("8 מיקרוגרם/מ"ל") לצינור "4 מיקרוגרם/מ"ל", סוגרים את מכסה צינור המיקרוצנטריפוגה ומערבלים לזמן קצר כדי לערבב את התמיסה.
    5. חזור על שלב 3.1.4 ברצף עד להשלמת סדרת הדילול rhPD-L1. לאחר היצירה, כל הצינורות בין "8 מיקרוגרם / מ"ל" ל "0.063 מיקרוגרם / מ"ל", כמו גם בקרת 0 מיקרוגרם / מ"ל, צריכים להכיל 150 מיקרוליטר של תמיסה, והצינור האחרון, "0.031 מיקרוגרם / מ"ל", צריך להכיל 300 מיקרוליטר של תמיסה. זה יוצר נפח מספיק של כל דילול כדי לבדוק 50 μL של כל דילול rhPD-L1 ביוטינילציה בתגובות כפולות, עם מספיק עודף שנותר כדי להכיל הפסדי צנרת.
  2. ספרו את החרוזים המצומדים ל-rhPD-1 באמצעות המוציטומטר17.
  3. דללו את מלאי החרוזים המצומדים rhPD-1 ל-5 × 104 חרוזים/מ"ל, עם נפח מספיק ל-2,500 חרוזים/50 מיקרוליטר/תגובה.
  4. מערבול את 5 × 104 חרוזים / מ"ל rhPD-1 - מתלה חרוזים מצומד, ופיפטה 50 μL של המתלה לתוך כל באר מסומן/ממופה של צלחת microtiter עגול 96 באר, כך שיש בארות כפולות שנוצרו עבור כל דילול rhPD-L1 כי נבדק.
  5. הוסף 50 μL של כל צינור דילול rhPD-L1 biotinylated שנוצר בשלב 3.1 לבארות המתאימות על צלחת microtiter.
  6. מכסים את צלחת המיקרוטיטר בנייר כסף חד פעמי או אוטם צלחת דבק פלסטיק, ודגרים על הצלחת למשך שעה אחת בחושך ב- RT (18-22 ° C) על שייקר מסלול (600 סל"ד).
  7. שטפו עודפי rhPD-L1 ביוטינילציה מהחרוזים.
    1. מעבירים את הצלחת האטומה מהשייקר האורביטלי למפריד הלוחות המגנטי למשך 2 דקות כדי לשתק את החרוזים.
    2. הסר בזהירות את אוטם הצלחת הדבק, ודא שהמגנט וצלחת המיקרוטיטר מחוברים היטב זה לזה, הפוך את הצלחת והשליך את הסופרנאטים לכיור או למיכל פסולת נוזלית מסוכנת ביולוגית, לפי הצורך. טפחו בעדינות אך במהירות על הצלחת ההפוכה על כרית של רקמת נייר סופגת כדי להסיר את שאריות הסופרנאטנט.
    3. הסר את צלחת המיקרוטיטר ממפריד הלוחות המגנטי, ופיפטה 150 μL של PBS-TBN לכל באר.
    4. מניחים את הצלחת הלא אטומה על המפריד המגנטי למשך 2 דקות כדי לשתק את החרוזים.
    5. ודאו שהמגנט וצלחת המיקרוטיטר מחוברים היטב זה לזה, הפכו את הצלחת והשליכו את הסופרנאטנטים לכיור או למיכל פסולת נוזלית מסוכנת ביולוגית, לפי הצורך. טפחו בעדינות אך במהירות על הצלחת ההפוכה על כרית של רקמת נייר סופגת כדי להסיר את שאריות הסופרנאטנט.
  8. חזור על שלבי שטיפת הצלחת 3.7.3-3.7.5 פעמיים ובסך הכל שלוש שטיפות עם 150 מיקרוליטר PBS-TBN כל אחת. ודאו שלא נשאר סופרנאטנט בבארות בסוף שלב השטיפה האחרון. עבוד בהתמדה כדי למנוע את התייבשות החרוזים המשותקים על קרקעית הבאר.
  9. הוסף מגיב זיהוי SAPE.
    1. דללו את תמיסת מלאי SAPE ב-PBS-TBN לריכוז עבודה של 6 מיקרוגרם/מ"ל. הכן נפח פתרון עבודה SAPE מספיק כך שכל בארות התגובה יוכלו לקבל 100 מיקרוליטר / באר, עם תוספת מספקת כדי להכיל הפסדי צנרת.
    2. הסר את צלחת המיקרוטיטר ממפריד הלוחות המגנטי.
    3. הוסף 100 μL של תמיסת עבודה SAPE לכל תגובה היטב, והשהה מחדש את החרוזים שטופים על ידי pipetting.
    4. אטמו את צלחת המיקרוטיטר בעלת 96 הקידוחים בעזרת רדיד אלומיניום או חותם צלחת דבק מפלסטיק, ודגרו במשך שעה אחת בחושך ב-RT (18-22°C) על שייקר אורביטלי ב-600 סל"ד.
    5. הסר את צלחת המיקרוטיטר מהאינקובטור, העבר אותה למפריד הלוחות המגנטי כדי לשתק את החרוזים, הסר את חותם הצלחת הדביק ושטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 150 μL PBS-TBN, כמתואר בשלבים 3.7.3-3.7.5.
    6. לאחר הסרת השטיפה הסופית, הסר את הצלחת ממפריד הלוחות המגנטי, והשהה מחדש את החרוזים ב -100 מיקרוליטר של PBS-TBN לכל באר.
  10. נתח את התוצאות.
    1. קרא את הלוח במכשיר ניתוח הזרימה (ראה טבלת חומרים) כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) של כל תגובה באמצעות הגדרות המכשיר הבאות: נפח שאיפה = 50 μL; ספירת חרוזים מינימלית = 100 חרוזים; הגדרת פסק זמן = 40 שניות; gating = 7,000-17,000; מצב הפעלה = מדווח יחיד. בארות כפולות מופעלות עבור כל תנאי, ושני ערכי MFI הפלט עבור כל תנאי ממוצעים לפני ביצוע חישוב נתונים נוסף וגרפים.
      הערה: ערך ה-MFI של כל דילול צריך להראות קשירה תלוית ריכוז, המציינת יעילות צימוד מקובלת של rhPD-1 לחרוזים ומאשרת אינטראקציה טובה של חלבוני PD-1/PD-L1 רקומביננטיים.

4. בדיקת חסימת PD-1/PD-L1 מבוססת חרוזים מגנטיים PD-1/PD-L1

הערה: בדיקה זו מעריכה את פעילות החסימה של מתווכים מסיסים (למשל, נוגדנים נגד PDL1-פפטידים) באינטראקציות רקומביננטיות PD1/PD-L1. בקצרה, rhPD-L1 ביוטינילציה מודגר מראש עם נוגדנים שנוצרו בארנבים לאחר חיסונים פפטידים שונים PDL1-Vaxx. תערובת הנוגדנים rhPD-L1 + anti-PDL1 נלכדת לאחר מכן באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדים ל-rhPD-1, והקישור של rhPD-L1 לחרוזים המצומדים ל-rhPD-1 מכומת על ידי תוספת של סטרפטווידין-PE. אות פלואורסצנטיות PE נמצא בקורלציה הפוכה עם הפעילות החוסמת של נוגדנים/מעכבי PDL1 שנבדקו. קשירת נוגדנים אנטי-PDL1-פפטיד מוערכת בו זמנית על ידי קשירה של נוגדן אנטי-ארנב מצומד BV421 (לנוגדנים נגד PDL1-פפטידים) או אנטי-אנושי (לנוגדני בקרה) משני ועל ידי הערכת הפלואורסצנטיות BV421 בערוץ השני של המכשיר. שלבי הבדיקה מפורטים באופן ציורי באיור 1.

  1. הכינו סדרת דילול סדרתי כפולה של נוגדני הבדיקה, כולל מועמדים לנוגדנים רב-שבטיים המושרים על ידי PDL1-Vaxx, נוגדן בקרה שלילי (trastuzumab, Herceptin, נוגדן חד-שבטי אנטי-HER2 אנושי), ונוגדן בקרה חיובי (atezolizumab; נוגדן חד-שבטי אנטי-PDL1 IgG1 אנושי). כל תגובה תשתמש ב-25 μL של דילול הנוגדנים שהוקצה, כך שהנפחים המוצגים מספיקים לביצוע כל תגובה בבארות כפולות לכל מצב (כלומר, 50 μL לכל מצב), עם עודף מסוים שנותר כדי להכיל הפסדי צנרת.
    1. עבור כל נוגדן נגד PDL1-פפטיד המושרה על ידי חיסון ונוגדן בקרה, יש לוודא כי טווח ריכוזי הנוגדנים הסופיים שנבדקו הוא בין 1,000 מיקרוגרם/מ"ל עד 8 מיקרוגרם/מ"ל. הכינו תמיסות מלאי של כל הנוגדנים במינון של 2,000 מיקרוגרם/מ"ל.
    2. עבור כל נוגדן, יש לסמן את צינורות הדילול כ-1,000 מיקרוגרם/מ"ל, 500 מיקרוגרם/מ"ל, 250 מיקרוגרם/מ"ל, 125 מיקרוגרם/מ"ל, 63 מיקרוגרם/מ"ל, 31 מיקרוגרם/מ"ל, 16 מיקרוגרם/מ"ל ו-8 מיקרוגרם/מ"ל, ולכלול את שם הנוגדן. עבור כל נוגדן, הוסף גם צינור "0 מיקרוגרם / מ"ל", אשר יהיה בקרת הרכב בלבד (PBS-TBN).
      הערה: כאשר מוסיפים לתערובת התגובה, ריכוז הנוגדנים יהיה מדולל ביחס של 1:1. צינורות דילול הנוגדנים מסומנים כריכוז הנוגדנים הסופי לאחר תוספת לתגובה ולמעשה מכילים כמות נוגדנים כפולה מזו המסומנת.
    3. הוסף 75 μL של PBS-TBN לכל צינורות דילול הנוגדנים המסומנים "500 מיקרוגרם/מ"ל" ומטה, כולל צינורות הבקרה "0 מיקרוגרם/מ"ל" לרכב בלבד.
    4. עבור כל נוגדן, פיפטה 150 μL של 2,000 מיקרוגרם / מ"ל תמיסת מלאי לתוך הצינור המתאים שכותרתו "1,000 מיקרוגרם / מ"ל". זה ישמש כדי להפוך את כל דילולים הבאים עבור כל נוגדן.
    5. עבור כל נוגדן, ליצור סדרת דילול מלאה על ידי העברת פיפטה 75 μL מצינור "1,000 מיקרוגרם / מ"ל" אל הצינור עם הדילול התחתון הבא בסדרה (כלומר, "500 מיקרוגרם / מ"ל"). סגור את צינור הדילול שזה עתה הושלם, מערבל אותו לזמן קצר, והמשך בבניית סדרת הדילול על ידי העברת 75 מיקרוליטר מצינור "500 מיקרוגרם / מ"ל" לצינור "250 מיקרוגרם / מ"ל". חזור על דפוס זה עד לדילול האחרון, "8 מיקרוגרם / מ"ל", נעשה עבור כל הנוגדנים.
      הערה: בסדרת הדילול שהושלמה עבור כל נוגדן, צריך להיות נפח של 75 μL עבור כל הצינורות למעט הדילול הנמוך ביותר, 8 מיקרוגרם / מ"ל, אשר אמור להכיל נפח של 150 μL. כל תגובה תשתמש ב-25 μL של דילול נוגדנים, כך שנפחים אלה מספיקים לביצוע כל תגובה בבארות כפולות לכל מצב (כלומר, 50 μL לכל מצב), עם תוספת כדי להתאים להפסדי צנרת.
  2. מניחים 25 μL של נוגדנים מדוללים לתוך בארות ייעודיות של צלחת microtiter 96 באר.
  3. לדלל rhPD-L1 ביוטינילציה לריכוז עבודה של 4 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS-TBN בנפח מספיק כדי לכלול 25 מיקרוליטר בבארות כפולות לכל מצב (כלומר, 50 מיקרוליטר לכל תנאי), עם תוספת כדי להתאים להפסדי צנרת.
    הערה: בעבודה זו, rhPD-L1 ביוטינילציה במינון 4 מיקרוגרם/מ"ל הביא לכ-50% מאות ה-MFI המרבי שנמדד בהערכת הצימוד הקודמת ושימש לניתוח חסימת PD-1/PD-L1.
  4. הוסף 25 μL של rhPD-L1 ביוטינילציה (4 מיקרוגרם / מ"ל) לכל תגובה היטב, כסה את צלחת המיקרוטיטר עם רדיד אלומיניום או אטם דבק פלסטיק, ודגר ב RT (18-22 ° C) במשך 1 שעה עם ניעור על שייקר צלחת מסלולית ב 600 סל"ד.
  5. דללו את החרוזים המצומדים ל-rhPD-1 ל-50,000 חרוזים/מ"ל, עם נפח מספיק ל-50 מיקרוליטר/באר (2,500 חרוזים/באר) בתוספת תוספת כדי להכיל הפסדי צנרת.
  6. הסר את לוחית תגובת המיקרוטיטר בעלת 96 הבארות מהשייקר, והסר את אטם הצלחת הדבק.
  7. הוסיפו 50 μL של תערובת החרוזים המצומדת rhPD-1 לכל באר.
  8. אטמו את הצלחת ודגרו במשך שעה בחושך ב-RT (18-22 מעלות צלזיוס) על שייקר מסלול ב-600 סל"ד.
  9. מעבירים את הצלחת האטומה מהשייקר האורביטלי למפריד הלוחות המגנטי למשך 2 דקות כדי לשתק את החרוזים.
  10. הסר בזהירות את אוטם הצלחת הדבק, ודא שהמגנט וצלחת המיקרוטיטר מחוברים היטב זה לזה, והפוך את הצלחת וזרוק את הסופרנאטנטים. טפחו בעדינות על הצלחת ההפוכה על כרית של רקמת נייר סופגת כדי להסיר עודפי עודף.
  11. לשטוף ריאגנטים תגובה עודף מן החרוזים.
    1. הסר את צלחת המיקרוטיטר ממפריד הלוחות המגנטיים, והוסף 150 μL של PBS-TBN לכל באר.
    2. הניחו את צלחת המיקרוטיטר על מפריד הלוחות המגנטי למשך 2 דקות כדי לשתק את החרוזים.
    3. אשרו שהמגנט וצלחת המיקרוטיטר מחוברים היטב זה לזה, הפכו את הצלחת וזרקו את הסופרנאטנטים. טפחו בעדינות על הצלחת ההפוכה על כרית של רקמת נייר סופגת כדי להסיר עודפי עודף.
  12. חזור על שלבי שטיפת הצלחת 4.11.1-4.11.3 פעמיים, ובסך הכל שלוש שטיפות עם PBS-TBN. ודא שמגיב SAPE מוכן (להלן) לפני הסרת תמיסת הכביסה הסופית (השלישית).
  13. הוסף את מגיב זיהוי SAPE.
    1. לדלל את תמיסת מלאי SAPE לריכוז עבודה של 6 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS-TBN; צור נפח מספיק עבור 100 μL / באר, בתוספת תוספת כדי להתאים הפסדי צנרת.
    2. הוסף 100 μL / באר של תמיסת עבודה SAPE לתוך כל תגובה היטב, ו resuspend את החרוזים על ידי pipetting.
    3. אטמו את הצלחת ודגרו במשך שעה בחושך ב-RT (18-22 מעלות צלזיוס) על שייקר מסלול ב-600 סל"ד.
  14. לרוקן את עודף SAPE מן התגובה.
    1. מעבירים את הצלחת האטומה מהשייקר האורביטלי למפריד הלוחות המגנטי למשך 2 דקות כדי לשתק את החרוזים.
    2. הסר בזהירות את חותם הצלחת הדבק, ודא שהמגנט וצלחת המיקרוטיטר מחוברים היטב זה לזה, והפוך את הצלחת וזרוק את הסופרנטנט. טפחו בעדינות על הצלחת ההפוכה על כרית של רקמת נייר סופגת כדי להסיר את הסופרנאטנט המכיל עודפי SAPE.
  15. שטפו את עודפי ה-SAPE מהחרוזים.
    1. הסר את צלחת המיקרוטיטר ממחזיק הלוח המגנטי.
    2. הוסף 150 μL של PBS-TBN לכל באר כדי להשעות מחדש את החרוזים.
    3. הניחו את צלחת המיקרוטיטר על מפריד הלוחות המגנטי למשך 2 דקות כדי לשתק את החרוזים.
    4. אשרו שהמגנט וצלחת המיקרוטיטר מחוברים היטב זה לזה, הפכו את הצלחת וזרקו את הסופרנטנט. טפחו בעדינות על הצלחת ההפוכה על כרית של רקמת נייר סופגת כדי להסיר עודפי עודף.
  16. בצעו שני שלבי שטיפה נוספים עם PBS-TBN במשך שלוש שטיפות בסך הכל על ידי חזרה על שלבים 4.15.1-4.15.4. הכינו את נוגדני הזיהוי המשני BV421 (השלב הבא) לפני הסרת תמיסת השטיפה הסופית (השלישית).
  17. הוסף את הנוגדנים המשניים BV421-congugated.
    1. IgG אנטי-אנושי מדולל BV421 (לגילוי נוגדני בקרה אנושיים) ונוגדני BV421-congugated anti-rabbit IgG (לגילוי נוגדנים רב-שבטיים המושרים על ידי PDL1-Vaxx) (ראה טבלת חומרים) 1:400 ב-Wash/Assay Buffer בנפחים המספיקים לשימוש ב-100 μL/well מכל אחד, עם תוספת כדי להכיל הפסדי צנרת.
    2. הוסף 100 μL של IgG אנטי-אנושי מצומד BV421 מצומד או BV421-מצומד נגד ארנב IgG לבארות המתאימות.
    3. אטמו את הצלחת ודגרו במשך שעה בחושך ב-RT (18-22 מעלות צלזיוס) על שייקר מסלול ב-600 סל"ד.
  18. דקנט את עודף נוגדנים משניים מצומדים BV421 מן החרוזים.
    1. מעבירים את הצלחת האטומה מהשייקר האורביטלי למפריד הלוחות המגנטי למשך 2 דקות כדי לשתק את החרוזים.
    2. הסר בזהירות את חותם הצלחת הדבק, ודא שהמגנט וצלחת המיקרוטיטר מחוברים היטב זה לזה, והפוך את הצלחת וזרוק את הסופרנטנט. טפחו בעדינות על הצלחת ההפוכה על כרית של רקמת נייר סופגת כדי להסיר את הסופרנאטנט המכיל עודף נוגדנים משניים מצומדים BV421.
  19. לשטוף את עודף BV421-conjugated נוגדנים משניים מן החרוזים.
    1. הוסף 150 μL של PBS-TBN לכל באר כדי להשעות מחדש את החרוזים.
    2. הניחו את צלחת המיקרוטיטר על מפריד הלוחות המגנטי למשך 2 דקות כדי לשתק את החרוזים.
    3. אשרו שהמגנט וצלחת המיקרוטיטר מחוברים היטב זה לזה, הפכו את הצלחת וזרקו את הסופרנטנט. טפחו בעדינות על הצלחת ההפוכה על כרית של רקמת נייר סופגת כדי להסיר עודפי עודף.
  20. בצע שלושה שלבי שטיפה נוספים עם PBS-TBN עבור ארבע שטיפות בסך הכל על-ידי חזרה על שלבים 4.19.1-4.19.3.
  21. לאחר הסרת חיץ הכביסה האחרון (הרביעי), הסר את צלחת המיקרוטיטר ממפריד הלוחות המגנטי, והשהה מחדש חרוזים ב- 100 μL PBS-TBN / היטב עם פיפטר.
  22. נתח את התוצאות.
    1. קרא את הלוח במערכת ניתוח זרימת הדיווח הכפול כדי לקבוע את ה- MFI של כל תגובה באמצעות הגדרות המכשיר הבאות: נפח שאיפה = 50 μL; ספירת חרוזים מינימלית = 100 חרוזים; הגדרת פסק זמן = 40 שניות; גידור: 7,000-17,000; מצב הפעלה = Dual Reporter.
    2. באמצעות מערכת הדיווח הכפול, ודא כי כתב ערוץ 1 מודד את פלואורסצנטיות PE הכתומה (כמות rhPD-L1 המחוברת לחרוזים מצומדים rhPD-1) וכתב ערוץ 2 מודד את הפלואורסצנטיות הכחולה BV421 (כמות הנוגדן החוסם המחובר הקשור ל- rhPD-L1).
    3. הפעל בארות כפולות עבור כל תנאי, ובצע ממוצע של שני ערכי MFI של פלט עבור כל תנאי לפני ביצוע חישוב נתונים נוסף וגרפים.
    4. תקנן את ערך ה- MFI של כל דגימה לבקרה השלילית, וחשב את אחוז העיכוב עבור כל דגימה:
      Inhibition% = (100 × [Negative Control MFI − Sample MFI])/Negative Control MFI
      הערה: ערכי MFI של הבקרה השלילית (ללא עיכוב) הם הערכים הגבוהים ביותר; האות המאוגד PD-L1 MFI הוא 100%, והעיכוב של קישור rhPD-L1 ל- rhPD-1 מוגדר כ- 0%.

Figure 1
איור 1: סכמטי של בדיקת המצור PD-1/PD-L1 בעלת הדיווח הכפול. PD-L1 אנושי רקומביננטי ביוטינילציה (rhPD-L1) מודגר מראש עם נוגדנים נבחרים נגד PDL1-Vaxx המושרה על ידי PDL1 לפני שילובו עם חרוזים מגנטיים מצומדים ל-rhPD-1 כדי לאפשר היווצרות קומפלקס נקודות ביקורת PD-1/PD-L1. לאחר מכן מזוהה rhPD-L1 מורכב ומסומן על ידי תוספת של פיקואריתרין מצומד סטרפטווידין (SAPE, פלואורופור כתום). נוגדנים נגד אפיטופים PDL1-Vaxx מכוונים ל-rhPD-L1 שמורכב ל-rhPD-1 בהצמדה מוקדמת לחרוזים המגנטיים, והם מוארים באמצעות נוגדן משני מצומד 421 סגול מבריק (BV421, פלואורופור כחול). הן rhPD-L1 ביוטינילציה המורכב לאות PD-1 (אות PE) והן נוגדנים נגד PDL1 המזהים וקושרים את אות rhPD-L1 (BV421) מנותחים בו זמנית באמצעות מכשיר ציטומטרי זרימה דו-דיווחי החוקר דגימות עבור שני הפלואורופורים בשני ערוצי דיווח נפרדים. ערכי הפלט עבור כל דגימה הם עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית של כל פלואורופור. לאחר מכן, העיכוב של היווצרות קומפלקס PD1/PD-L1 על ידי נוגדנים שונים הנגרמים על ידי PDL1-Vaxx הוא אקסטרפולציה על ידי השוואת אותות הניסוי לאלה שנוצרו באמצעות נוגדן חד-שבטי שלילי שאינו קושר rhPD-L1 (עיכוב 0%). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Representative Results

המחקר הצליח לכמת במדויק את עיכוב האינטראקציה PD-1/PD-L1 על ידי ארבעה נוגדנים רב-שבטיים ייחודיים, שנוצרו כנגד פפטידים של חיסון rhPD-L1, הנחקרים כסוכנים טיפוליים פוטנציאליים לסרטן. הסכימה של בדיקה זו מוצגת באיור 1. כמות rhPD-L1 ביוטינילציה שנקשרו לחרוזים מצומדים של rhPD-1 ועיכוב הקישור הזה על-ידי ארבעת המועמדים לנוגדנים המושרים על-ידי PLD1-Vaxx נמדדו בערוץ 1 באמצעות מגיב זיהוי סטרפטווידין-PE שקשר ישירות את rhPD-L1 (איור 2).

כל ארבעת הנוגדנים הרב-שבטיים נגד PDL1-פפטיד חסמו את האינטראקציה של rhPD-L1 עם PD-1 שהושתקה במיקרוספרות במידה משתנה. אחוז העיכוב של נוגדנים שונים נגד PDL1 פפטיד נע בין 48% ל 74% בריכוז הנבדק המרבי של 1,000 מיקרוגרם / מ"ל. הנוגדן החד-שבטי החיובי atezolizumab השיג חסימה של 92% של האינטראקציה PD-1/PD-L1 בריכוז המרבי שנבדק14 מתוך 4 מיקרוגרם/מ"ל (איור 2). כל נוגדני PDL1-Vaxx הניסיוניים הראו עיכוב תלוי ריכוז של קישור rhPD-L1 לחרוזים מצומדים של rhPD-1 בהשוואה לטרסטוזומאב, נוגדן הבקרה השלילי שלא היה צפוי לקיים אינטראקציה עם מערכת PD-1/PD-L1.

Figure 2
איור 2: חסימה של אינטראקציה של rhPD-L1 עם rhPD-1 המצומדת לחרוזים מגנטיים על-ידי נוגדנים נגד PDL1-פפטידים, כפי שמוצג על-ידי מערכת חיסון חדשה המבוססת על חרוזים פלואורסצנטיים. PD-1 אנושי רקומביננטי הוצמד למיקרוספרות מגנטיות, והחרוזים הודגרו עם rhPD-L1 ביוטינילציה שהודגרה מראש עם נוגדנים שונים נגד PDL1-פפטידים. נעשה שימוש בריאגנט לזיהוי סטרפטווידין-פיקואריתרין כדי לקשור את הביוטין, ובכך להעריך את הכמות היחסית של rhPD-L1 שהייתה זמינה להיקשר ל-PD-1. נוגדנים רב-שבטיים שגודלו בארנבים כנגד חיסוני פפטיד PDL1 (אנטי-PDL1[36], אנטי-PDL1[50], אנטי-PDL1[95] ואנטי-PDL1[130]) נבדקו לפעילות מעכבת והראו חסימה של 48%-74% של אינטראקציות רקומביננטיות PD-1/PD-L1 בריכוז הגבוה ביותר שנבדק. Atezolizumab (נוגדן חד שבטי שונה נגד PDL1) שימש כבקרה חיובית. הנוגדן החד-שבטי המסחרי הלא קשור trastuzumab (anti-HER2) שימש כבקרה שלילית. איור זה נלקח מ Guo et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: קשירה השוואתית של נוגדנים שונים הנגרמים על-ידי PDL1-Vaxx ל-rhPD-L1 המורכבים לחרוזים מגנטיים מצופים rhPD1. נוגדן זיהוי משני סגול מבריק 421-מצומד שימש להשוואת הקישור של נוגדנים רב-שבטיים שונים נגד PDL1-peptide ארנב ל- rhPD-L1 באמצעות חרוזים מצופים rhPD-1. אות הפלואורסצנטיות הכחול BV421 הוקלט בערוץ 2 של מכשיר הכתב הכפול; אות זה מתואם עם יעילות הקישור היחסית של נוגדנים ניסיוניים נגד PDL1-פפטידים. Trastezumab (anti-HER2), נוגדן חד-שבטי המכוון לנקודת ביקורת שונה מ-PD-1/PD-L1, שימש כביקורת שלילית. MFI מייצג את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית הממוצעת של חרוזים, שנמדדה בבארות תגובה כפולות לכל מצב. איור זה נלקח מ Guo et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

היכולות היחסיות של ארבעת הנוגדנים המועמדים הניסיוניים PDL1-Vaxx לקשור rhPD-L1 הושוו באמצעות מערכת זיהוי נפרדת (BV421-conjugated anti-rabbit IgG) שהוערכה בערוץ הכתבים השני של המכשיר. התוצאות האלה הצביעו על כך שכל ארבעת הנוגדנים הרב-שבטיים נגד PDL1-פפטיד קשורים ל-rhPD-L1 באופן תלוי ריכוז14 (איור 3). הנוגדן נגד PDL1(130) הראה את אות הקישור הגבוה ביותר של rhPDL1 מבין ארבעת המועמדים לנוגדנים הנגרמים על ידי PDL1-Vaxx.

Discussion

מטרת האימונותרפיה לסרטן הקשורה לנקודות ביקורת היא לשבש את האינטראקציה בין חלבוני נקודת ביקורת לבין הליגנדות החשובות שלהם בהישרדות הגידול ובהתקדמותו2. קבוצת מחקר זו מפתחת באופן פעיל חיסונים חדשניים נגד PD-1 ו-PD-L1 המעוררים תגובת נוגדנים המכוונת וקוטעת את מחסום PD-1/PD-L1 3,8,13,14. בעבר, בוצעו שתי וריאציות של בדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISAs) כדי להעריך את ההשפעות של נוגדנים נגד PDL1-פפטיד על עיכוב האינטראקציה הרקומביננטית PD1/PD-L114. (1) בווריאנט הראשון, rhPD-L1 היה מצופה על צלחת מיקרוטיטר, ואז הצלחת הודגרה בנוגדנים מדוללים נגד PDL1 המועמדים לחיסון המושרה על ידי מועמדים. עיכוב האינטראקציה הרקומביננטית PD-1/PD-L1 על ידי הנוגדנים הוערך לאחר מכן על ידי הוספת rhPD-1 ביוטינילציה וכימות הקישור ל- rhPD-L1 המשותק באמצעות מצומד פרוקסידז סטרפטווידין-חזרת ומצע קולורימטרי. הגדרנו את זה כמבחן הסגר הישיר. (2) בגרסה השנייה, PD-1 היה מצופה על לוח המיקרוטיטר. rhPD-L1 ביוטינילציה הודגר מראש עם כל אחד מהנוגדנים הרב-שבטיים המועמדים ל-PLD1 בצינורות תגובה נפרדים. תערובות rhPDL1/anti-PDL1 נוספו לאחר מכן לבארות הצלחת שהכילו rhPD-1 משותק והורשו להגיב. כל rhPDL1 שהגיב עם rhPD-1 המשותק בנוכחות נוגדנים PDL1-Vaxx שעלולים לחסום זוהה עם סטרפטווידין-HRP ודגירה של מצע קולורימטרי. הגדרנו את זה כמבחן הסגר ההפוך.

המצור ההפוך של האינטראקציה הרקומביננטית PD-1/PD-L1 על ידי נוגדנים נגד PDL1-פפטיד הראה עיכוב של האות (כלומר, חסימה PD-1/PD-L1) באופן תלוי ריכוז נוגדנים14, בעוד שגישת החסימה הישירה לא סיפקה תוצאות עקביות (לא מוצגות). בדיקת חסימת הדיווח הכפול מבוססת החרוזים פותחה כדי לאמת את תוצאות ELISA ולחקור את המצור של אינטראקציית PD-1/PD-L1 בפאזה נוזלית, אשר מבטלת את בעיות זמינות האפיטופ הסטריות / קושרות פוטנציאליות הקשורות לשיתוק חלבונים רקומביננטיים על קרקעית באר. ניתוח המיקרוספירה נמצא בקורלציה ישירה עם תוצאות חסימת ELISA באמצעות בדיקת המצור ההפוך (איור 2). בנוסף, בדיקות חיסוניות מבוססות פלואורסצנטיות יכולות לספק רגישות משופרת לבדיקה וטווח דינמי מורחב בהשוואה ל- ELISAs18 קולורימטריים, ויתר על כן, הבדיקה מבוססת החרוזים המרובבים מאפשרת ביצוע בו-זמני של שתי בדיקות חיסוניות עצמאיות בתגובה אחת. הסולפו-NHS וה-EDC המשמשים לצימוד קוולנטי של המיקרוספרות ל-rhPD-1 עשויים היו להוביל להבדלי הביצועים שנצפו בין מבחני הסגר הישיר והמצור ההפוך לבין ההבדלים שנצפו ברגישות בין מבחני האינטראקציה הרקומביננטיים PD-1/PD-L1 מבוססי החרוזים של ELISA ו-Luminex. יש צורך בחקירה נוספת ברמה הכימית והמולקולרית כדי לחקור את המנגנונים האפשריים האחראים להבדלים אלה.

הן ELISA14 והן הבדיקות מבוססות החרוזים מראות כי נוגדנים נגד PDL1-Vaxx המושרים על ידי PDL1 יכולים לעכב היווצרות קומפלקס נקודות ביקורת PD1/PD-L1. PDL1-Vaxx מבוסס הפפטיד משרה בהצלחה נוגדנים נגד PDL1 שיכולים לחסום את האינטראקציה PD-1/PD-L1. גישה זו עשויה לשמש כאסטרטגיה טיפולית חדשנית לטיפול בסרטן, כפי שנתמך על ידי מחקרים פרה-קליניים בבעלי חיים 3,13,14. ניסויים קליניים מתוכננים יקבעו את היעילות של PDL1-Vaxx עבור אימונותרפיה של נקודות ביקורת ובקרת מחלות בחולי סרטן.

Disclosures

Pravin T.P. Kaumaya הוא יועץ Imugene, Ltd.

Acknowledgments

המחברים מודים לשרי דנבר PhD, MBA של Luminex Corporation (אוסטין, טקסס) על התמיכה במחקר ומתיו סילברמן PhD של פתרונות הוצאה לאור ביו-רפואיים (פנמה סיטי, פלורידה; mattsilver@yahoo.com) על סיוע מדעי וכתיבה. עבודה זו נתמכה על ידי פרסים Pravin T. P. Kaumaya מהמכונים הלאומיים לבריאות (R21 CA13508 ו- R01 CA84356) ו- Imugene Ltd, סידני, אוסטרליה (OSU 900600, GR110567 ו- GR124326).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffers
Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2 Millipore/Sigma S3139
Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3) Millipore/Sigma P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)
Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0 MilliporeSigma  M2933
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 77149
xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes: Luminex Corp.  (Austin, TX) 40-50016
EDC, 10 mg 
sNHS solution, 250 µL
Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0
Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 24510
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies
xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument) Luminex Corp.  (Austin, TX) INTELLIFLEX-DRSE-RUO
Low protein-binding round bottom 96-well plate ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 07-200-761
Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)  Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0269-01
Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable) Luminex Corp.  (Austin, TX) CN-0288-01
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp.  (Austin, TX) MC-1**** (varies by bead label)
Protein LoBind microcentrifuge tubes ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) 022431081
Peptides, Antibodies, & Detection Reagents
Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)
Biotinylated recombinant human PDL1  Sino Biological (Wayne, PA) 10084-H49H-B
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 709-675-149
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) 711-675-152
Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged) Acro Biosystems (Newark, DE) PD1-H5256 
Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE) Agilent (Santa Clara, CA) PJRS34-1
Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control Genentech/Roche (San Francisco, CA) n/a (prescription medications)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaumaya, P. T. B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine. Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).
  2. Pandey, P., et al. Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4. Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).
  3. Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys). Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).
  4. Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity. Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).
  5. Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).
  6. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  7. Kaumaya, P. T. A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).
  8. Guo, L., Kaumaya, P. T. P. First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations. British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).
  9. Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine. Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).
  10. Dakappagari, N. K., et al. Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).
  11. Kaumaya, P. T., et al. Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).
  12. Bekaii-Saab, T., et al. Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors. Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).
  13. Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model. Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).
  14. Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx). Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).
  15. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition. , Available from: https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022).
  16. MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation. , Available from: https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview (2014).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
  18. Gibbs, J., Vessels, M., Rothenberg, M. Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc. , Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf (2019).

Tags

חרוז פלואורסצנטי מגנטי ניתוח זרימת דיווח כפול חיסון פפטיד PDL1-Vaxx חסימת נוגדנים אינטראקציה PD-1/PD-L1 קולטני נקודות ביקורת נוגדנים חד שבטיים ניסויים קליניים חולי סרטן אימונותרפיה לסרטן אסטרטגיות טיפוליות אפיטופ פפטיד של תאי B חיסון סרטן PDL1 בדיקות פרה-קליניות נוגדנים אימונוגניים נטל גידול שיעורי הישרדות מנגנוני פעולה בדיקה מבוססת חרוזים מגנטיים
ניתוח זרימת דיווח כפול מבוסס חרוזים פלואורסצנטיים מגנטיים של חסימת נוגדנים המושרה על ידי חיסון PDL1-Vaxx של אינטראקציה PD-1/PD-L1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Overholser, J., Guo, L., Kaumaya, P. … More

Overholser, J., Guo, L., Kaumaya, P. T. P. Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction. J. Vis. Exp. (197), e65467, doi:10.3791/65467 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter