يصف هذا البروتوكول زراعة الخلايا للخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط البشري ، يليها تلطيخ مناعي وتوليد ملامح النمط الظاهري للخلايا العصبية من الصور المجهرية عالية المحتوى المكتسبة مما يسمح بتحديد الاختلافات المظهرية بسبب التحويرات الجينية أو الكيميائية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التنميط الظاهري للخلايا العصبية الدوبامينية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية في الدماغ المتوسط
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يرتبط مرض باركنسون (PD) بمجموعة من العمليات البيولوجية الخلوية التي تسبب فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA). تفتقر العديد من النماذج الخلوية PD الحالية في المختبر إلى التعقيد ولا تأخذ في الاعتبار الأنماط الظاهرية المتعددة. يمكن أن يعالج التنميط الظاهري في الخلايا العصبية mDA المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) التي يسببها الإنسان أوجه القصور هذه عن طريق قياس مجموعة من الأنماط الظاهرية العصبية في وقت واحد في نوع الخلية ذات الصلة PD بالتوازي. هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على ملفات تعريف النمط الظاهري وتحليلها من الخلايا العصبية mDA البشرية المتاحة تجاريا. يتم استخدام لوحة تلطيخ الفلورسنت الخاصة بالخلايا العصبية لتصور الأنماط الظاهرية ذات الصلة بالبروتين النووي ، α-synuclein ، هيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 (MAP2). بروتوكول التنميط الظاهري الموصوف قابل للتطوير لأنه يستخدم ألواح 384 بئرا ومعالجة السوائل التلقائية والفحص المجهري عالي الإنتاجية. تتمثل فائدة البروتوكول في استخدام الخلايا العصبية mDA المانحة السليمة والخلايا العصبية mDA التي تحمل طفرة G2019S المرتبطة ب PD في جين كيناز 2 (LRRK2) الغني بالليوسين. تمت معالجة كلا خطي الخلايا بمثبط كيناز LRRK2 PFE-360 وتم قياس التغيرات الظاهرية. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيف يمكن تحليل ملفات تعريف النمط الظاهري متعددة الأبعاد باستخدام طرق التصنيف الخاضعة للإشراف القائمة على التجميع أو التعلم الآلي. سيثير البروتوكول الموصوف اهتمام الباحثين الذين يعملون على نمذجة الأمراض العصبية أو دراسة تأثيرات المركبات الكيميائية في الخلايا العصبية البشرية.
المقدمة
يتم إزعاج مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية الخلوية في مرض باركنسون (PD). على سبيل المثال ، ارتبط الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، والإجهاد التأكسدي ، وعيوب تحلل البروتين ، وتعطيل الاتجار الحويصلي ووظيفة الليزوزومات الداخلية بفقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA) ، ويلاحظ بشكل شائع في PD1. لذلك ، يبدو أن مرض باركنسون ينطوي على آليات مرضية متعددة يمكن أن تتفاعل مع بعضها البعض وتزيد من تفاقمها. تتمثل إحدى الطرق المفيدة للتحقيق في هذا التفاعل الميكانيكي في إنشاء بصمة مظهرية شاملة أو ملف تعريف للخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA).
التنميط الظاهري هو نهج يتضمن إنشاء ملف تعريف لعينة بن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحضير الوسط والألواح لبذر الخلايا العصبية (اليوم الأول)
- لتحضير الأطباق لبذر الخلايا العصبية في اليوم 1 ، قم بتسخين اللامينين إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام مباشرة. تحضير محلول Laminin عن طريق تخفيف محلول مخزون Laminin (0.1 مجم / مل) 1/10 في PBS +/+ البارد (مع Ca 2+ و Mg2+).
ملاحظة: جميع الكواشف مدرجة في جدول المواد. يتم وصف تركيبات الحلول والمخازن المؤقتة في الجداول 1-4. - بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولتر من محلول Laminin إلى كل بئر من لوحة Poly-D-Lysine (PDL) المغلفة مسبقا ب 384 بئرا ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين الألواح المطلية في درجة حرارة 4 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يعد التنميط الظاهري في الخلايا العصبية mDA طريقة فعالة لتحديد جوانب متعددة من البيولوجيا الخلوية وتغيراتها أثناء التعديل التجريبي. لتجسيد هذه المنهجية ، استخدمت هذه الدراسة LRRK2 G2019S المحفوظة بالتبريد والخلايا العصبية mDA المانحة الصحية. تم تمييز هذه الخلايا العصبية لمدة 37 يوما تقريبا ، وهي علامات عصبية ما بعد الانقسام وعلامات عصبية صريحة (TUBB3 و MAP2) وعلامات الخلايا العصبية الدوبامينية ، بما في ذلك هيدروكسيلاز التيروزين (TH) بالاشتراك مع FOXA2 ، في حين أن العلامة الدبقية Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) غائب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التنميط الظاهري هو تقنية لقياس عدد كبير من الأنماط الظاهرية في الخلايا عن طريق تطبيق تلطيخ الفلورسنت والفحص المجهري وتحليل الصور3. يمكن الحصول على ملامح النمط الظاهري ومقارنتها عبر خطوط الخلايا أو الظروف التجريبية الأخرى لفهم التغيرات المعقدة في البيولوجيا الخلوية التي قد تمر دون أن يلاحظها أحد عند استخدام قراءة واحدة. هنا نصف تطبيق التنميط الظاهري على الخلايا العصبية mDA المشتقة من iPSC البشري ، وهو نوع من الخلايا يستخدم بشكل متكرر لنمذجة البيولوجيا الخلوية PD17،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يتم توظيف جميع المؤلفين من قبل Ksilink.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يشكروا جميع الزملاء في Ksilink على مساعدتهم القيمة ومناقشاتهم التي أدت إلى تصميم البروتوكول المقدم.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مضاد للدجاج – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
| Anti-Mouse - Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
| Anti-Rabbit - Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | التألق المناعي |
| المضاد للتيروزين هيدروكسيلاز | Merck | T2928 | التألق المناعي |
| المضاد لألفا سينوكلين | Abcam | 138501 | التألق المناعي |
| منصة مناولة السوائل الآلي برافو مع رأس 384ST | Agilent | إذا لم يكن معالج السوائل متاحا ، يوصى باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات. | |
| المجهر متحد البؤر | يوكوجاوا | CV7000 | يوصى باستخدام مجهر مضان متحد البؤر الآلي لضمان اتساق جودة الصورة. |
| عداد الخلايا الآلي للكونتيسة | المختية | قبل البذر. يمكن أيضا القيام به باستخدام غرفة العد اليدوية. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | عازلة لغسل |
| موزع الغسالة EL406 ؛ | BioTek (Agilent) | في حالة عدم توفر معالج سوائل، يوصى باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات. | |
| محلول الفورمالديهايد (PFA 16٪) | Euromedex | EM-15710-S | التثبيت قبل تلطيخ |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | تلطيخ نووي |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | الوسط الأساسي للخلايا العصبية |
| iCell DPN ، المتبرع # 01279 ، النمط الظاهري AHN ، الlot # 106339 ، 1M | Fujifilm | C1087 | متبرع |
| سليم على ما يبدوiCell DPN ، المتبرع # 11299 ، النمط الظاهري LRRK2 G2019S ، النمط الظاهري PD lot # 106139 | Fujifilm | C1149 | المتبرع الذي يحمل طفرة LRRK2 G2019S ؛ |
| ملحق النظام العصبي iCell | ملحق Fujifilm | M1031 | للملحق |
| العصبي iCell المتوسط الأساسي B | Fujifilm | M1029 | ملحق لمتوسط القاعدة |
| Jupyter Python Notebook | التطوير الداخلي | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook لأداء تصور المظهر الظاهري وتصنيفه من البيانات الأولية. |
| لوحة Laminin | Biolamina | LN521 | |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 مثبط كيناز |
| PhenoLink | التطوير الداخلي | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | برنامج لتحليل الصور |
| PhenoPlate 384w ، PDL المطلي | Perkin Elmer | 6057500 | صفيحة مطلية مسبقا لزراعة الخلايا والتصوير. تسمح هذه اللوحة بتصوير جميع الآبار باستخدام جميع أهداف مجهر يوكوجاوا CV7000. |
| لوحات التخزين Abgene 120 & micro; L | Thermo Scientific | AB-0781 | ضروري للتوزيع المركب باستخدام نظام سحب العينات Vprep. إذا لم تكن متوفرة، يوصى باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات. |
| Triton | Sigma | T9284 | نفاذية قبل التحلل |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | تحديد الخلايا الحية |
| Vprep نظام السحب ؛ | Agilent | التغيير المتوسط والتوزيع المركب. بدلا من ذلك، يمكن استخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات. |
المراجع
- Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095(2021).
- Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017)....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
