Summary
Dit protocol beschrijft een methode om een nauwkeurig en reproduceerbaar hoornvlies- en limbaal alkalisch letsel te induceren in een muismodel. Het protocol is voordelig omdat het een gelijkmatig verdeelde verwonding van het sterk gekromde hoornvlies en de limbus van de muis mogelijk maakt.
Abstract
Het hoornvlies is van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en de genezing van het hoornvlies na een trauma is van fundamenteel belang voor het behoud van de transparantie en functie ervan. Door de studie van modellen voor hoornvliesbeschadiging willen onderzoekers hun begrip van hoe het hoornvlies geneest vergroten en strategieën ontwikkelen om vertroebelingen van het hoornvlies te voorkomen en te beheersen. Chemische verwonding is een van de meest populaire verwondingsmodellen die uitgebreid is bestudeerd op muizen. De meeste eerdere onderzoekers hebben een plat papier gedrenkt in natriumhydroxide gebruikt om hoornvliesbeschadiging te veroorzaken. Het induceren van hoornvlies- en limbale schade met behulp van plat filtreerpapier is echter onbetrouwbaar, omdat het hoornvlies van muizen sterk gekromd is. Hier presenteren we een nieuw instrument, een gemodificeerde biopsiepons, waarmee de onderzoekers een goed begrensde, gelokaliseerde en gelijkmatig verdeelde alkalische verwonding aan het hoornvlies en de limbus van de muizen kunnen creëren. Deze punch-trephine-methode stelt onderzoekers in staat om een nauwkeurige en reproduceerbare chemische verbranding van het gehele hoornvlies en de limbus van de muizen te induceren, terwijl andere structuren, zoals de oogleden, onaangetast blijven door de chemische stof. Bovendien introduceert deze studie een enucleatietechniek die de mediale karbonkel bewaart als een oriëntatiepunt voor het identificeren van de neuszijde van de wereld. Het bulbaire en palpebrale bindvlies en de traanklier worden met deze techniek ook intact gehouden. Oogheelkundig onderzoek werd uitgevoerd via spleetlampbiomicroscoop en fluoresceïnekleuring op dag 0, 1, 2, 6, 8 en 14 na het letsel. Klinische, histologische en immunohistochemische bevindingen bevestigden limbale stamceldeficiëntie en falen van de regeneratie van het oogoppervlak bij alle experimentele muizen. Het gepresenteerde alkalische hoornvliesbeschadigingsmodel is ideaal voor het bestuderen van limbale stamceldeficiëntie, hoornvliesontsteking en fibrose. Deze methode is ook geschikt voor het onderzoeken van preklinische en klinische werkzaamheid van topische oftalmologische medicatie op het hoornvliesoppervlak van muizen.
Introduction
Het hoornvlies is van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en vertoont unieke kenmerken, waaronder transparantie, wat een voorwaarde is voor helder zicht. Het hoornvlies vervult niet alleen een belangrijke beschermende rol, maar is ook verantwoordelijk voor 2/3 van het brekingsvermogen van hetoog1. Vanwege de belangrijke rol bij het gezichtsvermogen veroorzaken hoornvliesletsels en troebelheid een aanzienlijke achteruitgang van het gezichtsvermogen en zijn ze verantwoordelijk voor de op één na grootste oorzaak van vermijdbare blindheid wereldwijd 2,3. Bij hoornvliesletsels met ernstige limbale disfunctie neemt de barrièrefunctie van de limbus af, wat resulteert in de migratie van conjunctivale cellen naar het hoornvliesoppervlak en hoornvliesconjunctivalisatie 4,5, wat het gezichtsvermogen dramatisch in gevaar brengt. Effectieve preventieve en therapeutische strategieën zijn daarom nodig om de wereldwijde last van hoornvliesblindheid en gerelateerde invaliditeit aan te pakken.
Het huidige begrip van het genezingsproces van het menselijk hoornvlies is gebaseerd op eerdere studies die de reacties van het hoornvlies op verschillende verwondingen hebben onderzocht. Er zijn verschillende technieken en diermodellen gebruikt om verschillende chemische of mechanische hoornvliesletsels te induceren 6,7,8,9 en om verschillende aspecten van het genezingsproces van het hoornvlies te onderzoeken.
Het alkalische brandwondenmodel is een beproefd verwondingsmodel dat wordt uitgevoerd door natriumhydroxide (NaOH) rechtstreeks op het hoornvliesoppervlak aan te brengen of door plat filtreerpapier10 te gebruiken. Een alkalische verwonding resulteert in het vrijkomen van pro-inflammatoire mediatoren en infiltratie van polymorfonucleaire cellen, niet alleen in het hoornvlies en de voorste oogkamer, maar ook in het netvlies. Dit induceert onbedoelde retinale ganglioncelapoptose en CD45+ -celactivering11. Daarom is het van cruciaal belang om de plaats van de verwonding nauwkeurig te lokaliseren om buitensporig onbedoeld letsel te voorkomen met behulp van een alkalisch verwondingsmodel.
De axiale lengte van de muizenoogbol is ongeveer 3 mm12. Vanwege deze korte afstand tussen het hoornvlies en het netvlies bestaat er een steile kromming van het hoornvlies om een hoog brekingsvermogen te bieden om het licht op het netvlies te concentreren (Figuur 1A). Zoals we eerder meldden13, is het moeilijk om chemische schade aan dit sterk gekromde oppervlak te veroorzaken met behulp van een plat filtreerpapier, vooral bij de limbus (Figuur 1B). Het veroorzaken van letsel aan de limbus vereist het kantelen van het filterpapier, wat onbedoeld letsel kan veroorzaken aan de fornix en het aangrenzende bindvlies14. Een andere benadering is het rechtstreeks aanbrengen van het chemische middel als druppels op het hoornvliesoppervlak. Deze methode heeft echter geen controle over de blootstellingstijd en er is een potentieel risico op letsel aan het bindvlies, de fornix en de oogleden als gevolg van de diffusie van de vloeistof naar deze gebieden.
Om deze beperkingen te overwinnen, presenteert deze studie een nieuwe punch-trephine-methode om letsel te veroorzaken. Deze techniek heeft verschillende voordelen, waaronder (i) het induceren van een effectieve chemische verwonding aan het gehele hoornvliesoppervlak en limbus in muismodel, (ii) het induceren van een gelokaliseerde en goed omschreven verwonding aan het hoornvlies, (iii) de mogelijkheid om elke vloeistof van belang aan te brengen gedurende een vooraf bepaalde duur, en (iv) de mogelijkheid om verschillende groottes van hoornvliesletsels te induceren door geschikte biopsieponsen te selecteren. Deze methode is ook haalbaar voor verwondingsmodellen bij ratten en konijnen, die ook een gebogen hoornvliesoppervlak vertonen en veel voorkomende diermodellen zijn die worden gebruikt om wondgenezing op het oogoppervlak te bestuderen.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met het Stanford-laboratoriumdierverzorging APLAC-nummer 33420, het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden en de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en oogheelkundig onderzoek. In totaal werden 10 mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 muizen in de leeftijd van 8-12 weken genereus ter beschikking gesteld door het Irving L. Weissman-laboratorium. De dieren werden geacclimatiseerd aan een licht-donkercyclus van 12 uur en ad libitum voorzien van water en voer. Er werd letsel toegebracht aan één oog van het dier.
1. Voorbereiding op het experiment
- Voorbereiding van materialen
NOTITIE: Alle reagentia moeten op kamertemperatuur worden gehouden.- Bereid de pons-trephine voor: Maak een biopsiepons met een diameter van 3,5 mm en markeer de schacht van de pons op 5 mm afstand van de distale rand. Bevestig de pons stevig en snijd het gemarkeerde distale deel van de as af met behulp van een roterend gereedschap met twee snelheden. Draag tijdens dit proces oogbescherming. Snijd de schacht op 3,5 mm diepte en laat de laatste 1,5 mm zitten. Buig de punt 90°, zoals weergegeven in afbeelding 1.
- Bereid 0,5 M NaOH-oplossing door 1 g NaOH op te lossen in 50 ml gedestilleerd water.
- Bereid 10 ml verdovingscocktail door 2 ml 100 mg/ml ketamine en 1 ml 20 mg/ml xylazine te combineren. Verdun dit mengsel vóór de injectie met 7 ml 0,9% NaCl (normale zoutoplossing).
- Bereid 0,1% fluoresceïne-natriumoplossing door 0,1 ml 10% AK-Fluor fluorescerende vloeistof toe te voegen aan 9,9 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS).
- Bereid PBS (1x) door 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 en 0,23 g NaH2PO4op te lossen in 900 ml gedestilleerd water. Stel de pH van de oplossing in op 7,4. Breng de oplossing tot een eindvolume van 1 L door gedestilleerd water toe te voegen.
- Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing voor fixatie. Los onder een chemische kap 2 g PFA op in 45 ml PBS. Verwarm het mengsel tot 65 °C en titreer de pH tot 7,4. Zodra de PFA is opgelost, brengt u de oplossing tot een eindvolume van 50 ml.
2. Voorbereiding van dieren
- Weeg de muis om het juiste volume injecteerbare anesthesiecocktail voor injectie te bepalen. Na de muis op de juiste manier te hebben gehanteerd en in bedwang te houden, zoals beschreven in Machholz et al.15, dient u de verdovingscocktail intraperitoneaal (IP) toe in een dosis van 0,01 ml/g16,17. Richt u op de inferieure abdominale kwadranten voor IP-injectie om orgaanschade te voorkomen.
- Injecteer buprenorfine injecteerbare suspensie met verlengde afgifte (3,25 mg/kg) subcutaan voor extra analgesie tijdens en na de operatie, aangezien alkalisch letsel aan het hoornvlies extreem pijnlijk is.
- Wacht tot een diep anesthesieniveau is bereikt. Controleer op een gebrek aan reactie op teenknijpen als indicatie van een succesvol diep anesthesievlak. Breng eenvoudige oogzalf aan voor het contralaterale oog om uitdroging te voorkomen voordat u met de operatie begint.
- Plaats de muis na anesthesie op de operatietafel die is voorbereid volgens de standaard principes van knaagdierchirurgie18. Leg een kussen van 5 mm hoog onder de kop van het knaagdier, in de laterale decubituspositie. Het kussen helpt het hoofd van het knaagdier te ondersteunen tijdens de operatie.
- Dien tetracaïnehydrochloride (0,5%) oogdruppels toe voor verdere anesthesie. Droog het oogoppervlak goed af met een chirurgische oogspeer en knip de wimpers af.
3. Inductie van alkalischade
- Voordat u met de operatie begint, organiseert u de operatietafel volgens de standaard knaagdierchirurgieprincipes18,19 en houdt u het operatieveld steriel tijdens de operatie. Plaats de chirurgische microscoop om de verdoofde muis goed te visualiseren en stel de timer in op 30 s. Plaats een gedraaide papieren handdoek op de snuit van het dier om onbedoelde neusaspiratie tijdens het spoelproces te voorkomen.
- Bepaal de omtrek van het limbale gebied met behulp van de chirurgische microscoop en zorg ervoor dat de oogleden van de muis wijd open staan met de duim en wijsvinger. Houd de schone punch-trephine voorzichtig evenwijdig aan de as van het oog, zonder neerwaartse druk uit te oefenen. Vermijd het ronddraaien van het instrument en houd de as van de punch-trephine evenwijdig aan de as van de wereldbol.
- Vraag de operatieassistent om 3 druppels NaOH-oplossing (gelijk aan 40 μL) in het gat van de punch-trephine te laten vallen om het gereedschap te vullen en het hoornvliesoppervlak op de juiste manier te bedekken. De oppervlaktespanning van de vloeistof voorkomt lekkage uit het instrument (Figuur 1).
OPMERKING: We gebruikten een spuit van 1 mm met een naald van 27 G met een afgeplatte punt onder een hoek van 50° om de NaOH-oplossing voorzichtig te laten vallen. - Spoel na 30 s het hoornvlies en de fornix onmiddellijk af met 5 ml PBS (1x). Video 1 demonstreert de procedure voor het veroorzaken van chemisch letsel.
- Gebruik een universeel pH-indicatorpapier om een pH van 7 - 7,5 op het hoornvliesoppervlak van het gewonde oog te garanderen. Breng vervolgens de drievoudige antibiotische oogzalf aan op het chemisch beschadigde oogoppervlak.
OPMERKING: Staartbeweging tijdens de operatie is een teken van een lage anesthesiediepte. Breng een extra verdovingscocktail aan (ketamine + xylazine) door een verdovingsmiddel [bolus IP (50% van het oorspronkelijke volume)] te injecteren. - Controleer na de operatie of de muis in een stabiele toestand verkeert. Dien tweede buprenorfine toe als het dier pijn heeft. Gebruik dezelfde hanteringstechniek als in 2.2. Start het postoperatieve onderzoek terwijl het dier onder narcose is.
- Was, droog en ontsmet na de ingreep de punch-trephine en de operatietafel met 70% ethanol.
4. Klinische evaluatie
- Verdoof de muis voor onderzoek zoals eerder beschreven in stap 2.1.
- Onderzoek de ogen (gewond en niet-gewond) onder een spleetlampbiomicroscoop. Gebruik een camera om foto's te maken (in dit onderzoek werd een telefooncamera in de filmmodus gebruikt).
- Score hoornvliestroebelheid volgens het Yoeruek-beoordelingssysteem20: 0 = normaal, helder hoornvlies; 1 = milde opaciteit; 2 = grotere opaciteit, maar de iris en pupil zijn gemakkelijk te onderscheiden; 3 = iris en pupil zijn nauwelijks van elkaar te onderscheiden; 4 = hoornvlies is volledig ondoorzichtig met een onzichtbare pupil.
- Breng 0,1% fluoresceïne oogdruppels aan. Droog overtollige fluorescerende vloeistof met een katoenen applicator en evalueer op de aanwezigheid van hoornvliesepitheeldefecten met behulp van het kobaltblauwe filter. Maak foto's.
- Houd het dier in de gaten totdat het weer voldoende bij bewustzijn is om sternale lighouding te behouden. Introduceer het dier niet opnieuw bij andere dieren totdat het volledig is hersteld.
5. Enucleatie
- Euthanaseer muizen 2 weken na inductie van chemische schade door cervicale dislocatie in 3-5 s21.
- Ontnucleeer het oog met behoud van de mediale karbonkel en het hele ooglidbindvlies in de volgende volgorde, zoals weergegeven in video 2.
- Ontleed onder de chirurgische microscoop voorzichtig de kruising van de karbonkel en de huid. Trek met behulp van een tandtang de karbonkel terug en leid de punt van een chirurgische schaar onder het ooglidbindvlies naar de kruising met de tarsale plaat.
- Snijd het bindvlies langs de adhesielijn naar de laterale canthus toe. Draai vervolgens de chirurgische schaar naar de kruising van het bindvlies en de inferieure tarsale plaat op het subconjunctivale vlak.
- Na het voltooien van de conjunctivale dissectie, trekt u de superieure en inferieure oogleden van de neuszijde terug met de duim en wijsvinger. Terwijl u zich terugtrekt, leidt u de punt van een pincet met gebogen punt achter de uitstekende traanslang naar de oogzenuw. Pak de oogzenuw stevig vast en haal de bol eruit (Figuur 2).
- Spoel de bol af met PBS (1x) en breng deze over in de fixeeroplossing.
6. Hematoxyline en eosine (H&E) en periodieke zuur-Schiff (PAS) kleuring
- Fixeer de bollen een nacht in 10% formaline-oplossing bij kamertemperatuur.
- Dehydrateer de weefsels met behulp van een sequentiële reeks gesorteerde alcohol met concentraties van 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol en 100% ethanol, elk gedurende 10-15 minuten. Dompel de ogen vervolgens gedurende 10 minuten onder in xyleen. Omhul ten slotte de ogen met paraffine.
- Verdeel de paraffineblokken in plakken van 6 μm dik en monteer ze op glazen objectglaasjes voor hematoxyline en eosine (H&E) en periodieke zuur-Schiff (PAS)-kleuring, zoals beschreven in aanvullend dossier 1.
7. Immunofluorescentiebeeldvorming en -analyse
- Voor immunohistochemisch onderzoek (IHC) fixeert u de ogen 's nachts in 1 ml PBS (1x) met 4% PFA bij 4 °C. Was het monster 3x in 1 ml PBS (1x) gedurende 5 minuten.
- Om ijskristalvorming te voorkomen en de moleculaire structuren van de eiwitten te beschermen, voert u seriële sucroseverzadiging uit met 10% sucrose-, 20% sucrose- en 30% sucroseconcentraties in PBS. De globes inbedden in een optische coherentietomografie-oplossing (OCT; Figuur 2) en bewaar ze bij -80 °C.
- Verdeel het OCT-blok in plakken van 12 μm dik en monteer het op glazen microscoopglaasjes voor IHC-kleuring.
- Permeabiliseer weefselsecties op microscoopglaasjes in 0,1% Triton X −100 in PBS (1x) gedurende 15 min. Blokkeer vervolgens niet-specifieke antigenen met 5% BSA in PBS (1x) gedurende nog eens 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer weefselcoupes op microscoopglaasjes bij 4 °C 's nachts in de cocktail van de beoogde primaire antilichamen bereid in PBS (1x) die 1% BSA bevatten. In dit experiment waren de primaire antilichamen 1:100 verdunde anti-keratine 13 (K13) en anti-keratine 12 (K12) antilichamen met een concentratie van respectievelijk 2,24 μg/ml en 1,56 μg/ml.
- Was na incubatie de weefselcoupes op microscoopglaasjes 3x met PBS (1x). Detecteer vervolgens gebonden primaire antilichamen met 1:500 verdunde ezel anti-konijn-IgG. Incubeer met het secundaire antilichaam bij 4 °C gedurende 1 uur in het donker. Was vervolgens in PBS (1x) 3x gedurende 5 min.
- Breng een druppel anti-fade fluorescentie montagemedium met DAPI aan op de weefselsecties op de microscoop en dek af met een dekglaasje. Laat monsters in het donker drogen en onderzoek ze onder een fluorescerende microscoop met dezelfde laserinstelling voor normale en gewonde ogen.
Representative Results
De werkzaamheid van de methode bij het induceren van limbale stamceldeficiëntie (LSCD) werd beoordeeld door de klinische en histologische symptomen van LSCD te evalueren. Klinische beoordeling werd uitgevoerd door middel van spleetlampmicroscopie en beeldvorming van optische coherentietomografie (AS-OCT) van het voorste segment (Figuur 3 en Figuur 4).
Re-epithelialisatie vond plaats op een centripetale manier en was sneller in het temporale deel van het hoornvlies in vergelijking met het neusgedeelte. Gewonde ogen ontwikkelden 2+-3+ hoornvlieswaas onmiddellijk na chemische verwonding (Figuur 3). Epitheelcellen migreerden van het bindvlies naar het hoornvliesoppervlak na limbaal letsel. Het grote cornea-epitheeldefect werd volledig opnieuw geëpithelialiseerd op dag 12-14, wat langer duurde in vergelijking met een cornea-epitheelletsel van vergelijkbare grootte en intact basaalmembraan en stroma die doorgaans binnen 5 dagen na het letsel genazen 8,9. Als gevolg van LSCD ontwikkelde 50% van de gewonde ogen aan het einde van de tweede week aanhoudende epitheeldefecten (Figuur 3). Hoornvliesoedeem was prominenter aanwezig tijdens de eerste paar dagen (Figuur 3, Figuur 4), terwijl hoornvliesfibrose significant was in de tweede week, wat resulteerde in 4+ hoornvliestroebelheid in 100% van de gewonde ogen.
Vroege tekenen van neovascularisatie (NV) werden klinisch en histologisch waargenomen, 24 uur na inductie van chemische verwonding, zoals geïllustreerd in figuur 5, in overeenstemming met de tijdlijn van NV geïdentificeerd door Kvanta et al. studie die tekenen van limbale NV 24 uur na letsel vertoonde22. Tijdens het genezingsproces rijpten nieuwe bloedvaten en op de 14e dag na het letsel stak NV de limbus over en bereikte het centrale hoornvlies. De limbus, die de grens tussen het bindvlies en het hoornvlies bepaalt, werd vernietigd.
Histologisch bewijs van limbale stamceldeficiëntie en conjunctivalisatie werd waargenomen door het verschijnen van PAS+ bekercellen en stromale bloedvaten 23,24,25,26. Gobletcellen werden waargenomen in het huidige verwondingsmodel en aangegeven met de pijl in figuur 6.
Conjunctivale en cornea-epitheel brengen voornamelijk unieke keratines tot expressie, respectievelijk K13 en K1227. Na het limbale letsel bedekten nieuwe epitheelcellen die afkomstig waren van het bindvlies het ontblote hoornvlies en K12 werd gedurende 2 weken na het letsel niet tot expressie gebracht op het hoornvliesoppervlak van gewonde dieren. Deze bevinding, consistent met andere onderzoeken28, duidde op volledige LSCD en de afwezigheid van hoornvliesepitheelcellen op het hoornvliesoppervlak. In de studie van Park et al.29 detecteerden ze echter K12-expressie 20 en 32 weken na het letsel, wat wijst op een mogelijke transdifferentiatie van de epitheelcellen.
Bijgevolg zagen we dat chemische schade de limbus en limbale stamcellen vernietigde, wat resulteerde in de migratie van conjunctivale epitheelcellen naar het midden van het hoornvlies om het ontblote hoornvliesoppervlak te bedekken. Dit wordt verder gevalideerd door de conjunctivale epitheelcelmarker, K13, die tot expressie kwam in het gehele bindvlies en het hoornvliesoppervlak, zoals weergegeven in figuur 7.
Figuur 1: Normaal rechteroog van de muis en de punch-trephine voor het induceren van hoornvlies- en limbaal letsel. (A) Zijaanzicht met muizenoog met sterk gebogen hoornvlies (pijlpunten geven de limbus aan). (B) De afbeelding laat zien dat zelfs een groot filtreerpapier onvoldoende is om het limbale gebied voldoende te bedekken. De limbus-tot-limbus-diameter van het muizenoog is bijna 4 mm en een ponsbiopsie met een uitwendige diameter van 4,5 mm en een inwendige diameter van 3,5 mm (panelen D en H), bedekt het hoornvlies en het limbale oppervlak op de juiste manier, zoals weergegeven in panelen (C) en (E). (F) De punch-trephine wordt op de juiste manier over de aardbol rond het limbale gebied gehouden. (G) Om ervoor te zorgen dat er geen lekkage is door de rand van de pons-trephine, wordt het gat gevuld met methyleenblauw nadat de pons-trephine op de juiste manier in een evenwijdige as met de bol is geplaatst. Er wordt geen lekkage van methyleenblauw gedetecteerd. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Ontkernde ogen. (A) De ogen werden ontkernd met behoud van het bulbaire en ooglidbindvlies, de traanklier (pijlpunt) en de oogzenuw (pijl). De normale (B) en gewonde (C) ogen waren verzadigd met 30% sucrose om te beschermen tegen cryokristalvorming. Het neusgedeelte van de bol is herkenbaar aan de neuskarbonkel (aangeduid met N). Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Wondgenezing van het linkeroog. Het wondgenezingsproces van het linker muizenoog gedurende 2 weken na hoornvlies- en limbaal alkalisch letsel in een muismodel wordt hier weergegeven (AF). Het spleetlamponderzoek van het oog. Hoornvliesoedeem is prominenter aanwezig op dag 0 en 2 (A,B), terwijl fibrose duidelijker is tijdens de tweede week na het letsel (EF). A.f-F.f tonen het re-epithelialisatieproces van hetzelfde oog. Totaal cornea- en limbaal epitheeldefect onmiddellijk na inductie van letsel wordt waargenomen bij A.f. Het epitheeldefect genas door conjunctivale epitheelcelmigratie in een middelpuntzoekend patroon na 12-14 dagen (AF-F.F). Aan het einde van de tweede week ontwikkelde echter 50% van de gewonde ogen een aanhoudend epitheeldefect, zoals te zien is in de pijl in F- en F.f-afbeeldingen. Schaalbalk = 1 mm (paneel C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorste segment OCT van het oog van de muis. (A) AS-OCT illustreert de normale kromming van het hoornvlies en de voorste oogkamer. De irisstructuur is goed gedefinieerd en herkenbaar. Er is geen iridocorneale adhesie waarneembaar in het midden van de periferie van de iris. (B) Onmiddellijk na het letsel neemt de dikte van het hoornvlies toe als gevolg van oedeemvorming en ontwikkelt zich iridocorneale adhesie aan de middenrand van de iris. (C) Twee weken na het letsel is de kromming van het hoornvlies veranderd en is de totale iridocorneale adhesie met vernietiging van de voorste oogkamer zichtbaar. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Neovascularisatie van het hoornvlies. Klinische en histologische tekenen van neovascularisatie van het hoornvlies kunnen worden waargenomen tijdens het wondgenezingsproces na natriumhydroxide (NaOH)-letsel. (A) De eerste tekenen van neovascularisatie worden detecteerbaar op de eerste dag na het letsel, gekenmerkt door een roodachtige verkleuring van het hoornvlies (aangegeven door een witte pijl). Deze verkleuring is het gevolg van de aggregatie van rode bloedcellen in het stroma, zoals geïllustreerd in de bijbehorende histologische afbeelding (D) (aangegeven door gele pijlpunten). (B) In de eerste week van regeneratie nemen nieuwe bloedvaten geleidelijk toe en verspreiden ze zich over het hoornvlies. (C) Tegen het einde van 2 weken is het limbale gebied vernietigd en blijven de nieuwe vaten evolueren. (E) De histologische doorsnede van het hoornvlies illustreert verder de aanwezigheid van diepe stromale neovascularisatie (weergegeven door pijlpunten). Spleetlamp Beeldschaalbalk = 1 mm, de histologiebeeldschaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Periodieke zuur-Schiff en immunohistochemische (IHC) kleuring van het hoornvlies. Periodieke zuur-Schiff en immunohistochemische kleuring van het normale en beschadigde hoornvlies werd 2 weken na het letsel uitgevoerd. Normaal hoornvliesepitheel van muizen bestaande uit 4-5 lagen cellen (A). Alkalische beschadiging van het hoornvlies en de limbus leidde tot conjunctivalisatie van het hoornvlies met het verschijnen van bekercellen op het hoornvliesoppervlak, zoals weergegeven door zwarte pijlen in (D). Normale hoornvliesepitheelcellen brengen K12 (B) tot expressie, dat niet tot expressie wordt gebracht door de conjunctivale cellen die het beschadigde hoornvlies bedekken (E). K13, een karakteristieke marker van conjunctivale epitheelcellen, komt niet tot expressie op de normale cornea-epitheelcellen (C). Het is echter aanwezig op het door natriumhydroxide (NaOH) beschadigde hoornvliesoppervlak, wat een teken is van conjunctivalisatie van het hoornvlies (F). Histologie-beeldschaalbalk = 50 μm, IHC-gekleurd beeldschaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Hematoxyline en eosine en immunohistochemische kleuring. Hematoxyline en eosine (H&E) en immunohistochemische kleuring van het normale en beschadigde limbusweefsel werd gedaan. (A) De normale limbus markeert het overgangsgebied tussen het einde van de sclera en het begin van het hoornvlies. Dit gebied is meestal bedekt met een of twee lagen conjunctivale epitheelcellen (aangegeven door de pijlen). In een gezond oog begint de expressie van een specifieke hoornvliesepitheelmarker genaamd K12 bij de limbus en strekt zich uit tot het oppervlak van het hoornvlies (weergegeven in afbeelding B). Aan de andere kant is de expressie van een conjunctivale marker die bekend staat als K13 beperkt tot de limbus en reikt deze niet verder (aangegeven door de witte pijl in afbeelding C). Bij ogen die gewond zijn geraakt door natriumhydroxide (NaOH), zijn de grenzen van de limbus verstoord. Dit leidt tot migratie van conjunctivale cellen naar het beschadigde hoornvlies. (D) De beelden van de door NaOH gewonde limbus tonen de aanwezigheid van neovascularisatie aan, zowel onder de epitheellaag als in het stromale weefsel. Na het letsel ontbreekt het beschadigde hoornvliesoppervlak de aanwezigheid van K12 (E), terwijl K13 overvloedig tot expressie komt op het hoornvliesoppervlak (F). Histologie-beeldschaalbalk = 50 μm, IHC-gekleurd beeldschaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Kleuringsprotocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Video 1: NaOH hoornvlies- en limbaal letsel in een muismodel met een punch-trephine. De video demonstreert de procedure voor het induceren van NaOH-letsel aan het hoornvlies en de limben in een muismodel met een punch-trephine. Het is van cruciaal belang om de punch-trephine in een parallelle as met de bol te houden en minimale druk uit te oefenen op de limbus. Deze juiste techniek is essentieel om lekkage te voorkomen en optimale resultaten te bereiken. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Illustratie van de enucleatietechniek met behoud van het bulbaire bindvlies. Om de neuszijde van de wereldbol te onderscheiden van de slaapzijde, wordt de neuskarbonkel samen met de wereldbol bewaard. Het hele bindvlies wordt ontleed vanaf de kruising met de tarsale plaat. Bij minimale druk steekt de orbitale inhoud naar buiten uit. Door de tang naar de achterkant van de bol te leiden, wordt de oogzenuw vastgepakt en wordt het weefsel geëxtraheerd. Het ontkernde weefsel omvat de bol, het orbitale vet en de orbitale traanklier. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
Deze studie stelt een innovatief apparaat voor, de punch-trephine, dat kan worden gebruikt om met succes een effectief en reproduceerbaar hoornvlies- en limbaal letsel in een muismodel te induceren. Dit limbale stamceldeficiëntiemodel is ideaal om de dynamiek van wondgenezing en conjunctivalisatie van het hoornvlies na letsel te onderzoeken.
Er zijn aanwijzingen dat zowel de limbale niche als het centrale deel van het hoornvlies van muizen stamcellen bevatten. Daarom is een efficiënt hoornvlies- en limbaal letsel vereist om een stamceldeficiëntiemodel te produceren, en het hier gepresenteerde letselmodel maakt blootstelling van de gebogen corneale limbus aan een chemisch agens gedurende een bepaalde periode mogelijk. Om de beste concentratie en duur van NaOH-letsel te bepalen, werden verwondingen toegebracht met verschillende NaOH-concentraties en -duur. Hogere NaOH-concentraties of langere blootstellingsduur resulteerden in verhoogde weefselbeschadiging en fibrose. Daarom kunnen onderzoekers deze parameters aanpassen op basis van de specifieke doelen van hun onderzoek en de gewenste ernst van het letsel.
Om dit model voor hoornvlies- en limbaal letsel met succes te reproduceren, moeten verschillende belangrijke overwegingen in overweging worden genomen. Ten eerste is het absoluut noodzakelijk om de limbale-tot-limbale diameter van het beoogde oog te meten om de juiste maat van de pons te bepalen. Het wordt aanbevolen om een biopsiepons te kiezen met een uitwendige diameter die 0,5 - 1 mm groter is dan deze diameter.
De oppervlaktespanning van de gebruikte vloeistof is een belangrijke factor bij het voorkomen van lekkage op het grensvlak tussen het oogoppervlak en de rand van de ponstrephine, zoals weergegeven in figuur 1G. Daarom is het niet nodig om druk uit te oefenen op de punt van de ponsbiopsie.
Om mechanische schade aan het weefsel te voorkomen, is het van cruciaal belang om de ponstrephine in een parallelle as met het oog te houden en geen druk uit te oefenen op de limbus. Onjuiste afstelling van de as van de stempeltrephine kan het risico op lekkage vergroten en resulteren in een gedecentreerde plaats van letsel en onnauwkeurige resultaten.
Enkele mogelijke beperkingen van deze techniek zijn onder meer de noodzaak om de juiste ponsmaat te selecteren, vaardigheid te verwerven in het vasthouden van de ponstrephine en het potentiële risico op mechanisch letsel. Deze beperkingen kunnen echter worden overwonnen door te oefenen en door de instructies in dit protocol te volgen. De stam en de leeftijdscategorie van de muizen zijn andere factoren die het re-epithelisatieproces beïnvloeden en waarmee in het onderzoek rekening moet worden gehouden.
Bovendien is het voorgestelde protocol voordelig omdat het een enucleatiemethode beschrijft die het bulbaire en palpebrale bindvlies behoudt en de bepaling van het neusgedeelte van de wereld mogelijk maakt zonder de toepassing van chirurgische hechtingen als marker. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat het neusgebied van het oog de laagste neurale innervatie heeft in vergelijking met andere delen van het hoornvlies, waardoor het kwetsbaarder is voor neovascularisatie en verminderde regeneratieve werkzaamheid31,32.
Samenvattend bevestigen de klinische symptomen van LSCD, zoals vertroebeling van het hoornvlies (CO), aanhoudende epitheeldefecten en neovascularisatie van het hoornvlies (NV), samen met de waargenomen histologische veranderingen, waaronder bekercelmetaplasie, expressie van K13 op het hoornvliesoppervlak en afwezigheid van K12 op het hoornvliesoppervlak, de aanwezigheid van LSCD in dit model. Deze bevindingen leveren het bewijs dat deze nieuwe techniek effectief is in het induceren van LSCD. Dit chemische letselmodel kan worden gebruikt in preklinische studies om nieuwe medicijnen en farmaceutische behandelingen op het gebied van hoornvliesbeschadiging en regeneratie te onderzoeken.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft enig financieel belang in een van de bedrijven of producten die in deze studie worden beschreven. De auteurs verklaren geen andere belangenconflicten.
Acknowledgments
We erkennen dat NEI P30-EY026877 dit onderzoek ondersteunt. We zijn Charlene Wang en het Dr. Irv Weissman Lab van het Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine van Stanford University zeer erkentelijk voor al hun vriendelijke hulp bij het leveren van proefdieren. We waarderen de hulp van Hirad Rezaeipoor bij de voorbereiding en montage van de afbeeldingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
| Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
| C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
| Curved forceps | Storz | E1885 | |
| Disposable 90 degree bent needle | |||
| Disposable biopsy punch | Med blades | ||
| Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
| Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
| Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
| Heating pad for mouse | |||
| Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
| OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
| Ophthalmic surgical scissors | |||
| pH Indicator Sticks | Whatman | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
| Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
| Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
| Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
| Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
| Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
| Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
| Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
| Timer | |||
| Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
| TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
| Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
| Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: a global problem. Clinical & experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
- Lamm, V., Hara, H., Mammen, A., Dhaliwal, D., Cooper, D. K. C.
- Danjo, S., Friend, J., Thoft, R. A. Conjunctival epithelium in healing of corneal epithelial wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1445-1449 (1987).
- Shapiro, M. S., Friend, J., Thoft, R. A.
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine Corneal Epithelial Wound Modeling. Wound Regeneration: Methods and Protocols. Das, H. , Springer US. 175-181 (2021).
- Rittié, L., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D.
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (178), 63112 (2021).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Paschalis, E. I., et al. The Role of Microglia and Peripheral Monocytes in Retinal Damage after Corneal Chemical Injury. The American Journal of Pathology. 188 (7), 1580-1596 (2018).
- Jiang, M., et al. Single-Shot Dimension Measurements of the Mouse Eye Using SD-OCT. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 43 (3), 252-256 (2012).
- Shadmani, A., Razmkhah, M., Jalalpoor, M. H., Lari, S. Y., Eghtedari, M. Autologous Activated Omental versus Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Corneal Alkaline Injury: An Experimental Study. Journal of Current Ophthalmology. 33 (2), 136-142 (2021).
- Swarup, A., et al. PNP Hydrogel Prevents Formation of Symblephara in Mice After Ocular Alkali Injury. Translational Vision Science & Technology. 11 (2), 31-31 (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), 2771 (2012).
- Jaber, S. M., et al. Dose Regimens, Variability, and Complications Associated with Using Repeat-Bolus Dosing to Extend a Surgical Plane of Anesthesia in Laboratory Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 684-691 (2014).
- Navarro, K. L., et al. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- ACLAM Medical Records Committee. Medical Records for Animals Used in Research, Teaching, and Testing: Public Statement from the American College of Laboratory Animal Medicine. ILAR Journal. 48 (1), 37-41 (2007).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
- Shomer, N. H., et al.
- Kvanta, A., Sarman, S., Fagerholm, P., Seregard, S., Steen, B. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Inflammation-associated Corneal Neovascularization. Experimental Eye Research. 70 (4), 419-428 (2000).
- Tseng, S. C., Hirst, L. W., Farazdaghi, M., Green, W. R. Goblet cell density and vascularization during conjunctival transdifferentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (10), 1168-1176 (1984).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 32 (1), 96-105 (1991).
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Deng, S. X., et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 38 (3), 364-375 (2019).
- Wei, Z. G., Wu, R. L., Lavker, R. M., Sun, T. T. In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia: Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 34 (5), 1814-1828 (1993).
- Kao, W. W. Y. Keratin expression by corneal and limbal stem cells during development. Experimental Eye Research. 200, 108206 (2020).
- Park, M., et al. Plasticity of ocular surface epithelia: Using a murine model of limbal stem cell deficiency to delineate metaplasia and transdifferentiation. Stem Cell Reports. 17 (11), 2451-2466 (2022).
- Li, J., et al. Identification for Differential Localization of Putative Corneal Epithelial Stem Cells in Mouse and Human. Scientific Reports. 7 (1), 5169 (2017).
- McKenna, C. C., Lwigale, P. Y. Innervation of the Mouse Cornea during Development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 30-35 (2011).
- He, J., Bazan, H. E. P. Neuroanatomy and Neurochemistry of Mouse Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 664-674 (2016).
