この記事では、血管免疫芽球性リンパ腫におけるサンガーシーケンシングに基づく低周波検出法の応用について紹介します。この方法を他の病気に適用するための基礎を提供します。
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方法論記事
低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
腫瘍治療後の微小残存病変(MRD)をモニタリングする場合、治療中の薬剤耐性変異や循環腫瘍細胞変異を検出する場合よりも、検出下限の要件が高くなります。従来のサンガーシーケンシングは、5%〜20%の野生型変異検出を備えているため、その検出限界は対応する要件を満たすことができません。これを克服するために報告されている野生型ブロッキング技術には、ブロッカー変位増幅(BDA)、拡張不可能なロック核酸(LNA)、ホットスポット特異的プローブ(HSSP)などがあります。これらの技術は、特定のオリゴヌクレオチド配列を用いて野生型をブロックしたり、野生型を認識したりした後、他の方法と組み合わせることで野生型増幅を防止し、変異体増幅を増幅することで、高感度、柔軟性、利便性などの特性を生かしています。このプロトコルは、RHOA G17V低周波体細胞変異の検出を最適化するために、サンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCRであるBDAを使用し、検出感度は0.5%に達することができ、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫のMRDモニタリングの基礎を提供できます。
概要
微小残存病変(MRD)は、治療後も体内にまだ存在する少数のがん細胞です。数が少ないため、身体的な兆候や症状を引き起こすことはありません。それらは、顕微鏡による可視化や血液中の異常な血清タンパク質の追跡など、従来の方法では検出されないことがよくあります。MRD陽性の検査結果は、残存した疾患細胞の存在を示します。陰性の結果は、残存した疾患細胞が存在しないことを意味します。がん治療後、体内に残っているがん細胞が活性化して増殖し始め、病気が再発する可能性があります。MRDの検出は、治療が完全に効果的ではなかったか、治療が不完全であったことを示しています。治療後にMRD陽性の結果が出るもう一つの理由は、すべてのがん細胞が治療に反応しなかったこと、またはがん細胞が使用した薬剤に耐性を持つようになったためである可能性があります1。
血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)は、T濾胞性ヘルパー細胞2に由来する末梢性T細胞リンパ腫(PTCL)のサブタイプです。これは最も一般的なタイプのT細胞リンパ腫であり、PTCLの約15%〜20%を占めています3。これは、リンパ系に影響を与える関連する悪性腫瘍のグループです。起源の細胞は濾胞性Tヘルパー細胞....
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プロトコル
本研究は、永州中央病院の医療倫理審査委員会(承認番号:2024022601)によって承認されました。参加者はインフォームドコンセントを提供しました。
1.プライマーデザイン
- 従来のプライマー設計:報告されたプライマー設計規則20に従ってプライマーを設計し、NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)によるプライマー設計。RHOA G17Vの変異部位については、従来のプライマーの設計のためのすべての参照配列が変異塩基配列です。設計された逆増幅プライマーに変異部位配列が含まれており、プライマーのアニーリング温度が約60°Cであることを確認してください。
- BDAプライマーデザイン
- 約20-30塩基対(bp)の長さで野生ブロッキングプライマーを設計し、2-4の修飾塩基を含み、AとT.ブロッキングプライマーが突然変異増幅プライマーと重なる6-14bpを有することを確認します。
- 最終的に設計された変異体増幅プライマーと野生ブロッキングプライマーのアニーリング温度を約60°Cに設定し、ギブス自由エネルギーの差を0.8〜5 k....
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結果
試験サンプルの配列と参照配列を比較して、試験サンプルの変異状態を取得します。BDAベースのWBT-PCR技術は、アップストリームおよびダウンストリームプライマーの増幅間隔で既知のRHOA G17V変異およびその他の低頻度変異を検出できます。 図 1 を参照してください。さらに、 IDH2 と JAK1の2つの遺伝子も、それぞれ 図2 と 図3のこの方法を使用して分析されました。その結果、この方法は低頻度の突然変異の検出に非常に敏感であることが示されています。
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ディスカッション
本稿で紹介するBDA技術に基づくWTB-PCRは、従来のプライマーを設計する際に、変異型に相補的なミスマッチプライマーを導入し、野生型を抑制し、変異体産物を増幅します。その後、WTB-PCR産物の配列決定を行い、変異解析を行いました。WTB-PCR/Sangerの有用性は、そのシンプルさと高感度です。この論文で確立された検出スキームによれば、既存のほとんどのサンガーベースのアッセイにBDAを介してサプレッサープライマーを添加できるため、検出感度が向上します。この記事で紹介した RHOA G17V変異は、BDA技術に基づくWTB-PCR後のサンガーシーケンシングによって配列決定されました。DNAのインプット量が400 ngに達すると、検出感度は0.5%または0.1%に達する可能性があります。異なる遺伝子の検出感度は、DNAインプットの量、遺伝子配列などによって確認する必要があります。
WTB-PCRの鍵となるのはプライマーの設計であり、この技術では既知の変異しか検出できません。この記事では、この技術.......
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
この研究は、Kindstar Global Corporationの財政的支援と、分子生物学研究所のリーダーおよび関連する同僚の支援を受けて完了しました。会社、リーダー、関連する同僚のサポートと助けに感謝します。この記事は科学研究のみを目的としており、商業活動を構成するものではありません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 自動DNA抽出器 | 9001301 | Qiagen | |
| DNA核酸検出器 | Q32854 | サーモフィッシャーPCR | |
| 増幅キット | P4600 | メルク | |
| PCR機器 | C1000 タッチ | バイオラッド | |
| プロテイナーゼK溶液 | D3001-2-A | ザイモ研究 | |
| プロテイナーゼK保存緩衝液 | D3001-2-C | zymo research | |
| シーケンシング増幅酵素キット | P7670-FIN | Qiagen |
参考文献
- Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd (2019).
- Xie, Y., Elaine, S. J. How I diagnose angioimmunoblastic T-cel....
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再版と許可
