Мы представляем два собственных одноэтапных набора для ОТ-кПЦР на основе зондов для распространенных респираторных вирусов. Первый анализ проводится на SARS-CoV-2 (N), грипп A (H1N1 и H3N2) и грипп B. Второй — для SARS-Cov-2 (N) и MERS (UpE и ORF1a). Эти анализы могут быть успешно реализованы в любой специализированной лаборатории.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Разработка мультиплексных ОТ-кПЦР-анализов в режиме реального времени для выявления SARS-CoV-2, гриппа A/B и БВРС-КоВ
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), вызывающий коронавирусную болезнь 2019 года (COVID-19), представляет серьезную угрозу для здоровья населения в целом. Во время сезонов гриппа распространение SARS-CoV-2 и других респираторных вирусов может привести к тяжелому бремени респираторных заболеваний в масштабах всего населения, с которым трудно справиться. Для этого в предстоящие осенние и зимние сезоны необходимо будет тщательно следить за респираторными вирусами SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ), особенно в случае SARS-CoV-2, гриппа А и гриппа В, которые имеют схожие эпидемиологические факторы, такие как восприимчивые популяции, способ передачи и клинические синдромы. Без таргетно-специфических анализов может быть сложно дифференцировать случаи этих вирусов из-за их сходства. Соответственно, чувствительный и таргетный мультиплексный анализ, который может легко дифференцировать эти вирусные мишени, будет полезен для практикующих врачей. В этом исследовании мы разработали анализ на основе ПЦР с обратной транскриптазой в режиме реального времени с использованием разработанного нами одноэтапного набора R3T RT-qPCR для одновременного выявления SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и SARS-CoV-2, MERS-CoV. Имея всего 10 копий их синтетических РНК, мы можем успешно идентифицировать мишени SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и MERS-CoV одновременно со 100% специфичностью. Этот анализ признан точным, надежным, простым, чувствительным и специфичным. Разработанный метод может быть использован в качестве оптимизированного диагностического анализа SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и SARS-CoV-2, MERS-CoV в больницах, медицинских центрах и диагностических лабораториях, а также в исследовательских целях.
Введение
Пандемия продолжающейся коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19) вызвана новым коронавирусом, известным как коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2)1. Из-за высокой заразности и способности SAR-CoV-2 к быстрой передаче пандемия COVID-19 возникла в городе Ухань (Китай) и быстро распространилась по всему миру. Это в конечном итоге привело к появлению респираторных дистресс-признаков и даже смерти 2,3,4. COVID-19 был объявлен пандемией более чем в 213 странах, ожидая резкого увеличения числа подтвержденных случаев, о чем сви....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Экспрессия и очистка Taq-полимеразы
- Сконструировать плазмиду с расщепляемой гекса-гистидиновой меткой на С-конце фермента.
- Трансформируют 50 нг вектора экспрессии в штамм E. coli BL21-(DE3) в соответствии со стандартным протоколом38.
- Высевать трансформированные клетки в четыре колбы по 6 л, каждая из которых содержит 2 л бульона из среды 2YT при 37 °C, встряхивая при 170 об/мин до достижения наружного диаметра 600 0,8 или номера ячейки 6,4 x 108 .
- Индуцируют экспрессию Taq-полимеразы 0,5 мМ изопропил-β-d-тиогалактопиранозида (IPTG) и далее инкубируют при 16 °C в теч....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В последние годы были достигнуты значительные успехи в диагностическом подходе к выявлению распространенных респираторных вирусов с использованием подходов ПЦР 21,22,23,24,25. Однако, несмотря на эти достижения, мультиплексный подход, позволяющий обнаруживать несколько вирусов в одном тесте, не получил широкого распространения, особенно в платформе RT-qPCR. Эт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В связи с распространением распространенных респираторных вирусов, таких как SARS-CoV-2, грипп A/B и варианты БВРС-КоВ 12,19,20, на систему здравоохранения во всем мире ложится тяжелая экономическая нагрузка. Руководствуясь чувством ответственности за облегчение этого бремени, мы осознали необходимость быстрого, точного и доступного диагностического анализа, такого как ОТ-кПЦР, чтобы различать эти распространенные вирусы в одном.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Научно-технологическим университетом имени короля Абдаллы за счет основного финансирования и National Term Grand Challenge (NTGC) для S.M.H.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,45 мкм; m фильтрующие чашки | Thermo Scientific | 291-4545 | |
| 10X Tris-Glycine SDS беговой буфер | Novex | LC2675 | |
| 6-луночные планшеты для культивирования тканей | Corning | 353046 | |
| сульфат аммония | Fisher Scientific | A701-3 | |
| Ампициллин | Corning | 61-238-RH | |
| Катионный обмен (HiTrap SP HP) 5 мл | Cytiva | 17-1152-01 | |
| D-(+)-биотин, 98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
| DH10Bac компетентные клетки | Fisher Scientific | 10361012 | |
| Диализный мешок (Змеиная кожа 10,000 MWC) | Thermo Scientific | 68100 | |
| Дитиотреитол (DTT) | Thermo Scientific | R0862 | |
| Дистиллированная вода без Dnase/Rnase | Ambion | AM9930 | |
| dNTPs | Thermo Scientific | R0192 | |
| E. coli BL21(DE3) компетентные клетки | Invitrogen | C600003 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| элюирующий буфер | Qiagen | 19086 | |
| ESF 921 среда для культивирования клеток насекомых (среды для клеток насекомых) | Системы | экспрессии96-001-01 | |
| FBS Раствор | Gibco | A38400-01 | |
| Fugene (реагент для трансфекции) | Promega | E2311 | |
| Гентамицин | Fisher Scientific | 15750060 | |
| глицерин | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
| Имидазол | Сигма Aldrich | 56750-1Kg | |
| Influenza A (H1N1) синтетическая РНК | Twist Bioscience | 103001 | |
| Influenza A (H3N2) синтетическая РНК | Twist Bioscience | 103002 | |
| Грипп B синтетическая РНК | Twist Bioscience | 103003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
| Kanamycin | Gibco | 11815-032 | |
| LB Агар | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Бульонная среда | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Лизоцим | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
| Хлорид магния | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
| MERS-CoV синтетическая РНК | Twist Bioscience | 103015 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-луночные реакционные планшеты со штрих-кодом (0,1 мл) | Applied Biosystems | 10310855 | |
| Mini- PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1093 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 мл | Cytiva | 17-3712-06 | |
| Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 мл | Cytiva | 17-5248-02 | |
| Оптические адгезионные чехлы (совместимые с ПЦР, ингибиторы ДНК/РНКЗ/ПЦР Free | Applied Biosystems | 4311971 | |
| хлорида калия | Fisher Bioreagents | BP366-1 | |
| Праймеры и зонды | Integrated DNA Technologies, Inc. | ||
| Ингибитор протеазы Мини таблетки EDTA-Free | Thermo Scientific | A32955 | |
| Маркер белка | Ферментас | 26616 | |
| RT-qPCR машина (QuantStudio 7 Flex) | Applied Biosystems | ||
| S.O.C среда | Fisher Scientific | 15544034 | |
| SARS-CoV-+A2:C442 синтетическая РНК | Twist Bioscience | 102024 | |
| Sf9 клетки насекомых | Gibco | A35243 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
| StrepTrap XT 5 мл | Cytiva | 29401323 | |
| Тетрациклин | IBI Scientific | IB02200 | |
| Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
| Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
| Подросток 20 | Sigma Aldrich | P1379-100мл | |
| X-Gal | Invitrogen | B1690 |
Ссылки
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
- Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
- Huang, C., <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
