Микроглия считается одной из самых универсальных клеток в организме, способных к морфологической и функциональной адаптации. Их гетерогенность и многофункциональность позволяют поддерживать гомеостаз мозга, а также связаны с различными неврологическими патологиями. Здесь описана методика очищения микроглии спинного мозга.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Быстрое и эффективное обогащение микроглии спинного мозга мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Позвоночный столб определяет позвоночное животное и формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг. Правильное развитие и функционирование центральной нервной системы млекопитающих в значительной степени зависят от активности резидентных макрофагов, известных как микроглия. Микроглия проявляет гетерогенность и многофункциональность, обеспечивая различную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. В многочисленных исследованиях изучалась функция церебральной микроглии, подробно описывались методы очистки. Однако очищение микроглии от спинного мозга у мышей не имеет исчерпывающего описания. В отличие от этого, использование высокоочищенной коллагеназы, в отличие от нерафинированного экстракта, не находит отклика в тканях центральной нервной системы. В этом исследовании позвоночный столб и спинной мозг были вырезаны у 8-10-недельных мышей C57BL/6. В последующем расщеплении использовалась высокоочищенная коллагеназа, а в очистке микроглии использовался градиент плотности. Клетки подвергались окрашиванию для проточной цитометрии, оценивая жизнеспособность и чистоту с помощью окрашивания CD11b и CD45. Результаты показали среднюю жизнеспособность 80% и среднюю чистоту 95%. В заключение, манипуляции с микроглией мыши включали в себя пищеварение высокоочищенной коллагеназой с последующим градиентом плотности. Этот подход эффективно привел к созданию значительных популяций микроглии спинного мозга.
Введение
Определяющей характеристикой позвоночных является позвоночный столб или позвоночник, в котором хорда заменена последовательностью сегментированных костей, называемых позвонками, разделенных межпозвоночными дисками. Эта последовательность костного материала формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг1. У рода Rodentia позвоночник обычно образован семью шейными позвонками, тринадцатью грудными позвонками, шестью поясничными позвонками и переменным числом хвостовых позвонков 2,3. Длина спинного мозга аналогична длине позвоночника, а концевая н....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследование проводилось в соответствии с официальным мексиканским стандартом NOM-062-ZOO-1999 и руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Одобрение на проведение исследования было получено от комитетов по исследованиям, этике и биобезопасности Детской больницы Мексики (HIM/2023/006) и Комитета по исследованиям и биоэтике Больницы общего профиля Мексики имени Эдуардо Лисеаги (DI/21/501/04/62). Три мыши C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель были получены из Детской больницы Мексики, где они выращивались в изолированных условиях в вентилируемых стойках в соответствии с рекомендациями по уходу за животными и их использованию.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
С использованием тканей спинного мозга мышей ферментативное пищеварение проводили с использованием смеси, сильно обогащенной коллагеназой и термолизином. Полученная переваренная ткань проходила через фильтр 40 мкм для удаления непереваренного материала. Собранные клетки обогащали с помощью градиента плотности по Перколлу, где 90% в нижней части и 45% в верхней. Клетки, обогащенные микроглией в пределах интерфейса, затем окрашивали антителами к CD45 и CD11b и подвергали проточному цитометрическому анализу (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Было разработано множество протоколов для изучения микроглии из-за ее значимости в гомеостазе мозга. В этих методах микроглия обычно поступает из полушарий головного мозга эмбриональных или неонатальных крыс и мышей17. Ограниченное число исследований было посвящено очистке микроглии из спинного мозга взрослых мышей13,14. Эти методы включают ферментативное расщепление с использованием коллагеназы и/или папаина вместе с ДНКазой, часто в соче.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами стипендии, предоставленной Национальным советом по науке и технологиям (CONACYT) (702361). Авторы отмечают докторантуру по биологическим химическим наукам Национальной школы биологических наук Национального политехнического института.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 15 мл пробирки | для сбора Corning, США | 430790 | |
| мл микропробирки | Axygen, США | MCT-200-G | |
| 2.4G2 анти-FcR | BioLegend, США | 101302 | |
| 50 мл для сбора пробирок | Corning, США | 430829 | |
| 70% этанол | |||
| Антибиотик-антимикотик (пенициллин, стрептомицин, амфотерицин b) | Gibco, США | 15240062 | |
| антитело CD11b eFluor 450 против мышей | eBioscience, США | 48-0112 | |
| антитело CD45 PerCP против мышей | BioLegend, США | 103130 | |
| Сбалансированный раствор соли (PBS) без кальция и магния | Corning, США | 46-013-CM | |
| Сетчатый фильтр для голубых клеток 40 μ m | Corning, США | 352340 | |
| Costar 6-луночный прозрачный без обработки | Corning, США | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Цифровой подогрев Встряхивание Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, США | 88870001 | |
| Щипцы для препарирования для микрохирургии | FT от DUMONT | ||
| DNase | Roche, США | 4536282001 | |
| Dulbecco´ s Модифицированный Eagle´ s Средне-высокий уровень глюкозы (DMEM) | Merck, США | D6429 | |
| Электробритва | |||
| FACS трубка | Thermo, США 352058 | ||
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Проточный цитометр Cytoflex | Бекман Коултер | ||
| Хэнк s сбалансированный солевой раствор | Merck, США | H2387 | |
| L-глютамин | Corning, США | ||
| Liberase TM | Roche, США | 5401119001 | |
| Камера Нойбауэра Счетные камеры | Китай | 1103 | |
| Пентобарбитал | |||
| Percoll | Merck, США | центрифугирование 17089101 градиентом плотности | |
| Раствор поли-L-лизина | Merck, США | P8920 | |
| Скальпель No 25 | HERGOM, Мексика | H23 | |
| Snaplock Микроцентрифужные пробирки 2 мл | Axygen, США | 10011-680 | |
| Стереоскопический микроскоп | Velab, Мексика | HG927831 | |
| Прямые хирургические ножницы (10 см) | HERGOM, Мексика | ||
| Прямые ножницы Vannas | HERGOM, Мексика | ||
| Triton X100 | Merck, США | X100 | |
| Морилка трипановая синяя 0.4% | Merck, США | 15250-061 | |
| Вихревой смеситель | DLAB, Китай | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, США | 423102 | аминоактивное окрашивание флуоресцентным красителем |
Ссылки
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
