Ottenere criosezioni di alta qualità dell'intero occhio di coniglio

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo affidabile per ottenere criosezioni di alta qualità di occhi interi di coniglio. Descrive in dettaglio le procedure di dissezione, fissazione, inclusione e sezionamento dell'occhio di coniglio, che possono essere facilmente adattate per l'uso in qualsiasi studio che utilizza l'immunoistochimica negli occhi più grandi.

Abstract

Questo protocollo descrive come ottenere criosezioni retiniche di alta qualità in animali più grandi, come i conigli. Dopo l'enucleazione, l'occhio viene brevemente immerso nel fissativo. Quindi, la cornea e l'iride vengono rimosse e l'occhio viene lasciato per una notte per un'ulteriore fissazione a 4 °C. Dopo il fissaggio, la lente viene rimossa. L'occhio viene quindi inserito in un criomold e riempito con un mezzo di inclusione. Rimuovendo la lente, il mezzo di inclusione ha un migliore accesso al vitreo e porta a una migliore stabilità retinica. È importante sottolineare che l'occhio deve essere incubato in terreno di inclusione durante la notte per consentire la completa infiltrazione in tutto il vitreo. Dopo l'incubazione notturna, l'occhio viene congelato su ghiaccio secco e sezionato. Intere sezioni retiniche possono essere ottenute per l'uso in immunoistochimica. I protocolli di colorazione standard possono essere utilizzati per studiare la localizzazione degli antigeni all'interno del tessuto retinico. L'adesione a questo protocollo si traduce in criosezioni retiniche di alta qualità che possono essere utilizzate in qualsiasi esperimento che utilizza l'immunoistochimica.

Introduzione

La retina è composta da diversi strati di cellule specializzate all'interno dell'occhio che insieme lavorano per convertire la luce in segnali neurali. Poiché la retina svolge un ruolo fondamentale nella visione, la comprensione della sua struttura e funzione può fornire preziose informazioni su alcune delle cause più comuni di perdita della vista, come la degenerazione maculare e la retinopatia diabetica, tra le altre.

I conigli fungono da comodo modello animale nella ricerca retinica in quanto offrono numerosi vantaggi rispetto ad altri modelli. Gli occhi di coniglio sono relativamente simili nell'anatomia agli occhi umani

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della University of Southern California. Quattordici (n = 14) conigli con cintura olandese di età compresa tra 4 e 6 mesi sono stati utilizzati nello sviluppo di questo protocollo. Venivano utilizzati sia animali maschi che femmine. Tutti gli animali pesavano tra 2,0 e 2,5 kg. Tutti gli animali erano alloggiati singolarmente. Un elenco dei materiali e delle attrezzature consigliate è disponibile nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione

1. Preparazione fissativa.
   1. Prepara....

Risultati

Dopo l'elaborazione dei tessuti, un protocollo standard di immunofluorescenza può essere utilizzato per studiare un numero qualsiasi di processi biologici all'interno della retina. Le figure 3A-C illustrano immagini a fluorescenza rappresentative di una sezione retinica ottenute tramite microscopia confocale. La sezione retinica è stata immunocolorata secondo un protocollo¹² precedentemente descritto.

Le se.......

Discussione

Prima di implementare il protocollo di cui sopra, abbiamo costantemente riscontrato difficoltà con l'elaborazione tissutale degli occhi di coniglio per l'IHC. Avevamo adattato diversi protocolli dagli occhi di animali più piccoli come i topi, ma abbiamo scoperto che questi portavano a una fissazione inadeguata e difficoltà con il sezionamento dei tessuti. Ci sono diverse considerazioni importanti che consentono sezioni coerenti e di alta qualità della retina del coniglio.

Una considerazione è .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piatto di coltura da 100 mm	Corning	353025	Utilizzato per la dissezione (passaggi 1.3, 3 e 5)
Tubo da 50 ml	Genesee Scientific	28-106	Per la fissazione e la crioprotezione (passaggio 1)
Criostato	Leica	CM1850	Per criosezione (passaggio 7)
Forbici curve	Strumenti per la scienza fine	91500-09	Utilizzato per la dissezione (passaggi 1.3, 3 e 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluito 1:1.000 in tampone bloccante
Microscopio di dissezione	Zeiss	Stemi 2000-C	Utilizzato per la dissezione (passaggi 1.3, 3 e 5)
Asino anti-capra 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluito 1:1.000 in tampone bloccante
Asino anti-topo 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluito 1:1.000 in tampone bloccante
Forcipe	Fine Science Tools	91150-20	Utilizzato per la dissezione (passaggi 1.3, 3 e 5)
Coperchio per vetrini	VWR	48404-453	Per criosezione (passaggio 7)
Anti-SOX2 per capre	R& D Systems	AF2018	Diluito 1:100 in tampone di blocco
Lame per criostato monouso ad alto profilo	Leica Microsystems Inc.	14035838926	Per criosezione (fase 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Utilizzato per rimuovere l'eccesso di PBS o OCT (fasi 3 e 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluito 1:100 in tampone bloccante
OmniPur	Sucrose Millipore	167117	Utilizzato per crioprotettore (fase 1.2)
Soluzione di paraformaldeide al 20%	Microscopia elettronica Scienze	15713	Utilizzato come fissativo tissutale (diluito al 4% al passaggio 1.1)
Stampo per inclusione monouso Peel-A-Away (22x22x20 mm di profondità)	Polysciences, Inc.	18646A	Utilizzato come stampo da inclusione (fase 6)
Soluzione salina tamponata con fosfato, 1x	Corning	21-030-CV	Utilizzato nella preparazione di fissativo (fase 1.1) e crioprotettore (fase 1.2)
Lama per bisturi n. 15	Feather	08-916-5D	Utilizzato per la dissezione (fasi 1.3, 3 e 5)
Vetrini per microscopio Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Per criosezione (fase 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Utilizzato come mezzo di inclusione (fase 6)