Le interazioni delle biomolecole, come le interazioni proteina-proteina, sono la base molecolare delle funzioni biologiche. Se i mutanti con interazione nulla/alterata che mancano specificamente dell'interazione rilevante possono essere isolati, saranno di grande aiuto per comprendere le funzioni di questa interazione. Questo articolo presenta un modo efficiente per isolare i mutanti con interazione, null/impromesse.
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Articolo metodologico
Isolamento di mutanti nulli/alterati di interazione utilizzando il saggio a due ibridi di lievito
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le interazioni proteina-proteina sono uno dei processi più basilari che sono alla base dei fenomeni biologici. Uno dei modi più semplici e migliori per comprendere i ruoli e le funzioni di una specifica interazione proteina-proteina è confrontare il fenotipo del wild-type (con la relativa interazione proteina-proteina) e quelli dei mutanti che non hanno la relativa interazione. Pertanto, se tali mutanti possono essere isolati, aiuteranno a chiarire i processi biologici correlati. La procedura a due ibridi di lievito (Y2H) è un approccio potente non solo per rilevare le interazioni proteina-proteina, ma anche per isolare mutanti nulli/alterati dall'interazione. In questo articolo, viene presentato un protocollo per isolare mutanti con interazione/alterazione utilizzando la tecnologia Y2H. In primo luogo, viene costruita una libreria di mutazioni combinando la reazione a catena della polimerasi e un'efficiente tecnologia di clonazione senza soluzione di continuità, che esclude in modo efficiente il vettore vuoto dalla libreria. In secondo luogo, i mutanti con interazione nulla/alterata vengono sottoposti a screening mediante il saggio Y2H. A causa di un trucco nel vettore Y2H, i mutanti indesiderati, come quelli con mutazioni frameshift e nonsenso, vengono eliminati in modo efficiente dal processo di screening. Questa strategia è semplice e può quindi essere applicata a qualsiasi combinazione di proteine la cui interazione può essere rilevata dal sistema a due ibridi.
Introduzione
Le interazioni tra biomolecole sono la parte più basilare dei fenomeni biologici. Le interazioni proteina-proteina costituiscono una parte significativa di tali interazioni. Pertanto, l'identificazione dei partner di interazione di una proteina di interesse è fondamentale per chiarire ulteriormente la funzione della proteina/gene di interesse. Il metodo a due ibridi di lievito (Y2H) è una tecnica popolare per identificare le interazioni proteina-proteina in vivo1. In questo sistema, due proteine (X e Y) la cui interazione deve essere testata sono fuse rispettivamente al dominio di legame del DNA (DB) e al dominio di attivazione trascri....
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Protocollo
1. Costruzione della biblioteca dei mutanti
- Impostare la reazione a catena della polimerasi (PCR) (un esempio è mostrato di seguito). Generalmente, preparare 50 μL della reazione, che è divisa in dieci aliquote da 5 μL, e amplificare il frammento genico bersaglio in una macchina PCR4.
NOTA: Gli utenti devono selezionare una polimerasi appropriata per introdurre efficacemente le mutazioni. Se il frammento di DNA da amplificare è corto, è necessaria una polimerasi con un tasso di errore più elevato, come la Taq polimerasi, che manca di attività di correzione di bozze. Se il frammento di DNA da amplificare è lungo, è ....
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Risultati
Recentemente, è stato scoperto che la metà C-terminale della proteina Pol2 (Pol2-C) interagisce con Mcm10. Entrambe le proteine sono essenziali per l'inizio della replicazione del DNA e, quindi, per la crescita cellulare nel lievito Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Per aiutare a comprendere il significato biologico di questa interazione, i mutanti di Pol2-C che non hanno alcuna o diminuita interazione con Mcm10 sono s.......
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Discussione
Questo articolo descrive come isolare mutanti con interazione/alterati utilizzando il saggio Y2H. Tali mutanti sono potenti strumenti per analizzare la funzione di una proteina di interesse. Per isolare tali mutanti, i saggi rY2H sono stati sviluppati in precedenza modificando il ceppo ospiteY2H 2,3. Tuttavia, non hanno ridotto notevolmente la quantità di manodopera. Al contrario, i mutanti possono essere isolati con questo metodo senza una quantità significativa.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Y. Tanaka ha eseguito il miglioramento tecnico di Y2H. Questo lavoro è supportato dalla sovvenzione JSPS KAKENHI numero JP22K06336 e dall'Istituto per la fermentazione di Osaka.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA (8.0) | Nacalai Tesque Inc. | 14347-21 | |
| Soluzione SDS al 10% | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 313-90275 | |
| 2-mercaptoetanolo | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 135-07522 | |
| 2-propanolo | Kishida Chemical Co., Ltd. | 110-64785 | |
| 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-Gal) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 021-07852 | |
| Agar | Formedium | AGR60 | |
| Ampicillina Sodio | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 68-52-3 | |
| Tag anti-HA mAb-HRP-DirecT | Medico & Laboratori biologici Co. Ltd. | M180-7 | |
| DNA da testicoli di salmone | Merck KGaA. | D1626 | |
| Etanolo | Merck KGaA. | 9-0770-4-4L-J | |
| Carta da filtro per il sollevamento di colonie (Grado 50) | Whatman, Cytiva | 1450-090 | |
| Carta da filtro per sollevamento di colonie (No.4A) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | ||
| Carta da filtro per replicaplating (No.1) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | ||
| G-418 Solfato | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 075-05962 | |
| Acido cloridrico | Kishida Chemical Co., Ltd. | 230-37585 | |
| KCl | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 163-03545 | |
| Acetato di litio diidrato | Nacalai Tesque Inc. | 20604-22 | |
| MgSO4&toro; 7H2O | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 131-00405 | |
| Na2HPO4&toro; 12H2O | Nacalai Tesque Inc. | 10039-32-4 | |
| NaCl | Nacalai Tesque Inc. | 31319-45 | |
| NaH2PO4&toro; 2H2O | Nacalai Tesque Inc. | 31717-25 | |
| Tovagliolo di carta | AS ONE Corp. | 7-6200-02 | |
| Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico 25:24:1 | Nacalai Tesque Inc. | 25970-56 | |
| DNA plasmidico | : il progetto nazionale di biorisorse - lievito (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml) | ||
| Kit di isolamento plasmidico | Nippon Genetics Co., Ltd. | FG-90502 | |
| Polietilenglicole #4.000 | Nacalai Tesque Inc. | 11574-15 | |
| SC doppio forcellino -Leu -Trp | Formedium | DSCK172 | |
| Kit di clonazione senza saldatura (montaggio In-Fusion) | Takara Bio Inc. | #639648 | |
| Latte scremato in polvere | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 190-12865 | |
| Streptomicina solfato | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 3810-74-0 | |
| Taq polimerasi (GoTaq Green Master Mixes) | Promega Corp. | M7122 | |
| TRIS (idrossimetil) amminometano | Formedium | TRIS01 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque Inc. | 12967-45 | |
| Triptone | ThermoFisher scientifico Inc. | ||
| Tween 20 | Nacalai Tesque Inc. | 35624-15 | |
| Estratto di lievito | ThermoFisher scientific Inc. | 212750 | |
| Lievito Base di Azoto (YNB) | per medio | CYN0210 | |
| Zimoliasi 100T | Nacalai Tesque Inc. | Codice 07665-55 |
Riferimenti
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Leanna, C. A., Hannink, M. The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein inte....
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Ristampe e permessi
