تم وصف استراتيجية تحضير العينة لتصوير أجنة الزرد المبكرة داخل مشيمة سليمة باستخدام مجهر صفائح ضوئي. يحلل الاتجاهات المختلفة التي تكتسبها الأجنة داخل المشيمة في مراحل 70٪ من المشيمة والبراعم ويفصل استراتيجيات التصوير للحصول على دقة على نطاق خلوي في جميع أنحاء الجنين باستخدام نظام الورقة الضوئية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أصبح الفحص المجهري للصفائح الضوئية هو المنهجية المفضلة للتصوير الحي لأجنة أسماك الزرد على نطاقات زمنية طويلة مع الحد الأدنى من السمية الضوئية. على وجه الخصوص ، يتيح نظام الرؤية المتعددة ، الذي يسمح بتدوير العينة ، تصوير أجنة كاملة من زوايا مختلفة. ومع ذلك ، في معظم جلسات التصوير باستخدام نظام متعدد الرؤية ، يعد تركيب العينة عملية مزعجة حيث يتم تحضير العينات عادة في أنبوب بوليمر. للمساعدة في هذه العملية ، يصف هذا البروتوكول استراتيجيات التركيب الأساسية لتصوير التطور المبكر لأسماك الزرد بين 70٪ من مراحل الجسيدات المبكرة. على وجه التحديد ، توفر الدراسة إحصائيات عن المواضع المختلفة التي تتخلف عنها الأجنة في مراحل epiboly والبراعم بنسبة 70٪ داخل المشيمة. علاوة على ذلك ، فإنه يناقش العدد الأمثل للزوايا والفاصل الزمني بين الزوايا المطلوبة لتصوير أجنة أسماك الزرد الكاملة في المراحل المبكرة من التطور بحيث يمكن استخراج المعلومات على نطاق خلوي عن طريق دمج وجهات النظر المختلفة. أخيرا ، نظرا لأن الجنين يغطي مجال رؤية الكاميرا بالكامل ، وهو أمر مطلوب للحصول على دقة على نطاق خلوي ، فإن هذا البروتوكول يوضح بالتفصيل عملية استخدام معلومات الخرزة من أعلى أو أسفل الجنين لتسجيل وجهات النظر المختلفة.
المقدمة
يعد ضمان الحد الأدنى من السمية الضوئية مطلبا رئيسيا لتصوير الأجنة الحية ذات الدقة الزمانية المكانية العالية لفترات طويلة. على مدى العقد الماضي ، أصبح الفحص المجهري للورقة الضوئية هو المنهجية المفضلة لتلبية هذا المطلب1،2،3،4،5،6،7. باختصار ، في هذه التقنية التي تم استخدامها لأول مرة في عام 2004 لالتقاط العمليات التنموية8 ، تمر لوحان رفيعان محاذيان من الليزر عبر الجنين من نهايات متعا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على صيانة أسماك الزرد والإجراءات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لأخلاقيات ، عبر المرجع TIFR / IAEC / 2023-1 و TIFR / IAEC / 2023-5. تم حقن الأجنة التي تم الحصول عليها عن طريق تهجين الأسماك متغايرة الزيجوت التي تعبر عن Tg (actb2: GFP-Hsa.UTRN) 19 ب H2A-mCherry mRNA (30 pg) في مرحلة الخلية الواحدة. H2A-mCherry تم تصنيع mRNA باستخدام pCS2 + H2A-mCherry البلازميد (هدية من مختبر Oates ، EPFL) عن طريق النسخ في المختبر. تم تصوير الأجنة التي تعبر عن كلتا العلامتين ، المشار إليها باسم Utr-GFP و H2A-mCherry ، على التوالي ، في بقية البروتوكول ، في مرحلتي 70٪ من epi....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يعد توجيه العينة بطريقة دقيقة جزءا حيويا من الاستخدام الفعال لإعداد الفحص المجهري. ومع ذلك ، غالبا ما يكون توجيه العينات يدويا غير ممكن عند استخدام نظام ورقة ضوئية متعددة الرؤوس ، نظرا لمتطلبات تحضير العينات في أنبوب. لذلك ، للتحقق مما إذا كانت هناك أوضاع نمطية تتخذها الأجنة داخل المشيمة ، تم تصوير أجنة الزرد بنسبة 70٪ (حوالي 7 ساعات بعد الإخصاب (HPF)) ، حيث كان التصوير بفاصل زمني من المعدة إلى مراحل الجسيدات المبكرة هو محور هذه الدراسة. عندما تم تحضير العينات مباشرة قبل التصوير بنسبة 70٪ ، لم تظهر الأجنة أي اتجاه محدد ي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد وضع الجنين في الاتجاه الصحيح لتصوير منطقة الاهتمام أحد خطوات تحديد المعدل التي غالبا ما تؤدي إلى فشل جلسة الفحص المجهري للمستخدم. هذا أكثر من ذلك في مجهر الألواح الضوئية متعدد الرؤوس حيث يكون التلاعب اليدوي بالاتجاه صعبا حيث يتم تضمين العينات داخل أنبوب. للمساعدة في هذه العملية ، تشير هذه الدراسة إلى إحصائيات المواضع المختلفة التي يشغل جنين سمكة الزرد ما بين 70٪ من مراحل الجسيدات المبكرة داخل المشيمة عندما يتم الاحتفاظ بأنبوب البوليمر مع الأجنة في وضع مستقيم في أنبوب الطرد المركزي ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
نعرب عن تقديرنا للدكتور كاليداس كوهالي وفريقه لصيانة منشأة الأسماك و KV Boby لصيانة مجهر الألواح الضوئية. تعترف SRN بالدعم المالي المقدم من وزارة الطاقة الذرية (DAE) ، حكومة الهند (رقم تعريف المشروع. RTI4003 ، DAE OM رقم 1303/2/2019 / R\&D-II / DAE / 2079 بتاريخ 11.02.2020) ، برنامج مجموعة شركاء جمعية ماكس بلانك (M.PG. A MOZG0010) ومنحة أبحاث بدء التشغيل لمجلس أبحاث العلوم والهندسية (SRG / 2023 / 001716).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agarose ، درجة حرارة منخفضة للتبلور | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| هيدرات كلوريد الكالسيوم | Sigma-Aldrich | 12022 | |
| إصدار FIJI | : ImageJ 1.54f | ||
| حبات اللاتكس ، البوليسترين المعدل بالكربوكسيل ، أحمر فلورسنت ، 0.5 & mu ؛ م متوسط حجم الجسيمات ، التعليق المائي | Sigma-Aldrich | L3280 | |
| كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدرات | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 طقم النسخ | ThermoFischer Scientific | AM1340 | من أجل النقل في المختبر ل H2A-mCherry البلازميد |
| البوتاسيوم Chhloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| PTFE التغطيه AWG 15L - 1.58 مم ID × 0.15 مم جدار +/- 0.05 | ابتكارات Adtech في البلاستيك الفلوري | STW15 | أنابيب PTFE |
| كلوريد الصوديوم | سيجما-ألدريتش | S3014 | |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة | سيجما ألدريتش | 71640 | |
| منظف بالموجات فوق الصوتية | لابمان | LMUC3 | الموجات فوق الصوتية |
| زايس لايت شيت 7 نظام | زايس |
المراجع
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
