Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Light sheet microscopie is de methodologie bij uitstek geworden voor live beeldvorming van zebravisembryo's over lange tijdschalen met minimale fototoxiciteit. Met name een multiview-systeem, dat rotatie van monsters mogelijk maakt, maakt beeldvorming van hele embryo's vanuit verschillende hoeken mogelijk. In de meeste beeldvormingssessies met een multiview-systeem is het monteren van monsters echter een lastig proces, omdat monsters meestal in een polymeerbuis worden voorbereid. Om hierbij te helpen, beschrijft dit protocol basismontagestrategieën voor het in beeld brengen van de vroege ontwikkeling van zebravissen tussen de 70% epiboly en vroege somietstadia. In het bijzonder biedt de studie statistieken over de verschillende posities die de embryo's standaard bereiken in de 70% epiboly- en knopstadia in het chorion. Verder wordt het optimale aantal hoeken en het interval tussen de hoeken besproken dat nodig is voor het afbeelden van hele zebravisembryo's in de vroege stadia van ontwikkeling, zodat informatie op cellulaire schaal kan worden geëxtraheerd door de verschillende weergaven samen te voegen. Ten slotte, aangezien het embryo het hele gezichtsveld van de camera beslaat, wat nodig is om een resolutie op cellulaire schaal te verkrijgen, beschrijft dit protocol het proces van het gebruik van kraalinformatie van boven of onder het embryo voor de registratie van de verschillende weergaven.
Inleiding
Het garanderen van minimale fototoxiciteit is een belangrijke vereiste voor het afbeelden van levende embryo's met een hoge spatiotemporele resolutie gedurende lange perioden. In het afgelopen decennium is lichte plaatmicroscopie de methodologie bij uitstek geworden om aan deze eis te voldoen 1,2,3,4,5,6,7. In het kort, in deze techniek die voor het eerst werd gebruikt in 2004 om ontwikkelingsprocessen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De onderhouds- en experimentele procedures voor zebravissen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierethiek, zie referentie TIFR/IAEC/2023-1 en TIFR/IAEC/2023-5. Embryo's verkregen door het kruisen van heterozygote vissen die Tg (actb2:GFP-Hsa.UTRN)19 tot expressie brengen, werden geïnjecteerd met H2A-mCherry mRNA (30 pg) in het eencellige stadium. H2A-mCherry mRNA werd gesynthetiseerd met behulp van het pCS2+ H2A-mCherry plasmide (een geschenk van het Oates lab, EPFL) door middel van in vitro transcriptie. Embryo's die beide markers tot ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het op een nauwkeurige manier oriënteren van het monster is een essentieel onderdeel van het efficiënt gebruik van een microscopie-opstelling. Het handmatig oriënteren van monsters is echter vaak niet mogelijk bij gebruik van een multiview lichtplaatsysteem, gezien de vereiste om de monsters in een buis voor te bereiden. Daarom, om te controleren of er stereotiepe posities zijn die embryo's innemen in het chorion, werden zebravisembryo's afgebeeld op 70% epiboly (ongeveer 7 uur na de bev.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het positioneren van een embryo in de juiste richting om het interessegebied in beeld te brengen, is een van de snelheidsbeperkende stappen die vaak resulteert in een mislukte microscopiesessie voor een gebruiker. Dit is meer het geval bij een multiview lichtplaatmicroscoop waar handmatige manipulatie van de oriëntatie moeilijk is omdat de monsters in een buis zijn ingebed. Om bij dit proces te helpen, rapporteert deze studie de statistieken van verschillende posities waarin een zebravis.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdig belang.
Dankbetuigingen
We danken Dr. Kalidas Kohale en zijn team voor het onderhoud van de visfaciliteit en KV Boby voor het onderhoud van de lichtplaatmicroscoop. SRN erkent financiële steun van het Department of Atomic Energy (DAE), Govt. of India (Project Identification no. RTI4003, DAE OM no. 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 d.d. 11.02.2020), het Max Planck Society Partner Group-programma (M.PG. A MOZG0010) en de Science and Engineering Research Board Start-up Research Grant (SRG/2023/001716).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose, lage geleertemperatuur | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Calcium Chloride dihydraat | Sigma-Aldrich | 12022 | |
| FIJI | Versie: ImageJ 1.54f | ||
| Latexkralen, carboxylaat-gemodificeerd polystyreen, fluorescent rood, 0.5 μm gemiddelde deeltjesgrootte, waterige suspensie | Sigma-Aldrich | L3280 | |
| Magnesiumsulfaat heptahydraat | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcriptiekit | ThermoFischer Scientific | AM1340 | Voor in vitro transcriptie van H2A-mCherry plasmid |
| Kaliumchloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Kaliumfosfaat monobasisch | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| PTFE-huls AWG 15L - 1,58 mm ID x 0,15 mm Wand +/-0,05 | Adtech Innovations in Fluoroplastics | STW15 | PTFE-buizen |
| Natriumchloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Natriumfosfaat dibasisch | Sigma-Aldrich | 71640 | |
| Ultrasoonreiniger | Labman | LMUC3 | Ultrasoonapparaat |
| Zeiss LightSheet 7 Systeem | Zeiss |
Referenties
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
